王任翔，邱 芬（.長(zhǎng)安大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，陜西 西安 70064；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 7006；3.西安交通大學(xué)期刊中心，陜西 西安 7006）

腦整體功能的完成依賴于腦組織特定細(xì)胞表型的相互協(xié)調(diào)和結(jié)構(gòu)的完整。因而，恢復(fù)腦損傷后所丟失的細(xì)胞表型并重構(gòu)受損的組織結(jié)構(gòu)是功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血能刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成體腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的增加。腦缺血后新生的細(xì)胞被稱為缺血誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（ischemia-induced multipotent stem cells，iSCs），它們可以分化成多種神經(jīng)細(xì)胞，以補(bǔ)充損傷所致的神經(jīng)細(xì)胞丟失，改善腦缺血后的功能[1]。從中風(fēng)后人腦組織也分離出iSCs，其表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin，在體外分化為包含神經(jīng)元等多種細(xì)胞[2]，提出這些iSCs有助于中風(fēng)病人的神經(jīng)修復(fù)。

中藥治療腦缺血損傷具有明顯的療效，其對(duì)腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制研究已陸續(xù)有報(bào)道[3-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)，川芎嗪對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究結(jié)果顯示，川芎嗪可以促進(jìn)腦缺血誘導(dǎo)的側(cè)腦室室下區(qū)（subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回顆粒下區(qū)（subgranular zone，SGZ）細(xì)胞增殖[5-6]，SVZ內(nèi)的增殖細(xì)胞經(jīng)不同途徑遷移至缺血紋狀體和皮質(zhì)周?chē)?，使缺血損傷區(qū)的BrdU+細(xì)胞增加[7]。而川芎嗪是否對(duì)這些遷移到損傷區(qū)的新生BrdU+細(xì)胞分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有促進(jìn)作用，以補(bǔ)充因損傷所丟失的神經(jīng)細(xì)胞、重構(gòu)受損的組織結(jié)構(gòu)，目前尚不清楚。為此，本課題組建立大鼠腦缺血模型，更進(jìn)一步探討川芎嗪對(duì)大鼠腦缺血梗死區(qū)周?chē)y狀體BrdU+細(xì)胞分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量220 ～ 260 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血模型組、川芎嗪低劑量組（20 mg.kg-1）、川芎嗪中劑量組（40 mg.kg-1）和川芎嗪高劑量組（80 mg.kg-1）5組，每組3只大鼠。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試劑

BrdU（美國(guó)Sigma公司），大鼠單克隆抗BrdU抗體（英國(guó)Abcam公司），小鼠單克隆抗NeuN抗體、小鼠單克隆抗GFAP抗體（美國(guó)Sigma公司），生物素標(biāo)記山羊抗大鼠IgG試劑盒、生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司），DAB（武漢博士德生物工程公司），鹽酸川芎嗪注射液（無(wú)錫市第七制藥有限公司）。恒冷切片機(jī)（德國(guó)Zeiss公司）。

1.3 局灶性腦缺血模型制作和缺血損傷的判定

大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型采用線栓法制作。在腦缺血模型制作后2 h，參照改良的Bederson's評(píng)分方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分，評(píng)分≥2分視為模型成功，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 給藥方法

采用BrdU標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞，BrdU免疫熒光染色陽(yáng)性作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志。本研究采用連續(xù)累積式BrdU標(biāo)記的方法，于術(shù)后4 h，假手術(shù)組、缺血模型組、川芎嗪低、中、高劑量組大鼠腹腔注射10 g.L-1BrdU（50 mg.kg-1，ip），qd，共21 d。川芎嗪組于術(shù)后2 h內(nèi)腹腔注射20、40、80 mg.kg-1鹽酸川芎嗪注射液，qd，21 d；假手術(shù)組、模型組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.5 BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙重標(biāo)記免疫熒光染色

分別取缺血模型組和川芎嗪低、中、高劑量組21 d的腦片各3張，間隔200 μm，進(jìn)行BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙重標(biāo)記免疫熒光染色。具體步驟如下：① 0.01 mol.L-1PBS（pH 7.4）漂洗切片3次，1% Triton X-100室溫30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；②50%甲酰胺（2×SSC）65 ℃孵育2 h后，2×SSC洗3次，每次5 min；③加入2 mol.L-1HCl 37 ℃孵育1 h后，0.1 mol.L-1硼酸（pH 8.5）漂洗10 min；④加封閉溶液（20 mL.L-1兔血清，3 mL.L-1Triton X-100，1 g.L-1牛血清白蛋白）室溫30 min，棄去不洗；⑤分別加入大鼠單克隆抗BrdU抗體（1 : 500）和小鼠單克隆抗NeuN抗體（1 : 300）、大鼠單克隆抗BrdU抗體（1 : 500）和小鼠單克隆抗GFAP抗體（1 : 400），37 ℃孵育1 h后，4℃孵育24 h；⑥0.01 mol.L-1PBS（pH 7.4）漂洗3次，每次5 min；⑦加入TRITC標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG（1 :100）和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1 : 100），室溫2 h；⑧0.01 mol.L-1PBS（pH 7.4）充分漂洗3次，每次20 min，用甘油緩沖液封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照切片除不加入大鼠單克隆抗BrdU抗體、小鼠單克隆抗NeuN抗體和小鼠單克隆抗GFAP抗體外，其余步驟同上。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞計(jì)數(shù)：每張腦片在高倍鏡下選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)BrdU+細(xì)胞及BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞占BrdU+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，作為該腦片BrdU+細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)值。每只大鼠選取3張腦片，間隔200 μm，取均值作為該只大鼠腦組織BrdU+細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)值。計(jì)算每組3只大鼠BrdU+/NeuN+和BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞占BrdU+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的均值，作為該組BrdU+細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梗死區(qū)周?chē)y狀體增殖細(xì)胞分化為神經(jīng)元及川芎嗪的作用

缺血21 d時(shí)，模型組梗死區(qū)周?chē)y狀體可見(jiàn)BrdU+/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞和BrdU+細(xì)胞，但BrdU+細(xì)胞分化為神經(jīng)元較少。川芎嗪各劑量組梗死區(qū)周?chē)y狀體亦可見(jiàn)BrdU+/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞及BrdU+細(xì)胞，但隨著劑量的增大，BrdU+/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)增加，中、高劑量組與低劑量組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），中、高劑量組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），但中、高劑量組組間比較沒(méi)有顯著性差異，見(jiàn)表1（*與模型組比較，#與川芎嗪低劑量組比較）。在假手術(shù)組相應(yīng)區(qū)域未見(jiàn)BrdU+/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞及BrdU+細(xì)胞。

表1 各組大鼠梗死區(qū)周?chē)y狀體BrdU+/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞Tab 1 BrdU+/NeuN+ cells around striatum infarction zone in rats of different groups

2.2 梗死區(qū)周?chē)y狀體增殖細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞及川芎嗪的作用

缺血21 d時(shí)，模型組梗死區(qū)周?chē)y狀體可見(jiàn)BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞及BrdU+細(xì)胞。川芎嗪各劑量組梗死區(qū)周?chē)y狀體可見(jiàn)BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞及BrdU+細(xì)胞，但各劑量組BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞ 0.05），與模型組比較無(wú)顯著性差異（表2）。在假手術(shù)組相應(yīng)區(qū)域未見(jiàn)BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞及BrdU+細(xì)胞。

表2 各組大鼠梗死區(qū)周?chē)y狀體BrdU+/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞Tab 2 BrdU+/GFAP+ cells around striatum infarction zone in rats of different groups

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在成體哺乳動(dòng)物腦內(nèi)存在神經(jīng)發(fā)生，各種刺激包括腦缺血可誘導(dǎo)已知的神經(jīng)發(fā)生區(qū)內(nèi)的細(xì)胞增殖、遷移和分化，以替代腦損傷后丟失和壞死的神經(jīng)細(xì)胞，有助于腦損傷的自身修復(fù)和功能恢復(fù)[8]。有研究顯示，中藥制劑華佗再造丸能促進(jìn)大鼠腦缺血灌注損傷后腦神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[9]。川芎嗪在臨床上可用于腦缺血急性期和恢復(fù)期的治療[10]，療效肯定。有研究結(jié)果顯示川芎嗪對(duì)腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ陀写龠M(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用，但對(duì)新生細(xì)胞的分化作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討川芎嗪對(duì)腦缺血后遷移至梗死周?chē)y狀體的新生細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，觀察川芎嗪對(duì)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的可能作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，腦缺血后21 d梗死區(qū)紋狀體新生細(xì)胞向神經(jīng)元表型分化，約25.09%新生細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元，而川芎嗪作用后新生細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元比例明顯增加，為45.23% ～ 69.51%，以川芎嗪中、高劑量組增加更為顯著。表明腦缺血后約1/4的新生細(xì)胞分化為神經(jīng)元，川芎嗪能促進(jìn)缺血周?chē)蟛糠中律?xì)胞分化為神經(jīng)元。提示腦缺血后梗死區(qū)周?chē)糠中律?xì)胞分化為成熟神經(jīng)元可能有助于補(bǔ)充損傷后所丟失的神經(jīng)元，但數(shù)量有限，川芎嗪能明顯促進(jìn)新生細(xì)胞分化為神經(jīng)元，可能與其促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)。張蓬勃等[11]研究結(jié)果顯示，局灶性腦缺血后，SVZ內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞遷移到缺血周?chē)⒈磉_(dá)成熟神經(jīng)元的標(biāo)志，增殖的室管膜細(xì)胞在原位分化為成熟神經(jīng)元，與本研究結(jié)果基本一致。

腦缺血除損傷神經(jīng)元外，星形膠質(zhì)細(xì)胞也受到損傷。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后遷移到梗死區(qū)周?chē)氖夜苣?室下區(qū)細(xì)胞分化成具有較為細(xì)長(zhǎng)突起的星形膠質(zhì)細(xì)胞，提示腦缺血后室管膜/室下區(qū)細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生可能有助于補(bǔ)充損傷所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞的丟失[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血21 d時(shí)，遷移至缺血紋狀體周?chē)腂rdU標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)GFAP，表明部分增殖細(xì)胞分化為膠質(zhì)細(xì)胞；川芎嗪作用后缺血紋狀體周?chē)脑鲋臣?xì)胞亦有部分分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，但與缺血模型組比較沒(méi)有顯著性差異。提示腦缺血后的新生細(xì)胞部分分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，以補(bǔ)充損傷丟失，而川芎嗪對(duì)新生細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。

目前腦缺血后新生細(xì)胞在梗死區(qū)周?chē)只难芯拷Y(jié)果不盡相同，有研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血后在胼胝體、缺血紋狀體和皮質(zhì)周?chē)蠦rdU標(biāo)記細(xì)胞，5周后胼胝體的BrdU標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白和谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶п的異構(gòu)體（GST-п）（少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志），其他BrdU+細(xì)胞表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志，但不表達(dá)神經(jīng)元的標(biāo)志，提示在這些情況下新生的神經(jīng)元并不能成熟或生存[12]。而本研究結(jié)果表明，腦缺血后室下區(qū)的增殖細(xì)胞經(jīng)多條途徑遷移到梗死區(qū)周?chē)募y狀體，并分化為成熟神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。這些結(jié)果的差異可能與缺血的嚴(yán)重程度、觀察的時(shí)間及所用大鼠種系不同有關(guān)。

研究顯示腦缺血損傷的作用機(jī)制涉及多種因素[13]，JAK/STAT通路[14]與腦缺血損傷有著緊密的聯(lián)系，影響著腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和分化等過(guò)程。本研究結(jié)果提示川芎嗪能促進(jìn)梗死區(qū)紋狀體新生細(xì)胞分化為神經(jīng)元，其作用機(jī)制可能與其對(duì)JAK/STAT通路的影響及抑制新生細(xì)胞凋亡、改善缺血周?chē)鷧^(qū)的環(huán)境有關(guān)，深層機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證。

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