張洪玉，王海波,，趙明軍，呂永輝，胡鯤，楊先樂，夏磊,,*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院無公害漁藥創(chuàng)制中心，北京102488； 3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn) 與生命學(xué)院，上海201306； 4.北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司，北京102488； 5.北京市房山區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京102488)

草魚肝細(xì)胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇與優(yōu)化

張洪玉1,2,3，王海波2,4，趙明軍1，呂永輝5，胡鯤3，楊先樂3，夏磊1,2,4*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院無公害漁藥創(chuàng)制中心，北京102488；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn) 與生命學(xué)院，上海201306；4.北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司，北京102488；5.北京市房山區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京102488)

為尋找適宜培養(yǎng)草魚原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，本研究運用倒置相差顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察和CCK-8細(xì)胞活力實驗，比較研究了DMEM/F12、α-MEM、RPMI-1640、M199和L-155種培養(yǎng)基，1μmol/L胰島素、2mmol/L谷氨酰胺和10μmol/L氫化可的松3種添加劑以及熱滅活血清對草魚原代肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響。通過形態(tài)學(xué)和活力檢測觀察發(fā)現(xiàn)α-MEM、M199和L-15均可以較好地促進(jìn)草魚原代肝細(xì)胞貼壁以及維持較長活力，其中以L-15為最優(yōu)；此外，胰島素的添加有助于細(xì)胞活力的維持，而谷氨酰胺和氫化可的松的添加以及血清滅活與否對細(xì)胞貼壁和活力維持均無顯著性差別。本研究可為草魚原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)基選擇提供參考，同時為草魚生理學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)研究乃至藥物篩選提供支持。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(6):36-41]

草魚；肝細(xì)胞；原代培養(yǎng)；培養(yǎng)基；細(xì)胞活力

自Bimbaum于1976年首次實現(xiàn)金魚肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)[1]，已有40多種魚的肝細(xì)胞被成功分離并進(jìn)行體外培養(yǎng)[2]。魚類原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)不僅對生理學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)研究具有重要意義，而且在藥物篩選的研究中也發(fā)揮著舉足輕重的作用[2]。2015年，中國學(xué)者殷國俊實驗室就相繼利用鯉的肝細(xì)胞篩選了多種中草藥保肝藥物[3-4]。但是魚類肝細(xì)胞分離培養(yǎng)會因種屬不同而不同，而且溫度、pH、培養(yǎng)基以及生長因子等添加物也都會影響肝細(xì)胞的生長[2]。目前國際上魚類肝細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)研究以虹鱒的報道居多[2]，這可能與其在歐美和日本等地養(yǎng)殖歷悠久且十分普及，并較適合離體培養(yǎng)有關(guān)。

草魚(Ctenopharyngodonidella)是中國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的淡水品種，且肝病爆發(fā)較為常見，故有必要對草魚肝臟及細(xì)胞的生理、發(fā)病機理以及藥物篩選進(jìn)行研究。已有使用草魚原代肝細(xì)胞研究藥物藥效和毒性的相關(guān)報道[5-7]，這些研究中所用培養(yǎng)基有M199[8-9]、RPMI-1640[7]和DMEM/F12[5-6,10-12]，所用添加劑除血清外，還有1μmol/L胰島素和10μmol/L氫化可的松[11]。這些培養(yǎng)基和添加劑的選擇主要參考了其他魚類和哺乳動物肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，但對于各培養(yǎng)基在草魚培養(yǎng)過程中的適應(yīng)情況缺少相關(guān)的比較研究。鑒于不同種屬來源的肝細(xì)胞對培養(yǎng)基的需求存在差異[2]，本實驗比較研究了5種常見培養(yǎng)基、3種添加劑和熱滅活血清對細(xì)胞形態(tài)和活力的影響，以期為草魚原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)提供實驗數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

倒置相差顯微鏡(DMI3000B，LEICA)；二氧化碳培養(yǎng)箱[MCO-18A/C(UV)，SANYO]；酶標(biāo)儀(SPECTRA MAX 190，MP)。

1.2 實驗材料

α-MEM(SH30265.01，HyClone)；DMEM/F12(SH30023.01B，HyClone)；RPMI-1640(SH30809.01，HyClone)；M199(SH30253.01，HyClone)；L-15(11415064，GIBCO)；PBS緩沖液(SH30256.01，HyClone)；Hank’s液(14175095，LIFE)；青鏈霉素(15140122，LIFE)；胎牛血清(11011-8611，四季青)；0.25%胰蛋白酶(SH30042.02，HyClone)；谷氨酰胺(25030081，GIBCO)；氫化可的松(219456901，MP)；牛胰島素(I5500，Sigma)；DMSO(196055，MP)；增強型CCK-8試劑盒(C0042，碧云天)。

草魚(Ctenopharyngodonidella)來自上海地方養(yǎng)殖池溏，用常規(guī)飼料在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖1個月后，取150 g左右外觀無異常的草魚進(jìn)行實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 草魚原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

解剖針破壞魚腦以處死草魚，75%乙醇擦拭魚體進(jìn)行消毒，超凈工作臺內(nèi)迅速剝離肝胰臟，確認(rèn)肝胰臟顏色質(zhì)地正常后，切成1～2 mm3組織塊，10倍體積的預(yù)冷PBS清洗5遍，5倍體積0.25%胰酶28 ℃搖床200 r/min消化10 min，添加含10%胎牛血清的預(yù)冷Hank’s液終止消化，70 μm孔徑濾網(wǎng)過濾，100 g室溫離心5min，預(yù)冷Hank’s液清洗一次，100 g室溫離心5 min，重懸于預(yù)冷Hank’s液，計數(shù)后備用。使用L-15培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)于不通CO2的培養(yǎng)箱，使用其他培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)于含5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度均為25 ℃[6,9]。

1.3.2 不同培養(yǎng)基對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

細(xì)胞以1×106個/mL分別重懸于含10%胎牛血清的DMEM/F12、α-MEM、RPMI-1640、M199和L-15的5種培養(yǎng)基。每孔接種200 μL于96孔板，4個重復(fù)?？瞻卓准尤氲攘颗囵B(yǎng)基。每天觀察細(xì)胞形態(tài)，每3天更換一半培養(yǎng)基，于鋪板后第0、2、7和14天檢測細(xì)胞活力。

1.3.3 不同添加劑對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

胰島素以PBS溶解，配制成100 μmol/L儲存液，0.22 μm濾膜過濾。谷氨酰胺配制為200 mmol/L溶液。氫化可的松以DMSO溶解，配制成10 mmol/L儲存液。用含10%未經(jīng)熱滅活胎牛血清的L-15作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行實驗。細(xì)胞以1×106個/mL密度分別重懸于含1 μmol/L胰島素、2 mmol/L谷氨酰胺和10 μmol/L氫化可的松的培養(yǎng)基中。每孔接種200 μL于96孔板，4個重復(fù)?？瞻卓准尤氲攘颗囵B(yǎng)基和添加劑。每3天更換一半培養(yǎng)基，新補充的培養(yǎng)基同樣含有添加劑，于鋪板后第0、 2、 7和14天檢測細(xì)胞活力。

1.3.4 血清滅活對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

用L-15作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行實驗。胎牛血清以56 ℃熱滅活30 min。一組含10%未經(jīng)熱滅活的胎牛血清，另一組含10%熱滅活后的胎牛血清。實驗觀察方法同上。

1.3.5 CCK-8細(xì)胞活力實驗

實驗孔和空白孔中加入20 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，測定OD450。實驗孔和空白孔OD450的差值反映細(xì)胞活力的高低。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，n=4。采用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，采用LSD檢驗進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

草魚原代肝細(xì)胞分別于DMEM/F12、α-MEM、RPMI-1640、M199和L-15這5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，使用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果如圖1所示?？梢姡瑹o論培養(yǎng)于何種培養(yǎng)基，細(xì)胞活力均呈逐漸下降的趨勢。第2天不同培養(yǎng)基間細(xì)胞活力區(qū)別并不明顯，只有DMEM/F12的細(xì)胞活力較低(P<0.01)。培養(yǎng)7 d，L-15、α-MEM和 M199這3種培養(yǎng)基要明顯優(yōu)于DMEM/F12和RPMI-1640(P<0.01)，但L-15、α-MEM和 M199之間無顯著性差異(P>0.05)。培養(yǎng)14 d，L-15優(yōu)于α-MEM和 M199(P<0.01)，α-MEM和 M199優(yōu)于DMEM/F12和RPMI-1640(P<0.01)。

圖1 不同培養(yǎng)基對草魚原代肝細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of diferent culture medium on cell viability of primary hepatocytes from Ctenopharyngodon idella

在細(xì)胞形態(tài)上(圖2)，可見L-15、α-MEM和 M199 3種培養(yǎng)基在第2天開始出現(xiàn)細(xì)胞聚集成條索，少量細(xì)胞展開貼壁，而DMEM/F12和RPMI-1640細(xì)胞聚集不及另3種培養(yǎng)基明顯，貼壁的細(xì)胞也更少。第7天，這3種培養(yǎng)基中有更多的細(xì)胞展開貼壁，特別是L-15。而DMEM/F12和RPMI-1640中的細(xì)胞貼壁不明顯，換液時細(xì)胞十分容易漂起。培養(yǎng)14 d后，L-15、α-MEM和 M199 3種培養(yǎng)基中的細(xì)胞貼壁成片層狀，而DMEM/F12和RPMI-1640中的細(xì)胞不貼壁，且部分實驗孔中的細(xì)胞在換液時出現(xiàn)片狀脫落。總的來說，在促進(jìn)細(xì)胞貼壁方面L-15最優(yōu)，其次是M199和α-MEM，DMEM/F12和RPMI-1640最差。

圖2 不同培養(yǎng)基對草魚原代肝細(xì)胞形態(tài)的影響(標(biāo)尺=100 μm)Fig.2 Effects of 5 culture medium on cell morphology of primary hepatocytes from Ctenopharyngodon idella (Scale bar =100 μm)

2.2 不同添加劑對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

草魚原代肝細(xì)胞分別于含1 μmol/L胰島素、2 mmol/L谷氨酰胺和10 μmol/L氫化可的松的L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，使用CCK-8法檢測細(xì)胞活力(圖3)。可見，前2天各添加劑組與對照組比較細(xì)胞活力區(qū)別不明顯(P>0.05)。7 d后，胰島素組細(xì)胞活力顯著高于其他組(P<0.01)。

在細(xì)胞形態(tài)上(圖4)，各組細(xì)胞初始接種密度均偏低，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞雖然有貼壁，但均沒有連接成大片狀。胰島素使細(xì)胞表現(xiàn)出了更強的聚集傾向，但對細(xì)胞貼壁并沒有明顯促進(jìn)作用，而其他各組之間也無明顯區(qū)別。

圖3 胰島素、谷氨酰胺和氫化可的松對草魚原代肝細(xì)胞活力的影響*表示：第7天和第14天，胰島素組細(xì)胞活力高于對照組(P<0.01)。Fig.3 Effects of insulin, glutamine and hydrocortisone on cell viability of primary hepatocytes from Ctenopharyngodon idella* denotes: on day 7 and 14, cell viability of insulin group is higher than control group (P<0.01).

圖4 胰島素、谷氨酰胺、氫化可的松和血清滅活對草魚原代肝細(xì)胞形態(tài)的影響細(xì)胞培養(yǎng)7天，標(biāo)尺=100 μm(滅活血清組標(biāo)尺=200 μm)。Fig.4 Effects of insulin, glutamine, hydrocortisone and heat inactivation of serum on cell morphology of primary hepatocytes from Ctenopharyngodon idella 7 days’ cell culture, scale bar= 100 μm (scale bar of heat-inactivated group = 200 μm).

2.3 血清滅活對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

草魚原代肝細(xì)胞分別于含熱滅活和未熱滅活血清的L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，使用CCK-8法檢測細(xì)胞活力(圖5)。可見，血清滅活對細(xì)胞活力無明顯影響(P>0.05)。在細(xì)胞形態(tài)上(圖4)，同樣無明顯區(qū)別。

圖5 血清滅活對草魚原代肝細(xì)胞活力的影響Fig.5 Effects of heat inactivation of serum on cell viability of primary hepatocytes from Ctenopharyngodon idella

3 討論

3.1 不同培養(yǎng)基對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

常用的真核細(xì)胞培養(yǎng)基均主要由無機鹽、氨基酸、維生素和碳源等基本成分配比而成，但為適應(yīng)不同種屬和組織來源的細(xì)胞對營養(yǎng)的需求以及具體實驗的要求，不同培養(yǎng)基在營養(yǎng)成分的具體種類、含量和配比上仍存有一定的差異。在魚類原代細(xì)胞培養(yǎng)中，最常用的培養(yǎng)基是L-15和M199[2,13]。在草魚肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)中，除了M199[8-9]，也有使用RPMI-1640[7]和DMEM/F12[5,6,10-12]的相關(guān)報道。本實驗結(jié)果顯示，L-15培養(yǎng)基最有利于草魚原代肝細(xì)胞貼壁和活力維持，這可能與L-15培養(yǎng)基成分的特點有關(guān)。L-15使用半乳糖而不是葡萄糖作為碳源，且含有丙酮酸鈉作為替代碳源。此外，L-15使用磷酸鹽和高濃度的氨基酸來緩沖pH,而不是碳酸氫鹽，所以不需要通CO2，這一特點不僅簡化了培養(yǎng)條件，還適于需要長時間在培養(yǎng)箱外進(jìn)行觀察和操作的實驗。M199和α-MEM也可以較好地維持肝細(xì)胞活力，而RPMI-1640和DMEM/F12則不推薦用于培養(yǎng)草魚原代肝細(xì)胞，特別是需要進(jìn)行2 d以上的培養(yǎng)時間。

3.2 不同添加劑對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

胰島素參與糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，可用做哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)時的添加劑[14-15]，起到促進(jìn)細(xì)胞貼壁和改善細(xì)胞狀態(tài)的作用。在魚類肝細(xì)胞培養(yǎng)上，牛胰島素能促進(jìn)魚類肝細(xì)胞糖原的合成[16]，也有研究者將其用做魚類肝細(xì)胞原代培養(yǎng)時的添加劑[10-11]。本實驗結(jié)果表明在L-15培養(yǎng)基中添加1μmol/L胰島素有助于草魚原代肝細(xì)胞活力的維持。此外，在實驗中，胰島素增加細(xì)胞聚集的傾向，其原因仍有待進(jìn)一步的研究。

糖皮質(zhì)激素如氫化可的松和地塞米松，具有廣泛的生理作用，影響肝細(xì)胞白蛋白、細(xì)胞色素P450等基因的表達(dá)，也用做哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的添加劑[14-15]。特別是上皮來源的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，如人舌癌細(xì)胞細(xì)胞系SCC-9和小鼠肺上皮細(xì)胞系MLE-12的ATCC推薦培養(yǎng)基中均添加氫化可的松作為生長因子[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，氫化可的松和胰島素、催乳素能夠發(fā)揮協(xié)同作用促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖[19]。在魚類肝細(xì)胞培養(yǎng)上，也有研究者聯(lián)合使用10 μmol/L氫化可的松和1 μmol/L胰島素作為草魚原代肝細(xì)胞培養(yǎng)時的添加劑[11]。但本實驗結(jié)果表明在L-15培養(yǎng)基中添加10 μmol/L氫化可的松對細(xì)胞活力和形態(tài)無明顯影響。單獨應(yīng)用氫化可的松對于維持草魚原代肝細(xì)胞活力可能并沒有意義。至于氫化可的松在其他濃度下是否有益于草魚原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)，仍有待進(jìn)一步的研究。

谷氨酰胺通常以2 mmol/L的濃度添加于細(xì)胞培養(yǎng)基中，有助于改善細(xì)胞代謝、促進(jìn)細(xì)胞增殖。谷氨酰胺的這一作用在腫瘤細(xì)胞和一些快速增殖細(xì)胞中更為明顯[20]。有些細(xì)胞培養(yǎng)基中常含有更高濃度的谷氨酰胺，如培養(yǎng)果蠅細(xì)胞的Schneider’s培養(yǎng)基的濃度是12 mmol/L，培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的Gibco CD Hybridoma Medium的濃度是8 mmol/L。本實驗在含有2 mmol/L谷氨酰胺的L-15培養(yǎng)基中額外添加了2 mmol/L，發(fā)現(xiàn)額外添加谷氨酰胺對維持草魚原代肝細(xì)胞活力并無明顯作用。至于更高濃度的谷氨酰胺是否有益于草魚原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)，仍有待進(jìn)一步的研究。

3.3 血清滅活對肝細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

很多實驗室將熱滅活作為胎牛血清的常規(guī)處理，但也有研究者認(rèn)為除了涉及補體的免疫學(xué)方面的研究和培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞外，熱滅活這一操作是不必要的[21]。因為熱滅活可能致使血清中部分生長因子失活、出現(xiàn)沉淀物，從而導(dǎo)致血清品質(zhì)的下降，進(jìn)而對細(xì)胞生長產(chǎn)生負(fù)面影響。本實驗結(jié)果表明，血清滅活與否對草魚原代肝細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞活力無明顯影響。

4 結(jié)論

綜上所述，DMEM/F12、α-MEM、RPMI-1640、M199和L-15這5種培養(yǎng)基在促進(jìn)草魚原代肝細(xì)胞貼壁和活力維持方面，以L-15為最優(yōu)，α-MEM和M199其次，而DMEM/F12和RPMI-1640效果最差。添加1 μmol/L胰島素有助于細(xì)胞活力的維持并促進(jìn)細(xì)胞聚集，而2 mmol/L谷氨酰胺、10 μmol/L氫化可的松和血清熱滅活對細(xì)胞活力和形態(tài)均無明顯影響。培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化為草魚肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)提供了實驗數(shù)據(jù)參考。

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Screeningandoptimizationofculturemediaforprimarycultureofhepatocytes fromgrasscarp(Ctenopharyngodonidella)

ZHANGHongyu1,2,3,WANGHaibo2,4,ZHAOMingjun1,LYNYonghui5,HUKun3,YANGXianle3,XIALei1,2,4*

(1.ChineseAcademyofFisherySciences,Beijing100141,China;2.Research&CreationCenterofGreenFisheryMedicineofChineseAcademyofFisherySciences,Beijing102488,China;3.CollegeofFisheriesandLifeShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;4.BeijingSeasunAquacultureBioTech.Co.Ltd.,Beijing102488,China;5.FangshanAquaticProductTechnologyPromotionDepartment,Beijing102488,China)

To optimize culture media for primary hepatocytes fromCtenopharyngodonidella,5kinds of culture media (DMEM/F12、α-MEM、RPMI-1640、M199and L-15),3additives (1μmol/L insulin,2mmol/L glutamine and10μmol/L hydrocortisone), and heat inactivation of serum were adopted to assess their impacts on cell morphology and viability by inverted phase contrast microscope and CCK-8cell viability assay for2weeks . As a result, cells cultured inα-MEM, M199and L-15, especially in L-15, exhibited better cell adherence and viability than that in DMEM/F12and RPMI-1640. And this effect was enhanced by insulin complement. In contrast, glutamine and hydrocortisone had no significant effects on prompting cell adherence and viability. Moreover, there were no differences in cell adherence and viability between heat-inactivated serum group and fresh serum group. The study may provide technical supports for primary culture of grass carp hepatocytes, even for grass carp physiology, environmental toxicology as well as drug screening.[Chinese Fishery Quality and Standnds,2017,7(6):36-41]

Ctenopharyngodonidella; hepatocytes; primary culture; culture media; cell viability

XIA Lei,xialei@126.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.06.006

S917.4

A

2095-1833(2017)06-0036-06

2017-04-06；接收日期2017-09-21

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(2015C004)

張洪玉(1981-)，男，博士，副研究員，研究方向為無公害漁藥研發(fā)與推廣，zhanghy@cafs.ac.cn

夏磊，副研究員，研究方向為無公害漁藥物研發(fā)與推廣，xialei666@126.com