胥志祥,劉 君,羅 鬧,吳昕昊,慕凱琳,潘學(xué)軍 (昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650500)

塑料制品(如玩具制造、醫(yī)療器材和食品包裝等)廣泛應(yīng)用于人類日常生活生產(chǎn)中,而鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)和雙酚 A(BPA)則常用于聚碳酸酯塑料制品的工業(yè)生產(chǎn).鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)作為一種增塑劑,在醫(yī)療用品和化妝品中普遍存在,由于其潛在的危害已被美國(guó)、歐盟以及中國(guó)列入優(yōu)先控制的污染物名單[1-2].DBP和BPA廣泛存在于水體、土壤及沉積物等環(huán)境介質(zhì)中[1],其中DBP在我國(guó)長(zhǎng)江、珠江等自然水體中普遍檢出,且其濃度高達(dá) 9.48～218.8μg/L[3].課題組前期研究也表明BPA是滇池流域環(huán)境介質(zhì)中普遍存在的烷基酚類內(nèi)分泌干擾物(EDCs)之一,其在滇池地表水、表層沉積物、環(huán)滇河流、污水處理廠進(jìn)水和滇池特有魚(yú)類高背鯽魚(yú)中的平均濃度分別為 71.25～366.45ng/L、2.33～132.48ng/g dw、35.28～1080.97ng/L、458.58～1324.66ng/L 和 10.1～83.5ng/g dw[4].然而,傳統(tǒng)的生物處理并不能完全將其有效去除,并通過(guò)直接作用或生物富集進(jìn)入生物體內(nèi),最終引起多種組織和器官的毒性反應(yīng)[5-7].由于長(zhǎng)期暴露于環(huán)境中,DBP和BPA在人體組織和體液中也被廣泛檢出,主要包括尿液、血液、母乳及孕期胎盤組織和羊水等,其濃度范圍為幾至幾十納摩爾[8-9].近期研究發(fā)現(xiàn)PAEs和BPA表現(xiàn)出類似的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)和毒性效應(yīng),如肝臟毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性及致癌性等[10-12].DBP和BPA作為兩種典型外源雌激素(XEs),其可通過(guò)基因組途徑和非基因組途徑,誘發(fā)多種癌癥的發(fā)生[13-14].然而,不同 XEs所產(chǎn)生影響的性質(zhì)、程度和信號(hào)通路方式等都可能不同,因此關(guān)于DBP和BPA不同暴露濃度下的聯(lián)合效應(yīng)有待開(kāi)展進(jìn)一步的研究.常用的毒性評(píng)價(jià)方法包括動(dòng)物模型和體外模型兩種,相比于動(dòng)物模型,體外研究中的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)具有高通量、低成本的優(yōu)點(diǎn),并可通過(guò)研究化合物誘導(dǎo)下細(xì)胞的增殖情況研究其雌激素效應(yīng)[15].

基于此,本研究選取經(jīng)典乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對(duì)象,探討DBP和BPA單一和聯(lián)合作用下的雌激素效應(yīng)和毒性效應(yīng),并從細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生以及雌激素受體(ER)表達(dá)等分子層面探討其可能的效應(yīng)機(jī)制,以期為環(huán)境中兩種XEs復(fù)合污染下的潛在環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)防提供理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)試劑：DBP、BPA 標(biāo)準(zhǔn)品(分析純,Sigma-Aldrich);胎牛血清(FBS)、含酚紅 RPMI 1640培養(yǎng)基、無(wú)酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基、PBS

緩沖溶液(Gibco);去激素胎牛血清(CD-FBS,Gemini Bio-products);青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶細(xì)胞消化液、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性試劑盒、ROS試劑盒、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡試劑盒(Beyotime).RNA 提取試劑盒(RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser)和熒光染料試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ)均購(gòu)于Takara公司.

儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱(Cell Culture, ESCO);生物安全柜(Airstream A2型II級(jí), ESCO);倒置熒光顯微鏡(IX73, OLYMPUS);酶標(biāo)儀(SpectraMax M5, Molecular Devices);微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(NanoDrop 1000, NanoDrop);流式細(xì)胞儀(Guava easyCyte 6HT-2L, Merck Millipore);實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(StepOnePlus, Thermo Fisher Scientific).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所,并使用含酚紅 RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含10% FBS、1% 青霉素-鏈霉素),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng).為了消除內(nèi)源雌激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,待細(xì)胞融合度＞70%,換為無(wú)酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液(含10% CD-FBS、1% 青霉素-鏈霉素)去激素培養(yǎng) 48h后用于后續(xù)研究.實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞代數(shù)＜20代[16].

1.2.2 溶液配制 分別稱取一定量的 DBP和BPA標(biāo)準(zhǔn)品并溶于DMSO中,配置成0.1mol/L儲(chǔ)備液于-20℃低溫、避光保存,臨用前使用無(wú)酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液(含5% CD-FBS)稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度,并保證DMSO濃度小于0.1%[17].

1.2.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 研究采用 MTT試劑盒測(cè)定不同濃度DBP和BPA,單一或聯(lián)合刺激不同時(shí)間的細(xì)胞活力.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 MCF-7細(xì)胞,采用 0.25%胰酶消化液消化后,以 10000/孔的細(xì)胞密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,并設(shè)置空白組、溶劑對(duì)照組和樣品處理組,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔.細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后,小心吸取上清液并使用PBS清洗孔板,于每孔分別加入 200μL含不同濃度DBP 和 BPA(10-9～10-4mol/L)的培養(yǎng)液;分別刺激24,48,72h后加入含MTT A液的細(xì)胞培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)4h;培養(yǎng)結(jié)束后,吸取孔內(nèi)MTT A液,并加入150μL MTT B液,充分溶解后使用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm下的OD值,其可間接反映活細(xì)胞數(shù)量.在單一刺激的基礎(chǔ)上,選取優(yōu)化后的細(xì)胞活力時(shí)間和物質(zhì)濃度,開(kāi)展其聯(lián)合效應(yīng)研究.細(xì)胞活力(CA)= (OD處理組—OD空白)/(OD對(duì)照組—OD空白) × 100%[18].

1.2.4 活性氧自由基測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以 5×104/孔的密度接種至 24 孔培養(yǎng)板貼壁培養(yǎng) 24h后加藥(同 1.2.3)處理 48h,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,移除細(xì)胞培養(yǎng)液并加入按照1：1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋后的濃度為 10μmol/L的DCFH- DA 熒光探針,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi) 37℃避光孵育 30min.用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA 探針,在酶標(biāo)儀下使用 488nm 波長(zhǎng)激發(fā),檢測(cè)525nm處發(fā)射的熒光強(qiáng)度,并根據(jù)熒光強(qiáng)度確定細(xì)胞內(nèi)ROS水平.

1.2.5 細(xì)胞周期和凋亡測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以3×105/孔的密度接種至6 孔培養(yǎng)板貼壁培養(yǎng)24h, 加藥(同1.2.3)處理48h,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,然后分別采用細(xì)胞周期(PI單染)和細(xì)胞凋亡(PI, Annexin V-FITC雙染)試劑盒,并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,使用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況.其中細(xì)胞周期分為 Sub-G0、G0/G1、S和G2/M,細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)= S+G2/M;細(xì)胞凋亡包括早期凋亡(Annexin V-FITC(+),PI(-))和晚期凋亡(Annexin V-FITC(+), PI(+)).

1.2.6 RT-QPCR測(cè)定細(xì)胞內(nèi)受體表達(dá) 雌激素核受體(ERα和ERβ)和G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPR30) mRNA轉(zhuǎn)錄水平采用RT-QPCR進(jìn)行分析.細(xì)胞加藥(同 1.2.3)處理后,采用 RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞RNA并測(cè)定其濃度;取1 μg RNA樣品,并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,于冰上配置反轉(zhuǎn)錄試劑,混合均勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA;采用熒光染料試劑盒,使用 StepOnePlus熒光定量PCR進(jìn)行mRNA的測(cè)定,每個(gè)樣本組設(shè)置3個(gè)平行樣.RT-QPCR 反應(yīng)條件為：(1)預(yù)變性： 95℃,30s,1個(gè)循環(huán);(2)PCR反應(yīng)：95 ℃, 5s→60 ℃, 30s,40個(gè)循環(huán) ;(3)溶 解 曲 線 ：95℃ ,5s→60℃ ,1min,1個(gè) 循環(huán).mRNA 表達(dá)水平采用 R=2-ΔΔCt公式計(jì)算[19],其中ΔΔCt =(Ct, target—Ct, β-actin)處理組—(Ct,target—Ct, β-actin)對(duì)照組.目的基因(ERα、ERβ 和GPR30)和內(nèi)參基因(β-actin)引物如表1所示.

表1 RT-QPCR引物系列Table 1 Primer series used in RT-QPCR

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),采用 Tukey法進(jìn)行多重比較,P＜0.05表示具有顯著性差異,用Origin 9.0繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化觀察

圖1 DBP和BPA暴露誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞形態(tài)變化(×100)Fig.1 Morphological changes of MCF-7cells treated with DBP and BPA

如圖1所示,在低濃度 DBP和 BPA刺激下,MCF-7細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生變化,但隨著刺激時(shí)間的增加,細(xì)胞密度也相應(yīng)增大,間接反映低濃度 DBP和 BPA可促進(jìn)細(xì)胞增殖.而在高濃度(10-4mol/L)刺激下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了相應(yīng)的變化,主要表現(xiàn)為：細(xì)胞處理 24h后細(xì)胞未完全伸展開(kāi)且細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,培養(yǎng) 72h后細(xì)胞貼壁率嚴(yán)重降低、部分細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞、細(xì)胞大量皺縮.

2.2 DBP和BPA對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響

圖2 DBP(A)和BPA(B)單一暴露對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響Fig.2 Individual effects of DBP (A) and BPA (B) on cell activity of MCF-7

DBP和BPA對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響如圖2和圖3所示,DBP和BPA可引起MCF-7細(xì)胞不同程度的增殖(毒性)效應(yīng).對(duì)于單一暴露,如圖2所示,隨著DBP和BPA刺激濃度的增加,細(xì)胞活力呈現(xiàn)“倒 U”型,即隨濃度的增加,細(xì)胞活力先增后減,并分別在濃度為10-6,10-7mol/L時(shí)其細(xì)胞活力最大,隨后其促增殖效應(yīng)降低,并均在 10-4mol/L時(shí)抑制細(xì)胞增殖.為此,分別選取 DBP(10-6,10-4mol/L)和BPA(10-7,10-4mol/L)開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn).

除此之外,細(xì)胞活力也呈現(xiàn)時(shí)間依賴性.總體上,隨著暴露時(shí)間的增加,溶劑對(duì)照組和加藥組的OD570均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),DBP和BPA分別遵循72h＞48h＞24h和72h≈48h＞24h的規(guī)律.DBP和BPA作用于MCF-7細(xì)胞24h并未出現(xiàn)增殖效應(yīng);當(dāng)作用 48h時(shí)除個(gè)別劑量外均表現(xiàn)為增殖效應(yīng),DBP和 BPA分別在濃度為 10-6mol/L和10-7mol/L時(shí)其增殖效應(yīng)最強(qiáng);隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),其累積效應(yīng)越來(lái)越明顯.相對(duì)而言,DBP的整體增殖效應(yīng)較 BPA 強(qiáng).綜合考慮,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取48h為最優(yōu)刺激時(shí)間.

圖3 DBP和BPA聯(lián)合暴露對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響Fig.3 Combined effects of DBP and BPA on cell viability of MCF-7

DBP和BPA聯(lián)合暴露對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖效應(yīng)如圖3所示.效應(yīng)疊加法(ES)是最常用聯(lián)合效應(yīng)評(píng)估模型,其多用于評(píng)估多種XEs聯(lián)合暴露下的綜合效應(yīng)[20].效應(yīng)疊加指數(shù)(ESI)為聯(lián)合暴露效應(yīng)與單一暴露效應(yīng)均值的比值,其中 ESI=1,ESI＞1和ESI＜1分別表示聯(lián)合效應(yīng)為加和、協(xié)同和拮抗.通過(guò)計(jì)算可得：ESIBPA(-7)+DBP(-6)、ESIBPA(-7)+DBP(-4)、 ESIBPA(-4)+DBP(-6)、ESIBPA(-4)+DBP(-4)分別為 1.0279±0.0156、1.0140±0.0119、0.9340±0.0174、0.9312±0.0238,由此可推斷低濃度BPA聯(lián)合DBP暴露,其刺激作用表現(xiàn)為加和作用;高濃度BPA聯(lián)合DBP暴露,其刺激作用表現(xiàn)為拮抗作用.

2.3 DBP和BPA對(duì)MCF-7細(xì)胞ROS的影響

如圖4所示,藥物刺激48h后,對(duì)于單一暴露,低濃度DBP和BPA暴露抑制ROS產(chǎn)生但與對(duì)照組無(wú)顯著差異,而高濃度暴露則顯著誘導(dǎo)ROS的生成.對(duì)于聯(lián)合暴露,低濃度聯(lián)合暴露相對(duì)于低濃度單一暴露,ROS生成有一定增加,但差異性不顯著;低濃度+高濃度聯(lián)合暴露相對(duì)于低濃度單一暴露無(wú)顯著差異,而相對(duì)于高濃度單一暴露其ROS生成則受到明顯抑制;高濃度聯(lián)合暴露能顯著誘導(dǎo)ROS的生成,但相對(duì)于單一暴露其ROS生成有所降低,間接表明高濃度DBP和BPA聯(lián)合暴露表現(xiàn)為拮抗作用.

圖4 DBP和BPA暴露對(duì)MCF-7細(xì)胞ROS生成的影響Fig.4 ROS formation in MCF-7cells treated with DBP and BPA

2.4 DBP和BPA對(duì)MCF-7細(xì)胞周期阻滯的影響

圖5 DBP和BPA暴露對(duì)MCF-7細(xì)胞周期分布的影響Fig.5 Cell cycle distribution in MCF-7cells treated with DBP and BPA

如圖5所示,對(duì)于單一暴露,低濃度 DBP和BPA刺激下,MCF-7細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞分布比例明顯高于對(duì)照組,表明低濃度暴露可促使細(xì)胞由G0/G1期向S期推進(jìn),促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成;高濃度DBP和BPA刺激時(shí),細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,而G2/M期細(xì)胞比例低于對(duì)照組,從而抑制細(xì)胞 DNA的合成.對(duì)于聯(lián)合暴露,相比于單一暴露,低濃度聯(lián)合暴露 G2/M 期細(xì)胞比例顯著增高,而高濃度聯(lián)合暴露細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期,與單一暴露和對(duì)照組均具有顯著差異.細(xì)胞增殖指數(shù)結(jié)果再次表明,DBP和BPA聯(lián)合暴露在低濃度下對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)表現(xiàn)為加和作用,而在高濃度下則表現(xiàn)為拮抗作用.

2.5 DBP和BPA對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

圖6 DBP和BPA暴露對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Cell apoptosis in MCF-7cells treated with DBP and BPA

如圖6所示,對(duì)于單一暴露,低濃度 DBP和BPA刺激下,凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性,表明其可抑制細(xì)胞凋亡;高濃度暴露則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且主要以誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡為主.對(duì)于聯(lián)合暴露,相比于單一暴露,低濃度聯(lián)合暴露也能抑制細(xì)胞早期凋亡并與對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但與單一暴露相比差異性不顯著;低濃度+高濃度聯(lián)合暴露可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,相對(duì)于單一高劑量暴露,其早期凋亡比例有所下降但差異性不顯著;高濃度聯(lián)合暴露也明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,相對(duì)于單一高劑量暴露,其誘導(dǎo)凋亡的比例有所降低,表明高濃度DBP和BPA對(duì)細(xì)胞凋亡也表現(xiàn)為拮抗作用.然而,高濃度聯(lián)合暴露時(shí)細(xì)胞壞死也明顯增多,這與前文細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果具有一致性.

2.6 DBP和 BPA對(duì) MCF-7細(xì)胞雌激素受體mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

如圖7所示,無(wú)論是單一暴露還是聯(lián)合暴露,低濃度 DBP和 BPA可誘導(dǎo) ERα和 GPR30 mRNA 轉(zhuǎn)錄,而高濃度暴露則可抑制 ERα mRNA轉(zhuǎn)錄.然而,DBP和BPA對(duì)ERβ mRNA的轉(zhuǎn)錄無(wú)顯著差異性.DBP和 BPA低濃度聯(lián)合暴露誘導(dǎo)ERα和GPR30mRNA轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)為加和作用,而高濃度聯(lián)合暴露抑制 ERα mRNA轉(zhuǎn)錄則表現(xiàn)為拮抗作用.

圖7 DBP和BPA暴露對(duì)MCF-7細(xì)胞ERα、ERβ和GPR30 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響Fig.7 mRNA transcription levels of ERα, ERβ and GPR30 in MCF-7cells treated with DBP and BPA

3 討論

傳統(tǒng)毒理學(xué)研究認(rèn)為,污染物達(dá)到一定暴露劑量即可對(duì)生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng),而低于安全閾值則不具有相應(yīng)的毒性;EDCs作為一類典型的污染物,其在低濃度下能產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[21].大多數(shù) EDCs具有雌激素活性,因此也被稱為XEs. XEs可通過(guò)ER信號(hào)通路發(fā)揮雌激素效應(yīng),而 MCF-7對(duì)雌激素活性物質(zhì)較為敏感,為此MCF-7細(xì)胞增殖試驗(yàn)?zāi)Ｐ统Ｓ糜谕庠次镔|(zhì)的雌激素活性評(píng)價(jià)[15].DBP和BPA作為2種典型的XEs,在塑料制品的生產(chǎn)和使用過(guò)程中被釋放到環(huán)境中,并在不同環(huán)境介質(zhì)中遷移和轉(zhuǎn)化,最終可能通過(guò)生物途徑或非生物途徑進(jìn)入生物體內(nèi),因此存在不可忽視的健康風(fēng)險(xiǎn).本研究 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DBP和BPA在低濃度下促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖,而在高濃度下則表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖的毒性效應(yīng),并且隨濃度的升高,其增殖率或抑制率也相應(yīng)的增加,總體呈現(xiàn)“倒U”型劑量-效應(yīng)關(guān)系,這與其他研究結(jié)果類似[22-23].與對(duì)照組相比,生理濃度 BPA刺激下,MCF-7細(xì)胞的增殖無(wú)顯著性差異,其他研究也得出類似結(jié)果[24],但這與部分研究中生理濃度BPA刺激細(xì)胞增殖存在出入[25].本研究中BPA在濃度為10-7mol/L時(shí)增殖效應(yīng)最強(qiáng),而其他研究發(fā)現(xiàn) BPA在濃度為10-5mol/L時(shí)增殖效應(yīng)最強(qiáng)[22,26],這可能是細(xì)胞培養(yǎng)條件和時(shí)間不同,或細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)雌激素受體缺失引起的細(xì)胞本身差異所致.本研究中DBP在濃度為10-6mol/L時(shí)其促增殖效應(yīng)最強(qiáng)并與 10-5mol/L下的細(xì)胞活力差不多,這與Kim等[27]研究發(fā)現(xiàn),DBP在濃度為10-5mol/L能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖具有相似性.

另外,細(xì)胞活力表現(xiàn)出時(shí)間依賴性.對(duì)于DBP,即無(wú)論是低濃度下的細(xì)胞增殖效應(yīng),或是高濃度下的細(xì)胞毒性效應(yīng),其效應(yīng)均表現(xiàn)為72h＞48h＞24h. Chen 等[23]研究表明,在 DBP 刺激下,細(xì)胞增殖效應(yīng)表現(xiàn)為 48h＞72h＞24h,這可能由于細(xì)胞培養(yǎng)方式差異性所致,即本研究在整個(gè)實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中均使用含CD-FBS的培養(yǎng)基,為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了必須的營(yíng)養(yǎng)元素,而 Chen等[23]的研究在加藥處理前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了無(wú)血清饑餓處理.對(duì)于 BPA,其增殖效應(yīng)表現(xiàn)為 72h≈48h＞24h,與DBP的刺激結(jié)果存在一定差異.

在單一細(xì)胞活力的基礎(chǔ)上,深入探討DBP和BPA復(fù)合污染下的聯(lián)合效應(yīng)更具有指導(dǎo)意義.在不同環(huán)境體系中,2種XEs的濃度配比不同,為此研究分別選取了 2種濃度下的 DBP (10-6和10-4mol/L)和 BPA (10-7和 10-4mol/L),研究采用ESI法分析了DBP和BPA的聯(lián)合作用方式,結(jié)果表明低濃度聯(lián)合暴露下其刺激作用表現(xiàn)為加和作用,而高濃度聯(lián)合暴露下其抑制作用表現(xiàn)為拮抗作用;Christen等[17]以MDA-kb2細(xì)胞為研究模型,并指出DBP和BPA具有抗雄激素作用,其在低劑量時(shí)表現(xiàn)為拮抗效應(yīng),但在高劑量時(shí)卻表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng),產(chǎn)生這一不同結(jié)果的原因可能是細(xì)胞、組織差異性所致.

MTT細(xì)胞活力只能從宏觀層面描述外源暴露對(duì) MCF-7細(xì)胞的增殖活性,而不能深層次闡述其(抗)增殖的根本原因.因此,本研究在細(xì)胞活力的基礎(chǔ)上,從ROS生成、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等分子層面探討其促進(jìn)增殖/誘導(dǎo)凋亡的本質(zhì)原因所在.ROS作為細(xì)胞內(nèi)第二信使,可通過(guò)DNA損傷、癌基因及周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)等方式刺激/抑制細(xì)胞增殖[28].大量研究表明內(nèi)源性雌激素或外源雌激素活性物質(zhì)暴露可誘導(dǎo) ROS生成,并最終調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖/凋亡過(guò)程[29-30].本研究中,低濃度DBP和BPA可促進(jìn)細(xì)胞增殖但其ROS生成無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性,而高濃度暴露則顯著誘導(dǎo)ROS生成并最終抑制細(xì)胞增殖,導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是高濃度暴露產(chǎn)生更多的ROS,可能引起DNA損傷或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡/壞死,從而產(chǎn)生增殖毒性[30].另外,XEs還可通過(guò)改變周期和凋亡相關(guān)基因(如CDKs、Cyclin D1、Bcl-2、Bax等)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖.Lee等[26]研究表明BPA可誘導(dǎo)Cyclin D1表達(dá)而抑制P21表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化,最終誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖.本研究中,低濃度DBP和BPA暴露下,細(xì)胞周期由G0/G1期向S期和G2/M期推進(jìn),從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,高濃度暴露下細(xì)胞周期則被阻滯于G0/G1期,這和Lee等的研究結(jié)果有相似性.除此之外,Kim 等[27]研究發(fā)現(xiàn) DBP可顯著促進(jìn) MCF-7增殖,并且能通過(guò)增加胞內(nèi)Bcl-2/Bax比例來(lái)抑制TAM誘導(dǎo)的凋亡.本研究中,低濃度DBP和BPA刺激下,凋亡細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組有所降低;高濃度暴露則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且以誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡為主.

由于BPA在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與內(nèi)源雌激素雌二醇(E2)類似,故可干擾多重內(nèi)分泌相關(guān)途徑,誘導(dǎo)各種疾病的發(fā)生和發(fā)展[11].Singh等[10]研究發(fā)現(xiàn)PAEs和BPA可同時(shí)與影響體內(nèi)89種基因/蛋白結(jié)合,誘導(dǎo)相關(guān)生理效應(yīng),其中就包括了兩種經(jīng)典核雌激素受體ERα和ERβ. ERα作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子,可通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)細(xì)胞周期因子或其他生長(zhǎng)因子影響細(xì)胞增殖,在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[26,31].不同類型的XEs與ER的親和力具有很大差異,且 ERα的促增殖效應(yīng)可被ERβ拮抗,最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖效應(yīng)[14].BPA 和DBP作為ERα/β的激動(dòng)劑,其可通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮雌激素效應(yīng),但兩者的活性 BPA＞DBP[9].本研究RT-QRCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度DBP和BPA均可抑制ERα mRNA水平的轉(zhuǎn)錄,而低濃度暴露則可促進(jìn) ERα mRNA 轉(zhuǎn)錄;然而,DBP和 BPA 對(duì)ERβ mRNA轉(zhuǎn)錄無(wú)顯著影響.同時(shí),低濃度XEs能通過(guò)GPR30激活非基因組途徑,誘導(dǎo)基因表達(dá)和細(xì)胞增殖[32].本研究也指出低濃度 DBP和 BPA可誘導(dǎo)GPR30mRNA的轉(zhuǎn)錄.Lillo等[24]研究也表明,盡管生理濃度下(10-8mol/L)的BPA不能明顯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖和雌激素效應(yīng)基因的表達(dá),但其可通過(guò)膜受體信號(hào)通路直接調(diào)節(jié) SOX2轉(zhuǎn)錄活性以增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞活性,從而維持癌癥的發(fā)展.Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)低濃度 DBP(10-8mol/L)可顯著誘導(dǎo) p-ERα的表達(dá)而降低ERβ的表達(dá),最終促進(jìn) MCF-7細(xì)胞的增殖.Song等[33]表明10-8mol/L濃度的BPA可通過(guò)ERK1/2/ERRγ通路誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖.Lei等[30]研究指出低劑量BPA衍生物硫代二苯酚(TDP)通過(guò)ERα和 GPR30信號(hào)通路之間的串?dāng)_作用增加胞內(nèi)ROS和Ca2+水平,激活PI3K/AKT和ERK信號(hào)通路,最終誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖.為此,關(guān)于經(jīng)典雌激素核受體和膜受體的交互作用在 XEs誘導(dǎo)細(xì)胞雌激素效應(yīng)方面有待進(jìn)一步研究.

本研究采用體外模型研究了 DBP和 BPA的聯(lián)合效應(yīng),這為開(kāi)展多種 XEs在不同濃度聯(lián)合暴露產(chǎn)生的效應(yīng)研究提供了指導(dǎo).然而,環(huán)境介質(zhì)中同時(shí)存在多種酞酸酯類和烷基酚類XEs,其可能通過(guò)不同的作用模式(相加、協(xié)同和拮抗)發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng).此外,XEs在生命活動(dòng)代謝過(guò)程中,會(huì)產(chǎn)生各種不同活性的代謝中間產(chǎn)物,這些代謝產(chǎn)物的生物效應(yīng)也有待開(kāi)展進(jìn)一步研究,然而體外研究模型則很難模擬 XEs在生物體內(nèi)的這一復(fù)雜生物效應(yīng).為此,今后的研究應(yīng)將體外模型和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,開(kāi)展多種XEs的綜合效應(yīng)研究,以便更好地為環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)防提供指導(dǎo).

4 結(jié)論

4.1 對(duì)于單一暴露,低濃度DBP和BPA可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖,而高濃度DBP和BPA則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

4.2 對(duì)于聯(lián)合暴露,DBP和BPA低濃度下其聯(lián)合作用模式表現(xiàn)為加和作用,而在高濃度下表現(xiàn)為拮抗作用.

4.3 低濃度DBP和BPA單一或聯(lián)合暴露促進(jìn)細(xì)胞增殖,其與推進(jìn)細(xì)胞周期從G0/G1期向S期、G2/M期轉(zhuǎn)化,以及誘導(dǎo)ERα和GPR30表達(dá)相關(guān).

4.4 高濃度DBP和BPA單一或聯(lián)合暴露可通過(guò)ROS增加、G0/G1期阻滯、細(xì)胞早期凋亡增加和ERα mRNA轉(zhuǎn)錄抑制等方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

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