吳雪蓮，屈晨雪，戴菊華，李麗萍，龔巖，陸遙，袁家穎，倪蓮芳

(北京大學(xué)第一醫(yī)院a.檢驗科,b.老年科，北京 100034)

·臨床檢驗技術(shù)研究·

稀釋凝血酶時間試驗檢測血漿達比加群水平的性能評價

吳雪蓮a，屈晨雪a，戴菊華a，李麗萍a，龔巖a，陸遙a，袁家穎a，倪蓮芳b

(北京大學(xué)第一醫(yī)院a.檢驗科,b.老年科，北京 100034)

目的評價稀釋凝血酶時間(dTT)試驗用于檢測血漿達比加群水平的性能，觀察其是否能滿足臨床實驗室檢測需求。方法參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)EP15-A2、EP6-A、EP7-A及C-24文件對dTT試驗檢測血漿達比加群水平的精密度、正確度、分析測量范圍、攜帶污染率、抗生物干擾進行評價，并觀察血漿樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果dTT試驗檢測血漿達比加群水平的日內(nèi)、日間變異系數(shù)(CV)均符合廠家聲明的CV；3個水平美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)能力驗證計劃物質(zhì)達比加群濃度與靶值的相對偏差均<10%；在30.92～249.13 ng/mL范圍內(nèi)dTT試驗檢測達比加群水平結(jié)果呈線性分布；攜帶污染率為-0.84%；Hb≤3 g/L、三酰甘油≤873 mg/dL、肝素≤2.2 IU/mL、FDP≤29 mg/L對dTT試驗檢測達比加群水平無影響；血漿樣品在常溫保存不宜超過4 h，4 ℃不宜超過4 d，-20 ℃不宜超過1個月，-80 ℃條件下可以存放半年。結(jié)論dTT試驗檢測達比加群濃度的精密度、正確度、分析測量范圍、攜帶污染率、抗生物干擾能力基本符合實驗室要求。血漿樣品穩(wěn)定性滿足臨床要求。

達比加群；抗凝監(jiān)測；稀釋凝血酶時間；性能驗證

達比加群是一種直接口服抗凝藥(direct oral anticoagulants，DOACs)，屬于凝血酶抑制劑。服用達比加群的患者無需常規(guī)監(jiān)測凝血功能。近年來的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，用藥期間出現(xiàn)血栓形成、大出血、急診手術(shù)、肝/腎功能不全等情況時需要監(jiān)測達比加群抗凝效果。因此，上述患者常規(guī)檢測血液達比加群濃度尤為重要。稀釋凝血酶時間(diluted thrombin time，dTT)是可用常規(guī)凝血儀檢測達比加群濃度的試驗。為保證該項目結(jié)果的準(zhǔn)確性[1]，本研究擬評價dTT試驗檢測血漿達比加群濃度的精密度、正確度、分析測量范圍、攜帶污染率、抗生物干擾情況等主要性能指標(biāo)，并觀察穩(wěn)定性，為臨床實際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2016年1至9月北京大學(xué)第一醫(yī)院門診或住院服用達比加群治療>4 d、年齡≥18 歲的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：同時應(yīng)用其他靜脈或直接口服抗凝藥；影響凝血功能的疾病史；妊娠。本研究經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集與處理 分別采集患者服藥前(谷濃度)和服藥后2～4 h(峰濃度)[2]靜脈血2.7 mL，用109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，2 000×g離心10 min，1 h內(nèi)分離血漿。

1.3主要儀器與試劑 ACL-TOP 700全自動血凝儀(美國IL公司)；XS-800i血液分析儀(日本Sysmex公司)； 7600-110 全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)；B320A離心機(北京白洋醫(yī)療器械公司)；SSW-420-2S型電熱恒溫水槽(上海博遠(yuǎn)實業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠)；Forma905超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司)。

dTT試驗試劑盒、定標(biāo)品和質(zhì)控品(美國IL公司)；干擾試劑盒(日本Sysmex公司)；力文(無錫華瑞制藥公司)；肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥公司)；枸櫞酸鈉抗凝管(美國BD公司)；2015年能力驗證計劃樣品由美國病理學(xué)家協(xié)會(College of American Pathologists，CAP)提供。

1.4方法

1.4.2正確度 用dTT試驗測定2015年3個不同水平的能力驗證計劃樣品的達比加群濃度各1次，與靶值比較并計算相對偏差(%)。相對偏差(%)=[(測定值-靶值)/靶值]×100%，判定標(biāo)準(zhǔn)為相對偏差<10%。

1.4.3分析測量范圍 根據(jù)CLSI EP6-A文件[4]對線性范圍評價的要求，選取高濃度(以H表示)和低濃度(以L表示)達比加群血漿樣品各一份，高濃度及低濃度均接近該系統(tǒng)分析測量范圍的高限與低限。低濃度樣品為1號，高濃度樣品為5號，二者3∶1混合為2號，等份混合為3號，1∶3混合為4號，制成5個濃度梯度的樣品，每個濃度樣品隨機排列并重復(fù)測定2次，以各濃度實測均值和理論值進行直線回歸分析，得出線性方程Y=bX+a，以相關(guān)系數(shù)(r)≥0.95為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.4攜帶污染率 根據(jù)CLSI C-24文件的要求[5]，選取高濃度和低濃度達比加群血漿樣品各1份，先連續(xù)測定高濃度樣品3次(H1、H2、H3)，后立即檢測低濃度樣品3次(L1、L2、L3)，計算攜帶污染率(%)。攜帶污染率(%)=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。

1.4.5抗生物干擾 (1)溶血干擾物(Hb=30 g/L)：紅細(xì)胞于-40 ℃冰凍8 h后再復(fù)融為血紅蛋白液，檢測該血紅蛋白液濃度(如果血紅蛋白液濃度超出檢測上限，則稀釋后再測)。(2)黃疸干擾物(總膽紅素濃度為5 640 μmol/L，即330 mg/dL)：取膽紅素干擾物，按說明書1/2溶解液的量配制，測定總膽紅素濃度為5 640 μmol/L，結(jié)果以總膽紅素濃度表示。(3)乳糜干擾物(三酰甘油濃度為98 mmol/L，即8 730 mg/dL)：因乳糜液干擾物濃度高，超出生化分析儀可報告范圍，故將乳糜液干擾物的配制調(diào)整為乳糜樣品配制，終濃度為9.8 mmol/L。制備方法如下：在494 μL待測血漿中加入力文6 μL，測定三酰甘油濃度為9.8 mmol/L，結(jié)果以三酰甘油濃度表示。(4)肝素干擾物(肝素濃度22 IU/mL)：用移液器取肝素鈉注射液1 μL加入284 μL待測血漿中，結(jié)果以肝素濃度表示。(5)FDP干擾物：選取高濃度FDP臨床標(biāo)本，用ACL-TOP 700全自動凝血儀檢測FDP濃度。

根據(jù)CLSI EP7-A文件對干擾實驗的相關(guān)要求[6]，向血漿中加入干擾物來評價該項目的抗生物干擾能力。干擾物體積與原樣品體積比例為1∶9。除乳糜樣品外，其他干擾樣品(溶血、黃疸、肝素、FDP)加樣量均為50 μL干擾物+450 μL待測血漿，形成溶血、黃疸、乳糜、肝素、FDP干擾樣品，測定達比加群濃度。根據(jù)加入干擾物質(zhì)前后的測定值計算相對偏差，相對偏差=[(加入干擾物后血漿測定值-未加干擾物血漿測定值)/未加干擾物血漿測定值]×100%，要求相對偏差<10%。

1.4.6樣品穩(wěn)定性 選擇6份患者血漿，將每份血漿樣品分裝成8管，每管100 μL，以即刻檢測的血漿達比加群水平作為對照值(0 h)。前3份患者的7管血漿分別室溫保存 4、8、24 h，冷藏(2～8 ℃)保存24 h、48 h、4 d、7 d，低溫冷凍(-20 ℃)保存7 d、1個月，后3份患者的7管血漿樣品分別低溫冷凍(-20 ℃) 3、6個月，超低溫冷凍(-80 ℃) 3個月、6個月、9個月、1年。測定達比加群濃度，與0 h對照值比較并計算偏差，以相對偏差<10%作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1精密度 用dTT試驗檢測2個不同濃度達比加群血漿樣品日內(nèi)CV分別為3.59%、2.51%；日間CV分別為2.29%及3.97%，見表1。廠家聲明的日內(nèi)CV為2.8%。水平2日內(nèi)CV為2.51%，小于廠家聲明，驗證合格；水平1為3.59%，大于廠家聲明，驗證值計算結(jié)果為3.66%，驗證合格。

低、高濃度質(zhì)控品廠家聲明的日間CV分別為3.6%及4.1%，2個水平的日間CV均小于廠家聲明，驗證合格。

2.2正確度 3個不同水平能力驗證計劃樣品達比加群的實測值與理論值相對偏差均<10%，見表2。

2.3分析測量范圍 試劑說明書提供的分析測量范圍為20～2 000 ng/mL。高濃度(249.13 ng/mL)及低濃度(30.92 ng/mL)血漿各1份按不同比例混合后，檢測達比加群濃度，見表3，最佳擬合方程為二元一次方程式，Y=0.98X+5.15，r=0.98，P<0.05，在30.92～249.13 ng/mL范圍內(nèi)呈線性分布。

表1 dTT試驗檢測達比加群的日內(nèi)及日間精密度

表2 dTT試驗檢測達比加群的正確度

表3 dTT試驗檢測達比加群的的分析測量范圍

2.4攜帶污染率 高濃度樣品H1、H2、H3連續(xù)3次檢測結(jié)果分別為249.13、253.4、277.75 ng/mL，低濃度樣品L1、L2、L3連續(xù)3次檢測結(jié)果分別為30.92、32.44、32.97 ng/ mL。攜帶污染率(%)計算結(jié)果為-0.84%，儀器清潔能力較好。

2.5抗生物干擾 當(dāng)溶血(血紅蛋白濃度=3 g/L)干擾存在時，相對偏差均<5%；當(dāng)黃疸(總膽紅素濃度=33 mg/dL)干擾存在時， 樣品易受影響，低濃度達比加群樣品受影響較?。划?dāng)乳糜(三酰甘油濃度=873 mg/dL)干擾存在時，偏差均<5%；當(dāng)肝素(肝素濃度=2.2 IU/L)干擾存在時，偏差均<5%；當(dāng)FDP(FDP濃度=29 mg/L)干擾存在時，偏差均<10%。dTT試驗可抗溶血(3 g/L)、乳糜(三酰甘油690 mg/dL)、肝素(2.2 IU/L)、FDP(29 mg/L)干擾，而對于黃疸(33 mg/dL)干擾，則與樣品達比加群濃度高低有關(guān)，高濃度達比加群樣品易受影響。見表4。

表4 dTT試驗檢測達比加群(ng/mL)的抗生物干擾試驗結(jié)果

2.6標(biāo)本穩(wěn)定性 見圖1。檢測達比加群的血漿樣品，常溫放置不宜超過4 h，4 ℃不宜超過4 d，-20 ℃不宜超過1個月；-80 ℃條件下目前僅有6個月的數(shù)據(jù)，穩(wěn)定性良好。

注，A，室溫保存； B，-4 ℃保存；C，-20 ℃保存； D，-80 ℃保存。

圖1 不同保存條件下達比加群待測血漿樣品的穩(wěn)定性

3 討論

臨床研究證實，達比加群比華法林明顯降低心房顫動(房顫)患者腦卒中風(fēng)險，同時降低患者大出血風(fēng)險[7]，因此其運用越來越廣泛。達比加群的抗凝監(jiān)測包括篩查和定量檢測。篩查試驗主要有活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶時間(TT)試驗，定量試驗主要有dTT試驗、Hemoclot 凝血酶抑制試驗(Hemoclot thrombin inhibitor，HTI)、Ecarin凝固時間(Ecarin clot time，ECT)、Ecarin發(fā)色試驗(Ecarin chromogenic assay，ECA)，其中，dTT試驗可以在很多實驗室用常規(guī)血凝儀檢測，方便、快捷。故本研究評價dTT試驗的性能指標(biāo)，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

dTT檢測原理為：待測血漿用健康人混合血漿(試劑盒提供)稀釋，將固定濃度的牛凝血酶加入已被稀釋的患者血漿樣品，激活凝血瀑布，血漿凝固，凝血儀測定并記錄凝固時間。如血漿樣品含有達比加群，因其抑制外源加入的凝血酶活性，會導(dǎo)致凝固時間延長，將測定的凝固時間與事先繪制好的達比加群濃度與凝固時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即得出達比加群濃度(單位為ng/mL)。據(jù)文獻報道，該方法與達比加群檢測的參考方法——高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)相關(guān)性好(r=0.979 9)[8]。本試劑盒中采用的校準(zhǔn)品溯源至參考方法HPLC-MS/MS。

本研究結(jié)果顯示，該方法日內(nèi)、日間CV均符合廠家聲明的CV，表明該項目具有較好的重復(fù)性。2015年共有21個實驗室參加了CAP達比加群濃度檢測能力驗證計劃，其中，15個實驗室采用dTT試驗檢測達比加群濃度，不同實驗室dTT試驗的室間CV為7.7%～10.3%，故本研究將相對偏差<10%作為判定標(biāo)準(zhǔn)。本研究檢測3個不同濃度水平能力驗證計劃物質(zhì)的相對偏差均<10%，表明該方法具有較好的正確度。進一步進行分析測量范圍驗證即線性范圍驗證，結(jié)果顯示實測值與理論值的相關(guān)系數(shù)為0.98，表明在30.92～249.13 ng/mL范圍內(nèi)存在線性關(guān)系。攜帶污染率為-0.84%，表明該儀器檢測此項目時高值標(biāo)本對低值標(biāo)本影響小，儀器清洗功能較好。

依據(jù)說明書抗生物干擾能力(血紅蛋白≤300 mg/dL、三酰甘油≤873 mg/dL、膽紅素≤33 mg/dL、肝素≤2.2 IU/mL)配制濃度接近的相應(yīng)干擾樣品，在Hb≤300 mg/dL、三酰甘油≤873 mg/dL時，偏差均<5%，表明一般溶血、乳糜血對達比加群檢測干擾較小，可以滿足臨床需要。對于黃疸干擾，達比加群濃度較低的樣品(54.25～59.22 ng/mL)受黃疸影響較小(均<10%)，而濃度較高的樣品(81.15 ng/mL)受黃疸影響較大(偏差=-25.05%)。但由于樣品數(shù)量不足，本研究并沒有重復(fù)檢測高濃度樣品對抗黃疸干擾的能力。

普通肝素(unfractionated heparin，UFH)主要通過增加抗凝血酶的能力來滅活凝血因子Ⅱa、Ⅹa、Ⅸa、ⅩⅠa、ⅩⅡa[9]。服用達比加群患者血漿中若存在肝素，肝素與血漿樣品中的抗凝血酶結(jié)合，滅活外源性的凝血酶試劑，使凝固時間延長。延長的凝固時間對應(yīng)校準(zhǔn)曲線上更高的“達比加群濃度”，即肝素會使達比加群檢測結(jié)果“假性升高”。為此，本研究評價dTT試驗的抗UFH干擾能力。低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)由于分子量較小，滅活Ⅱa因子的能力明顯降低，抑制Ⅹa因子和Ⅱa因子的比值約為(2～4)∶1[7]，理論上，LMWH對dTT檢測的干擾應(yīng)小于UFH，故本研究沒有設(shè)計LMWH對dTT的干擾試驗。結(jié)果表明肝素濃度<2.2 IU/mL對dTT試驗無顯著影響。此外，本研究還評價了FDP對dTT試驗的影響。由于FDP中碎片X(X′)、E(E′)、 D(D′)的結(jié)構(gòu)與纖維蛋白原或纖維蛋白單體的結(jié)構(gòu)相似，故可與纖維蛋白原競爭凝血酶而使血液凝固時間延長，或與纖維蛋白單體形成復(fù)合物，阻止纖維蛋白單體的交聯(lián)，使凝固時間延長[10-11]。當(dāng)FDP≥50 mg/L時會干擾TT檢測[12]。dTT試驗的檢測原理如上所述是基于TT的檢測，故本研究增加了FDP對dTT試驗的影響，采用臨床高濃度FDP樣品(290 mg/L)評價FDP對dTT的影響，結(jié)果顯示，相對偏差分別為-7.94%、-4.20%、3.95%，F(xiàn)DP<29 mg/L時對dTT試驗無顯著影響。后續(xù)可繼續(xù)尋找臨床高FDP樣品，評價dTT抗FDP干擾能力。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果提示，待測達比加群的血漿樣品在常溫放置不宜超過4 h，4 ℃不宜超過4 d，-20 ℃不宜超過1個月，-80 ℃可以存放半年。

綜上，dTT試驗檢測達比加群的各項性能指標(biāo)基本滿足實驗室要求，血漿樣品穩(wěn)定性結(jié)果為臨床送檢標(biāo)本要求提供了實驗室依據(jù)。

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PerformanceverificationofdilutedthrombintimeassayfordetectingDabigatranlevelinplasma

WUXue-liana，QUChen-xuea，DAIJu-huaa，LILi-pinga，GONGYana,LUYaoa,YUANJia-yinga,NILian-fangb

(a.DepartmentofClinicalLaboratory,b.DepartmentofGeriatrics,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China)

ObjectiveTo evaluate the performance of diluted thrombin time (dTT) assay for detecting Dabigatran levels and observe whether this assay may meet the requirements of clinical laboratory.MethodsAccording to EP15-A2, EP6-A, EP7-A and C-24 documents of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), the precision, trueness, analytical measurement range, carryover rate and anti-biological interference of dTT assay were evaluated and the stability of specimen for dTT assay was observed.ResultsBoth the within-day and between-day coefficient of variation (CV) of dTT assay for detecting Dabigatran levels were consistent with manufacturer′s statedCV. Compared with target values of Dabigatran, the relative bias of 3 levels of proficiency test materials from College of American Pathologists (CAP) were less than 10%. The results meet linear verification when Dabigatran concentration was between 30.92 and 249.13 ng/mL. The carryover rate was -0.84%. There was no interference for Dabigatran levels by dTT assay for detecting Dabigatran when Hb≤3 g/L, triglyceride≤873 mg/dL, heparin≤2.2 IU/mL and FDP≤29 mg/L. The results of stability showed that plasma specimens for dTT could not be stored at room temperature more than 4 hours, at 4 ℃ more than 4 days, at -20 ℃ exceed 1 month, while at -80℃ the plasma specimens could be stored at least 6 months for dTT assay.ConclusionThe precision, trueness, analytical measurement range, carryover rate, anti-biological interference of dTT assay may meet the requirement of clinical laboratory. The stability of the specimen can fulfill the clinical requirements.

Dabigatran；anticoagulation monitoring；diluted thrombin time； performance verification

10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.07

吳雪蓮，1989年生，女，技師，碩士，研究方向為血液病的篩查與診斷。

屈晨雪，副主任醫(yī)師，博士，E-mail:qucx2012@163.com。

R446.11

A

2017-10-24)

王海燕)