黃夢詩，楊倩倩，張艷，谷陽光，趙俊，張旭志，丁東生，曲克明*

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院， 上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室， 青島 266071； 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所， 廣州 510300)

海水中副溶血弧菌的可視化LAMP快速檢測方法

黃夢詩1,2，楊倩倩1,2，張艷2，谷陽光3，趙俊2，張旭志2，丁東生2，曲克明2*

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院， 上海201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室， 青島266071；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所， 廣州510300)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是沿海地區(qū)常見的食源性致病菌之一，評估其在海洋環(huán)境中的存在狀況對漁業(yè)生產(chǎn)與環(huán)境監(jiān)測具有重要意義，但傳統(tǒng)方法操作復(fù)雜或者設(shè)備繁重，往往不適合于現(xiàn)場快速檢測。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，以tlh基因作為其標(biāo)識基因，建立了海水中該菌的可視化快速檢測方法。采用過濾法收集海水中的細(xì)菌，以細(xì)菌懸液為擴(kuò)增模板，直接加入LAMP反應(yīng)液中(免DNA提取與純化步驟)，以羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphtholblue,HNB)為擴(kuò)增結(jié)果指示劑，通過肉眼觀察LAMP反應(yīng)液顏色變化判斷陰性、陽性結(jié)果。優(yōu)化條件下，該方法反應(yīng)約1h可獲得的最低檢測限為167CFU/mL。較之于傳統(tǒng)PCR方法，所建立的方法分析周期短(從開始預(yù)處理樣品到得出檢測結(jié)果只需～2h)；靈敏度高(～10×PCR)。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用該方法對青島近岸海水中副溶血弧菌的檢測，所獲結(jié)果與經(jīng)典培養(yǎng)方法和PCR方法結(jié)果一致。結(jié)果表明：該方法使用儀器簡單，響應(yīng)快，操作簡易，可為現(xiàn)場快檢海水中副溶血弧菌提供技術(shù)支持。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017，7(6):58-65]

副溶血弧菌；海水；LAMP；免DNA提??；快速檢測

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)為革蘭氏陰性菌，呈弧狀、桿狀、絲狀等多種形狀，具有嗜鹽、耐熱特征，主要存在于海洋、河口環(huán)境及魚、蝦、貝等生物體中，是沿海地區(qū)主要食源性致病菌之一[1-3]。多種分析檢測副溶血弧菌的方法已經(jīng)建立并應(yīng)用，比如經(jīng)典的培養(yǎng)法、免疫法以及基于分子生物學(xué)技術(shù)而成的生物傳感器法、PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增法(LAMP)等[4]。近年來基于基因分析的方法發(fā)展迅速，尤其是基于LAMP的各種自動(dòng)化(熒光、濁度等)和半自動(dòng)化(凝膠電泳等)方法[3-8]?；蚍治龇椒ㄝ^于PCR法具有更高的靈敏度和特異性，而且擴(kuò)增過程對模板溶液中的血漿、細(xì)胞殘?jiān)雀蓴_物質(zhì)耐受能力強(qiáng)[9]，因此成為應(yīng)用研究熱點(diǎn)之一。目前評估水產(chǎn)品中副溶血弧菌情況是主要研究方向，但對環(huán)境中該菌的檢測報(bào)道鮮有。鑒于水產(chǎn)品中的副溶血弧菌與其生長環(huán)境密切相關(guān)[1,10]，海洋、河口等水環(huán)境中該菌的檢測能為水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)提供有效預(yù)警數(shù)據(jù)[11]，從而從源頭上減少被污染水產(chǎn)品對人類健康帶來的損害。此外，水體中的副溶血弧菌也是人類健康威脅之一[12]。因此，研發(fā)海水中副溶血弧菌的準(zhǔn)確、高效檢測方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義，但尚未見報(bào)道。本研究以tlh基因作為副溶血弧菌的標(biāo)識基因，通過系列優(yōu)化，建立了海水中該菌的可視化LAMP快速檢測方法，旨在為進(jìn)一步建立現(xiàn)場快檢技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 方法與材料

1.1.1 LAMP法

LAMP體系采用美國NEB提供的Bst2.0等溫?cái)U(kuò)增酶，1.6 μmol/L的FIP和BIP，0.2 μmol/L F3和B3，0.8 μmol/L的LF和LB，BstDNA聚合酶0.80 U(美國NEB)，6 mmol/L MgSO4, 1.4 mmol/L dNTPs, 2.5 μL 10×Buffer，以基因組DNA(1 μL)或者菌懸液(5 μL)為模板。tlh基因常被用作檢測副溶血弧菌的靶基因[3,5,7,13]。本實(shí)驗(yàn)所用3對引物見表1，已由Yamazaki等[3]證實(shí)有特異性識別能力。引物產(chǎn)品由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成，模板為從副溶血弧菌中提取的基因組DNA或者菌懸液。參照文獻(xiàn)[14-15]，除非特殊說明，實(shí)驗(yàn)采用羥基萘酚藍(lán)(HNB)作為LAMP擴(kuò)增結(jié)果指示劑，通過肉眼觀察LAMP反應(yīng)液顏色變化判斷陰性、陽性結(jié)果；對照實(shí)驗(yàn)中，采用瓊脂凝膠電泳儀(DYY-11型，北京市六一儀器廠)結(jié)合DNR凝膠成像系統(tǒng)(MF-ChemiBis 3.2，以色列)分析擴(kuò)增結(jié)果。在LAMP體系初始階段(擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生前)，Mg2+與HNB結(jié)合，溶液的顏色為紫羅蘭色。擴(kuò)增反應(yīng)過程產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸根，該產(chǎn)物易于與Mg2+結(jié)合生成焦磷酸鎂沉淀，使得HNB因失去絡(luò)合Mg2+而變?yōu)樘焖{(lán)色，因而可以用來指示LAMP反應(yīng)結(jié)果[9,15-16]。水浴時(shí)間為60 min，溫度為65 ℃。

表1 tlh基因引物序列Tab.1 The primer sequences for tlh gene

1.1.2 PCR法

PCR法在Wang等[17]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)： 25 μL反應(yīng)體系包括2.5 μL 10×Buffer、6 mmol/L MgCl2、1.4 mmol/L dNTPs，各40 umol/L LF3和B3引物、1 μL DNA模板、8 U Taq酶(寶生物工程大連有限公司)。其中引物為tlh-F3和tlh-B3。反應(yīng)程序: 預(yù)變性 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s；30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分析。其中所用梯度PCR儀型號為5331(德國Dr. Eppendorf公司)，凝膠電泳所用儀器同上。

1.1.3 副溶血弧菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

將本實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱中保藏的菌種(#ATCC17802)活化，在TCBS固體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取菌落接種至堿性蛋白胨水(APW)中，30 ℃振蕩過夜。將過夜培養(yǎng)后的菌液10倍梯度稀釋,進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.1.4 模板DNA提取

實(shí)驗(yàn)采用購自美國TIAN GEN公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行模板DNA的提取，用BD-1000超微量核酸蛋白分析儀(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)測定DNA濃度。

1.1.5 含副溶血弧菌模擬污染海水的制備

將純培養(yǎng)的副溶血弧菌收集于50 mL離心管中，10 397 g離心2 min，去上清液，將底部菌體用雙蒸水重懸浮，將1 mL原菌液加入99 mL滅菌海水中，獲得含副溶血弧菌的模擬污染海水。

1.2 海水樣品中副溶血弧菌的檢測

1.2.1 樣品采集

參照文獻(xiàn)[18]，實(shí)驗(yàn)于2017年4月在青島市近岸Q1～Q15共15個(gè)站點(diǎn)(圖1)，用潔凈加侖桶采集海水樣品，每點(diǎn)3個(gè)平行樣品，每個(gè)樣品1.0 L。裝有海水樣品的加侖桶立刻放入內(nèi)置冰塊的保溫箱內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

圖1 青島近岸海域采樣站點(diǎn)分布Fig.1 Sampling sites of Qingdao coastal area

1.2.2 樣品預(yù)處理與檢測

首先通過定性中速濾紙過濾1 L海水樣品，除去泥沙及其他不溶物，然后采用0.22 μm醋酸纖維素微孔濾膜過濾。將濾膜剪碎，放入50 mL離心管中，加入5 mL超純水，劇烈振蕩5 min，將濾膜取出，放入另外一個(gè)離心管中，加入2 mL超純水振蕩后合并到第一個(gè)離心管中。常溫離心4 min(3 743 g)，保留底部細(xì)菌沉淀，再加入1 mL滅菌超純水，混勻，獲得菌懸液。以該菌懸液作為模板，進(jìn)行可視化LAMP法檢測，或者提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板，其中所用振蕩器型號為QL-901(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1 可視化LAMP法檢測DNA模板和菌懸液模板中tlh基因

如圖2(A)所示，實(shí)驗(yàn)選擇HNB作為可視化LAMP法的指示劑，采用基因組DNA作為模板，當(dāng)模板量不低于13.8 fg時(shí)，60 min后反應(yīng)液即變成天藍(lán)色，說明本實(shí)驗(yàn)條件下對應(yīng)檢測限為13.8 fg；凝膠電泳條帶所獲結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，如圖2(B)。

圖2 HNB指示LAMP檢測基因組DNA靈敏度(A)和 LAMP反應(yīng)液的凝膠電泳結(jié)果(B)1～10號中基因組DNA模板的量分別為0.00(陰性對照)、1.38×106、1.38×105、1.38×104、1.38×103、1.38×102、1.38×101、1.38×100、1.38×10-1和1.38×10-2 fg。條件：水浴時(shí)間60 min，溫度65 ℃。Fig.2 Indicating the sensitivity of LAMP with HNB (A), and electrophoretic analysis of LAMP (B)The concentration of the template DNA in 1-10 reaction tube was 0.00(negative control), 1.38×106, 1.38×105, 1.38×104,1.38×103,1.38×102, 1.38×101, 1.38×100, 1.38×10-1 and 1.38×10-2 fg, respectively.Reaction conditions: incubation at 65 ℃ for 60 min.

研究表明，LAMP反應(yīng)對模板溶液中的血漿、細(xì)胞殘?jiān)雀蓴_物質(zhì)耐受能力強(qiáng)[9,19]，不但對所提取的DNA模板純化要求較低，而且菌懸液(甚至是含有目標(biāo)細(xì)菌的尿液等[20])也可以直接作為模板，本實(shí)驗(yàn)對此也進(jìn)行了驗(yàn)證。將菌懸液于漩渦儀上振蕩2 min，使菌體分布均勻，取100 μL菌懸液加入到固體培養(yǎng)基上，利用平板計(jì)數(shù)法測得菌液濃度為1.67×107CFU/mL；同時(shí)將該菌懸液稀釋制備出系列濃度，混勻，分別取5 μL作為模板直接加入到LAMP混合液中進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示：當(dāng)模板濃度不低于167 CFU/mL時(shí)，60 min后反應(yīng)液即變成天藍(lán)色，說明本實(shí)驗(yàn)條件下對該細(xì)菌的檢測限為167 CFU/mL。這就意味著利用本實(shí)驗(yàn)所建立的LAMP法檢測海水中副溶血弧菌時(shí)，其結(jié)果能夠直接可視化，而無需經(jīng)繁瑣的DNA提取等處理步驟，也不需使用多種大型貴重儀器(比如離心機(jī))，方法更加簡易方便。

圖3 HNB指示不同副溶血弧菌模板(菌懸液)量情況下LAMP反應(yīng)結(jié)果1～10號中副溶血弧菌模板的濃度分別為0.00(陰性對照)、1.67×107、1.67×106、1.67×105、1.67×104、1.67×103、1.67×102、1.67×101、1.67×100和1.67×10-1CFU·mL-1。Fig.3 The results of visual LAMP depend on theinitial quantity of template (bacteria suspension) with HNBThe concentration of the template V. parahaemolyticusin 1-10 reaction cell was 0.00(negative control), 1.67×107, 1.67×106, 1.67×105, 1.67×104, 1.67×103,1.67×102,1.67×101, 1.67×100 and 1.67×10-1 CFU·mL-1, respectively.

2.2 可視化LAMP法的可靠性與靈敏性

以超純水為陰性模板，以1.38×103fg副溶血弧菌基因組DNA為陽性模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，其中一組采用HNB指示，結(jié)果顯示擴(kuò)增良好，如圖4(A)；另外一組采用凝膠電泳法，結(jié)果也顯示擴(kuò)增良好，如圖4(B)，因此排除了實(shí)驗(yàn)體系被污染的可能性。

目前，基于特定識別基因，采用PCR法檢測副溶血弧菌已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[3,7]。本實(shí)驗(yàn)采用該法對LAMP法的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證，凝膠電泳結(jié)果見圖4(B)。LAMP法可視化結(jié)果、LAMP法凝膠電泳結(jié)果和PCR法凝膠電泳結(jié)果吻合良好，說明上述可視化LAMP法檢測tlh基因具有一定可靠性。此外，以超純水為陰性模板，以副溶血弧菌懸液為陽性模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，其可視化結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果亦吻合良好。

圖4 LAMP(A)和PCR(B)擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果A: M—Marker；1—陰性對照; 2—陽性對照。B: M—Marker；1—陽性對照(以基因組DNA為模板)；2—以副溶血弧菌菌懸液為模板；3—陰性對照。Fig.4 Electrophoresis of LAMP (A) and PCR (B)A: M—Marker; 1— negative control, 2—positive reaction.B: M—Marker；1—positive reaction (with DNA template)；2—positive reaction (with V. parahaemolyticus bacterial suspension template); 3—negative control.

相關(guān)研究證實(shí)LAMP法比普通PCR法靈敏度高約一個(gè)數(shù)量級[17,21]。實(shí)驗(yàn)采用基因組DNA作為擴(kuò)增模板，考察了本實(shí)驗(yàn)條件下LAMP靈敏度與PCR法靈敏度之間的關(guān)系。如圖5所示，優(yōu)化條件下，當(dāng)模板量濃度<138 fg時(shí)，采用DNR凝膠成像系統(tǒng)表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR反應(yīng)液電泳條帶上沒有明顯的DNA產(chǎn)物，說明本實(shí)驗(yàn)條件下對應(yīng)檢測限為138 fg/管。對照上面結(jié)果可知，LAMP法靈敏度是PCR法的10倍，該結(jié)論與文獻(xiàn)[17,21]報(bào)道相一致。如上所示，LAMP法操作過程較PCR法更為簡易，且儀器更易小型化[9]，因而在構(gòu)建現(xiàn)場快速檢測方法上具有明顯優(yōu)勢。

圖5 PCR檢測基因組DNA的凝膠電泳結(jié)果1～10號中模板DNA量分別為1.38×106、1.38×105、 1.38×104、1.38×103、1.38×102、1.38×101、 1.38×100、1.38×10-1、1.38×10-2和1.38×10-2fg。Fig.5 Electrophoresis of genome DNA with PCR The concentration of template DNA in 1-10 reaction tube was 1.38×106, 1.38×105,1.38×104, 1.38×103, 1.38×102,1.38×101, 1.38×100, 1.38×10-1, 1.38×10-2 and 1.38×10-2fg, respectively.

2.3 可視化LAMP法檢測條件的優(yōu)化

為了獲得高靈敏度、高穩(wěn)定性檢測方法，實(shí)驗(yàn)對樣品采集和LAMP操作相關(guān)的主要條件進(jìn)行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上確定了最佳參數(shù)。

實(shí)驗(yàn)考察了水系微孔濾膜孔徑對富集副溶血弧菌效能的影響。對于同一份模擬海水樣品，分別采用0.45和0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾，將獲得的總菌菌懸液作為模板進(jìn)行LAMP檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用0.45 μm孔徑時(shí)，LAMP反應(yīng)80 min后方可見紫羅蘭色向天藍(lán)色轉(zhuǎn)變，如圖6(A)；采用0.22 μm孔徑時(shí)，LAMP反應(yīng)60 min后即可見紫羅蘭色向天藍(lán)色轉(zhuǎn)變，如圖6(B)，說明采用較小孔徑的濾膜可以富集更多的微生物。因此，為了較好的富集性能，其他富集細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)都沒有采用常用0.45 μm孔徑的濾膜[22-23]，而是統(tǒng)一選用了0.22 μm孔徑的微孔濾膜。

圖6 以0.45 μm孔徑(A)和0.22 μm孔徑(B)微孔濾膜過濾所得總細(xì)菌菌懸液為擴(kuò)增模板時(shí)LAMP反應(yīng)結(jié)果1～8號反應(yīng)時(shí)間分別為20、30、40、50、60、70 、80和90 min。其他條件與參數(shù)同圖2。Fig.6 The results of LAMP with bacteria suspension as the template. (A)bacteria obtained with 0.45 μm filter; (B)bacteria obtained with 0.22 μm filter The reaction time of from NO.1 to NO.8 was 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 and 90 min, respectively. Other conditions and parameters were the same as that stated in Fig.2.

將細(xì)菌富集在微孔濾膜上以后，需要將其洗脫到溶液中去以方便用作LAMP模板或者提取DNA。洗脫劑的選取有3%生理鹽水[24]或超純水[25]。實(shí)驗(yàn)對洗脫劑的影響也進(jìn)行了研究。在相同情況下，分別過濾相同的模擬海水樣品(副溶血弧菌的濃度為1.67×105CFU/mL)各100 mL，將濾膜剪碎后分別放于離心管中，用10 mL生理鹽水或超純水分別按1.2.2進(jìn)行洗脫處理，制得菌懸液并按照10倍梯度稀釋。各取5 μL菌懸液作為LAMP模板進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，當(dāng)稀釋10 000倍以內(nèi)時(shí)，60 min后皆可擴(kuò)增成功(圖7)，但超過這個(gè)倍數(shù)后皆不能成功，意味著本條件下生理鹽水和超純水的洗脫效果沒有差別。因此，其他洗脫實(shí)驗(yàn)中一律采用超純水。

圖7 不同洗滌模式對LAMP檢測結(jié)果影響1：陰性對照；2和3：超純水洗滌；4和5：生理鹽水洗滌。其他條件與參數(shù)同圖2。Fig.7 The effect of elution method on the results of LAMP 1: negative control; 2 and 3: elution with ultra-pure water; 4 and 5: elution with 3% NaCl solution. Other conditions and parameters were the same as that stated in Fig.2.

圖8 青島近岸15份海水樣品中副溶血弧菌的可視化LAMP檢測結(jié)果Fig.8 The detection results of V. parahaemolyticus in 15 seawater samples from Qingdao coastal area

2.4 可視化LAMP法應(yīng)用于海水樣品中副溶血弧菌的檢測

利用建立的可視化LAMP檢測方法對青島近岸15份海水進(jìn)行檢測(每個(gè)樣品3組平行實(shí)驗(yàn))。結(jié)果表明，從5個(gè)站點(diǎn)(Q3、Q6、Q7、Q14和Q15)所取海水中可以檢出目標(biāo)細(xì)菌，檢出率為33.3%(圖8)。根據(jù)上述檢測靈敏度研究結(jié)果，如果不考慮共存物(如微生物、微藻等)以及運(yùn)輸過程帶來的影響，在15份海水樣品中， 來自Q3、Q6、Q7、Q14和Q15等5個(gè)站點(diǎn)的海水中副溶血弧菌含量≥1.67 CFU/mL。每個(gè)樣品3個(gè)平行樣檢測結(jié)果一致性較好，說明本方法具有良好的重現(xiàn)性。同時(shí)對15份海水樣品進(jìn)行LAMP方法、PCR檢測和經(jīng)典培養(yǎng)法對比檢測，3種方法所得結(jié)果一致，檢出率均為33.3%(表2)。

表2 可視化LAMP方法、PCR法和培養(yǎng)法檢測海水樣品結(jié)果Tab.2 Detection results of V. parahaemolyticus in seawater samples by visual LAMP, PCR and culture method

3 討論

海洋環(huán)境中存在多種可同時(shí)感染人和水生動(dòng)物的致病微生物，這些致病微生物不但會引起生態(tài)災(zāi)難，而且還給公共衛(wèi)生安全和人類健康帶來巨大威脅[26]，其中副溶血弧菌的危害目前已經(jīng)得到了廣泛的研究[1-3]。對生產(chǎn)環(huán)境中該病原菌進(jìn)行高效、準(zhǔn)確檢測是有效保證水產(chǎn)品質(zhì)量的重要可行措施。本研究團(tuán)隊(duì)近年來致力于LAMP方法及其在漁業(yè)環(huán)境微生物檢測中的應(yīng)用研究，先后構(gòu)建了“LAMP-伏安分析”模式基因檢測方法[27]和“LAMP-電導(dǎo)傳感器”模式基因檢測方法[28-29]，其中后者應(yīng)用于大腸桿菌O26-wzy基因的分析，檢出限可達(dá)12.5 copy/μL。在上述研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)基于膜過濾富集方法及LAMP技術(shù)，建立了海水中副溶血弧菌的可視化快速檢測方法。

較之于PCR技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)建立的可視化LAMP法具有更好的適用性：1)靈敏度較高。LAMP法檢測海水中副溶血性弧菌的靈敏度約為PCR技術(shù)的10倍；2)低耗高效。在恒溫條件下進(jìn)行目標(biāo)DNA片段的復(fù)制，不需要模板的熱變性和溫度循環(huán)，有效避免了制冷制熱裝備的應(yīng)用——既能精簡儀器結(jié)構(gòu)，又能降低能耗和提高效率[9]；3)操作簡便。生化反應(yīng)對模板溶液中的血漿、細(xì)胞殘?jiān)雀蓴_物質(zhì)耐受能力強(qiáng)，從海水中富集到的總菌菌懸液即可直接作為模板，免去提取DNA的步驟，大大減少了預(yù)處理步驟，也進(jìn)一步降低對大型貴重儀器的依賴；4)特異性強(qiáng)。采用3對特異性引物識別8個(gè)部位堿基序列[8-9]，因而比采用1對引物識別2個(gè)部位堿基序列具有更高的特異性。

一般情況下，SYBR Green I[30]、EvaGreen[31]、GeneFinder[32]等熒光染料常被用于擴(kuò)增產(chǎn)物的表征。但這些染料對LAMP擴(kuò)增的抑制作用不能忽略，因此一般用于電泳，或者反應(yīng)結(jié)束后再加入，通過光學(xué)儀器或肉眼觀察來判斷反應(yīng)結(jié)果。加入這些核酸染料的操作中往往需要打開反應(yīng)管蓋子，使得反應(yīng)產(chǎn)物暴露在空氣中，極易形成氣溶膠，嚴(yán)重影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽性率急劇增加[9,33-34]。EvaGreen等[31,35]核酸染料在用于檢測LAMP產(chǎn)物時(shí)，需要額外使用光學(xué)設(shè)備，不能直接觀察到結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中采用的HNB染料不會對LAMP反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用[9,36]，因此可以在反應(yīng)前混合在反應(yīng)液中[37]，而且無需專用儀器即可直接用肉眼觀察結(jié)果，因而更加簡便易行，極大提高了分析效率。實(shí)驗(yàn)建立的可視化LAMP方法應(yīng)用于海水樣品中副溶血弧菌的檢測時(shí)，從開始采集并預(yù)處理樣品到得出檢測結(jié)果總共需約2 h，效率明顯高于目前所知同類方法[13,38]；靈敏度可達(dá)167 CFU/mL，雖然與Prompamorn等[13]所建立的LAMP-LFD方法檢測靈敏度為同一個(gè)數(shù)量級，但本方法不需要提取DNA，因而操作更簡易、效率更高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所建立的可視化LAMP法具有響應(yīng)快、儀器簡單、操作簡易等突出特點(diǎn)。目前成果為進(jìn)一步建立“檢出信號與海水中副溶血弧菌濃度之間的定量關(guān)系”打下了基礎(chǔ)，也為構(gòu)建海洋環(huán)境微生物快檢技術(shù)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法。

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RapiddetectionmethodofVibrioparahaemolyticusinseawater basedonvisualLAMP

HUANGMengshi1,2,YANGQianqian1,2,ZHANGYan2,GUYangguang3,ZHAOJun2,ZHANGXuzhi2,DINGDongsheng2,QUKeming2*

(1.CollegeofMarineSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;2.YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences;QingdaoNationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,Qingdao266071,China;3.SouthSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheryScience，ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510300,China)

Vibrioparahaemolyticus(V.parahaemolyticus) is one of the major foodborne pathogenic bacteria in coastal areas. The evaluation of the current status of this kind of bacteria is extremely significant for both aquaculture and marine environment management. However, the traditional detection methods are unqualified for providing timely detection due to the slow response and expensive equipment. Herein a rapid method was constructed based on a visual loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology to detectV.parahaemolyticus, which has highly conserved genes oftlh. Briefly, bacteria in seawater samples were collected with filtration, the collected bacteria were subsequently used as reaction templates to perform LAMP, without the step of DNA extraction. Positive or negative results were identified finally by the color change of hydroxy naphthol blue with naked eyes. Under the optimized conditions, the detection limit was167CFU/mL (～1h). In comparison with traditional PCR methods, the visual LAMP proposed here has the advantage of distinguish efficiency. Including the consumption of sample pretreatment, the whole performance of detection took2h . Meanwhile, its sensitivity is about10-fold higher than PCR’s. The visual LAMP method was also applied to detectV.parahaemolyticusin real seawater samples collected from Qingdao coastal area in this study. The results were in good agreement with those obtained with classical culture method and PCR method. Without the involvement of bulky instrumentation, plus the rapid response and simple operation, this proposed method is favorable to use on-site surveys of target marine microorganisms. [Chinese Fishery Quality and Standards,20177(6):58-65]

Vibrioparahaemolyticus; seawater; LAMP; without DNA extraction; rapid detection

QU Keming, qukm@ysfri.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.06.009

S917.1

A

2095-1833(2017)06-0058-08

2017-06-22；接收日期2017-10-19

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2016RC-BR02)；黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022016003)；青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015ASKJ02);山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016GSF120008)

黃夢詩(1991-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)闈O業(yè)生態(tài)環(huán)境檢測技術(shù)，m15800715082@163.com

曲克明，研究員，研究方向?yàn)闈O業(yè)生態(tài)環(huán)境，qukm@ysfri.ac.cn