王景慶 游松 張微

（沈陽藥科大學(xué) 遼寧 沈陽 110016）

動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥品特別是疫苗的生產(chǎn)中，通過生物反應(yīng)器對(duì)Vero細(xì)胞和病毒進(jìn)行大規(guī)模、高密度培養(yǎng)，并通過此方式進(jìn)一步生產(chǎn)狂犬、乙腦等疫苗在國內(nèi)已經(jīng)為主流技術(shù)[1]。Vero細(xì)胞是一種典型的貼壁依賴性動(dòng)物細(xì)胞，其生長(zhǎng)、擴(kuò)增繁殖需要有足夠大的表面積，球狀微載體懸浮培養(yǎng)這一技術(shù)平臺(tái)很好的解決了以上的限制因素。因?yàn)楹芏喾N類的病毒（如狂犬病毒等）都是通過細(xì)胞表面吸附這一途徑，進(jìn)入到細(xì)胞中，然后利用細(xì)胞中的有效物質(zhì)來繁殖。所以Vero細(xì)胞的大規(guī)模、高密度培養(yǎng)是生產(chǎn)過程中相當(dāng)關(guān)鍵的一個(gè)步驟。本文重點(diǎn)是通過優(yōu)化并更加合理的設(shè)置生物反應(yīng)器的運(yùn)行參數(shù)，以達(dá)到更良好的生產(chǎn)條件。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)情況表

表2 細(xì)胞培養(yǎng)情況表

1.材料與方法

1.1 主要材料

138-143代Vero細(xì)胞（美國ATCC），M199和DME培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加5% 新生牛血清，微載體為Cytodex1[2，3]。

1.2 主要儀器

生物反應(yīng)器為美國EPPENDORF公司CelliGen510型生物反應(yīng)器（40L），倒置顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Vero細(xì)胞的復(fù)蘇準(zhǔn)備：取第138代細(xì)胞，37℃乙醇浴融化；接種細(xì)胞到含有10%牛血清培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中，37℃培養(yǎng)；6～24小時(shí)后更換10%牛血清培養(yǎng)液；細(xì)胞代次為139代。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)：37℃、10%牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，三次擴(kuò)增達(dá)到可以進(jìn)行生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量。

1.3.3 微載體的準(zhǔn)備：按照15～20g/L生物反應(yīng)器體積的比例稱量微載體，用PBS溶液浸泡并121℃濕熱滅菌60分鐘；滅菌后的微載體用培養(yǎng)液進(jìn)行平衡，室溫浸泡72小時(shí)后使用。

1.3.4 生物反應(yīng)器的準(zhǔn)備：正確安裝培養(yǎng)液流加管、攪拌漿、沉降柱等配件；向生物反應(yīng)器內(nèi)加入注射用水，密封生物反應(yīng)器并檢測(cè)氣密性。氣密性合格后在位濕熱滅菌121℃40分鐘；校正DO電極。

1.3.5 生物反應(yīng)器細(xì)胞接種：觀察轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)第142代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，匯合率達(dá)到100%時(shí)用0.25%胰酶消化上述細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；收集的細(xì)胞懸液混合于微載體容器中，再無菌連接到生物反應(yīng)器，正壓將細(xì)胞接種到生物反應(yīng)器內(nèi)。

1.3.6 生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)與正常生產(chǎn)的參數(shù)設(shè)置：40L反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)：溫度37℃、轉(zhuǎn)數(shù)38rpm、溶氧值（DO）15、pH值7.4、通氣量0.1～8.0。

2.結(jié)果

2.1 生物反應(yīng)器不同轉(zhuǎn)數(shù)的持續(xù)培養(yǎng)對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，見表1。

2.2 生物反應(yīng)器非正常轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，見表2。

3.討論

微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞的生產(chǎn)工藝已應(yīng)用到很多疫苗生產(chǎn)企業(yè)，這個(gè)技術(shù)平臺(tái)通過微載體對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行高密度的培養(yǎng)可以達(dá)到很好的規(guī)模效應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)所用的是美國EPPENDORF公司生產(chǎn)的CelliGen510 型生物反應(yīng)器，其是最新一代的生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，以往生產(chǎn)的生物反應(yīng)器體積多為5L、7.5L、30L，本次實(shí)驗(yàn)所用CelliGen510 型生物反應(yīng)器體積更大（40L），所以有著更好的經(jīng)濟(jì)效益。

通過生物反應(yīng)器進(jìn)行對(duì)Vero細(xì)胞和病毒進(jìn)行大規(guī)模、高密度培養(yǎng)并通過此方式進(jìn)一步生產(chǎn)相關(guān)疫苗，這一工藝雖然已應(yīng)用到生產(chǎn)中去，但其整個(gè)工藝過程時(shí)間比較長(zhǎng)（狂犬疫苗生物反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行過程達(dá)到20天，出血熱疫苗等品種更長(zhǎng)），設(shè)備出現(xiàn)異常的概率相對(duì)較高。特別是生物反應(yīng)器的攪拌系統(tǒng)，長(zhǎng)時(shí)間的工作容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)速波動(dòng)等情況。高轉(zhuǎn)數(shù)的發(fā)生會(huì)提高系統(tǒng)的剪切力從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷（動(dòng)物細(xì)胞易受剪切力損傷），而低轉(zhuǎn)數(shù)會(huì)引起微載體沉積并使細(xì)胞無法生長(zhǎng)，但細(xì)胞本身也有一定的耐受力，轉(zhuǎn)數(shù)在一定范圍內(nèi)波動(dòng)所引起的微小傷害可以恢復(fù)，且對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過程沒有太大的影響。通過數(shù)據(jù)可知，一定范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)細(xì)胞影響不是很大，但超過一定區(qū)間會(huì)有影響。短時(shí)間內(nèi)的轉(zhuǎn)數(shù)波動(dòng)在一定范圍內(nèi)細(xì)胞有一定的耐受力，但超過一定的范圍會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的傷害。

本次實(shí)驗(yàn)中考察了生產(chǎn)過程中的轉(zhuǎn)速波動(dòng)對(duì)微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞的影響，對(duì)于提高生產(chǎn)效率有十分重要的借鑒作用。

[1]查力，高軍，侯劍英，白珠穆，袁德明，楊俊偉，等.生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)制備人用狂犬病疫苗中國生物制品學(xué)雜志，2006,19(3):288-290.

[2]CytidexTM 1: B eaded m icrocarriers for cell cu ltu re, Pharm acia FineChem icals, Technical Book let Seriw s,Uppsala, Sw eden 1978.

[3]VanW ezelAL. M icricarrier cu ltu res of an im al cells.In:K ruse PF,PatterssonMK, ed s. Tissu e cu ltu re: metbods and app lications. NewYork: A cadem ic Press,1973.372-377.