吳 雙,秦華明,葉錦韶 (暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院,廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)材料工程技術(shù)研究中心,廣州市環(huán)境暴露與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 廣東 510632)

非甾體抗炎藥(NSAIDs)在全世界得到廣泛的應(yīng)用,但也是一類日益受到人們關(guān)注的新興污染物,由其引起的環(huán)境污染問(wèn)題受到越來(lái)越多的關(guān)注[1].其中雙氯芬酸(DCF)通常被公認(rèn)為“世界上最受歡迎的止痛藥”,是最常用的NSAIDs,主要以鈉鹽的形式存在,全球消費(fèi)量已達(dá)上千噸[2-3].DCF是一種持久性有毒污染物[4],具有很強(qiáng)的環(huán)境污染性,歐盟早在2000年就將DCF列為環(huán)境中優(yōu)先控制的污染物[5],它們可以通過(guò)多種途徑進(jìn)入環(huán)境,對(duì)水生生物造成嚴(yán)重的毒害作用[6],并且通過(guò)食物鏈的富集會(huì)對(duì)其他生物和人體健康造成重大威脅,有研究表明,DCF對(duì)生物體產(chǎn)生毒性[7-10],誘導(dǎo)小鼠腎細(xì)胞凋亡[11],上調(diào)促炎細(xì)胞因子,并誘導(dǎo)腎組織中 NF-κB 的活化[12].有研究結(jié)果表明由于線粒體功能障礙導(dǎo)致的ATP合成損傷可能是 DCF引起肝細(xì)胞毒性的關(guān)鍵原因[13-15].由于雙氯芬酸鈉的用量大而降解效率低[16-17],其殘留物進(jìn)入環(huán)境后對(duì)環(huán)境生態(tài)和人體健康存在風(fēng)險(xiǎn),但目前對(duì)雙氯芬酸鈉毒理性質(zhì)并未十分明確, 尚無(wú)將 iTRAQ技術(shù)應(yīng)用于雙氯芬酸的抑菌機(jī)理的研究報(bào)道,尚需進(jìn)行更深入的研究.為此,本文選用模式微生物菌種革蘭氏陽(yáng)性菌蘇云金芽胞桿菌為研究對(duì)象,基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[18],檢測(cè)鑒定了蘇云金芽胞桿菌在雙氯芬酸鈉脅迫下差異表達(dá)的蛋白質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,以期揭示雙氯芬酸鈉對(duì)蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞毒性的分子機(jī)制.本研究對(duì)于深入評(píng)價(jià)雙氯芬酸鈉對(duì)生態(tài)安全及人類健康的影響具有參考意義.

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

B.thuringiensisGIMCC1.817為本實(shí)驗(yàn)室所有,儲(chǔ)存在中國(guó)廣東省微生物所.雙氯芬酸鈉購(gòu)自Sigma Aldrich(St.Louis, MO, USA).牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L.無(wú) 機(jī) 鹽 體 系 (MSM)：K2HPO4·12H2O 4g/L 、KH2PO42g/L、(NH4)2SO420g/L、KCl 2g/L、MgSO41g/L.

1.2 菌體培養(yǎng)

將保存在斜面上的蘇云金芽孢桿菌接種到100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置于 30 ℃、100r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)24h.隨后,3500r/min離心10min,然后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞3次.

1.3 生長(zhǎng)抑制曲線的測(cè)定

將 1μmol/μL的雙氯芬酸鈉溶液 20μL和濃度為1g/L的蘇云金芽孢桿菌加入裝有20mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)體系的 50mL錐形瓶中,置于 30℃、100r/min的搖床中震蕩培養(yǎng).以不使用雙氯芬酸鈉溶液的培養(yǎng)體系(其他條件不變)作為對(duì)照組.分別在培養(yǎng) 4,8,12,24,36,48,60,72,80h時(shí)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)600nm處測(cè)定OD值并繪制生長(zhǎng)曲線.

1.4 蛋白質(zhì)提取

同生長(zhǎng)抑制曲線測(cè)定培養(yǎng)條件,在雙氯芬酸鈉處理后,24h后3500r/min離心10min并用磷酸鹽緩沖溶液洗滌菌體 3次進(jìn)行全蛋白提取：將菌體懸浮在 1mL裂解液中,裂解液配方為15mmol/L Tris-HCl pH7.4、7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS,使用前加 2mmol/L IPG緩沖液,1mmol/LDTT和1mmol/L PMSF混合物,冰上放置,每隔2min渦旋10s.樣品在液氮中凍融3次,每次 15min,然后超聲破碎 20min,超聲破碎后的樣品加1μL核酸酶冰上放置30min.4℃, 12000r/min離心 30min,取上清為總蛋白,使用 Bradford方法測(cè)量蛋白質(zhì)的濃度[19].

1.5 蛋白質(zhì)還原和酶解

用10mol/L DTT或2μL還原劑將每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)在37℃下還原1h.用1μL半胱氨酸鎖定劑將半胱氨酸在室溫下封閉 10min.將蛋白質(zhì)樣品加入 10KD(Amicon Ultra-0.5)超濾離心管中,用 100μL溶解緩沖液洗滌,12000r/min離心20min,重復(fù) 3次.除去收集管中的液體后,37℃下用 50μL 胰蛋白酶(Promega,V5280,USA)將過(guò)濾管中的樣品酶解14h過(guò)夜.隨后,12000r/min離心20min,將 1μg胰蛋白酶加入到過(guò)濾管中二次酶解 2h.離心后,收集管中的液體,使用 Bradford方法測(cè)定肽段的濃度[20].

1.6 iTRAQ標(biāo)記和脫鹽

根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū),用 iTRAQ reagent多重試劑盒(Sigma,PN 4352135,USA)標(biāo)記肽段.將150μL的乙醇加入到116和117iTRAQ試劑中,然后渦旋并用迷你離心機(jī)將溶液離心至管底.將肽段轉(zhuǎn)移到新管后,用116的iTRAQ試劑標(biāo)記對(duì)照組肽段,117的iTRAQ試劑標(biāo)記處理組肽段,2h后向每個(gè)樣品中加入100μL的水以終止反應(yīng).將1μL 溶液通過(guò) ABI 4800MALDI TOF/TOF(Applied Biosystems,Foster City,CA)以檢測(cè)標(biāo)記效率.隨后,將標(biāo)記的樣品與 Strata-X(Phenomenex, USA)混合,渦旋,脫鹽,并通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析(SCX)分離,標(biāo)記的肽段在真空濃縮儀中冷凍干燥.

1.7 蛋白質(zhì)的LC-ESI-MS/MS分析

用溶液(2%乙腈,0.1%甲酸)復(fù)溶樣品,12000r/min離心 20min,使用 NanosprayIII源(AB SCIEX)裝有 AB SciexTripleTOF 5600質(zhì)譜儀(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)檢測(cè),質(zhì)譜檢測(cè)方式為MS/MS掃描.將鑒定的蛋白質(zhì)在 NCBI(http：//www.ncbi.nlm)進(jìn)行內(nèi)部 BLAST檢索匹配.使用 ProteinPilot TM Software 4.5(AB SCIEX)進(jìn)行Uniprot Database中的蛋白質(zhì)鑒定和相對(duì)iTRAQ定量.對(duì)于iTRAQ定量,通過(guò)Pro GroupTM算法自動(dòng)選擇肽段,計(jì)算報(bào)告峰面積,誤差因子和 P值.采用反向數(shù)據(jù)庫(kù)搜索來(lái)估計(jì)肽段蛋白質(zhì)陽(yáng)性結(jié)果錯(cuò)誤率 FDR.使用不低于 95%的肽段置信水平,變化倍數(shù) 1.2倍以上作為鑒定標(biāo)準(zhǔn),認(rèn)為二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

1.8 生物信息學(xué)分析

將所得到的蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProt)(http：//www.uniprot.org/)得到基因列表,利 用 PANTHER 分 類 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http：//www.pantherdb)對(duì)變化倍數(shù) 1.2倍以上的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行 GO分析(用于注釋鑒定的蛋白質(zhì)的生物過(guò)程,分子功能和細(xì)胞組分信息).通過(guò)STRING(http：//www.string-db.org/)構(gòu) 建 差 異 表達(dá)蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò),使用 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.genome.jp/kegg/pathway)對(duì)鑒定到的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行匹配,挖掘由差異蛋白質(zhì)表達(dá)變化導(dǎo)致發(fā)生改變的重要代謝信號(hào)通路(P＜0.05,即顯著富集)[21].

2 結(jié)果與討論

2.1 雙氯芬酸鈉對(duì)蘇云金芽孢桿菌生長(zhǎng)和繁殖的影響

如圖1所示,由生長(zhǎng)抑制曲線,處理組的 OD值從4h后持續(xù)比對(duì)照組OD值低,48h內(nèi)對(duì)照組OD值較穩(wěn)定,而處理組OD值一直處于下降趨勢(shì).可以看出雙氯芬酸鈉對(duì)蘇云金芽孢桿菌的生長(zhǎng)和繁殖具有明顯的抑制作用.

圖1 雙氯芬酸鈉對(duì)蘇云金芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制Fig.1 Inhibition of the growth of Bacillus thuringiensis by diclofenac sodium

2.2 蛋白質(zhì)的鑒定

使用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)對(duì)蘇云金芽孢桿菌總蛋白進(jìn)行檢測(cè),并用Mascot軟件共鑒定差異倍數(shù)大于 1.2、P值小于 0.05的差異蛋白質(zhì)有 17種,其中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)5種,表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)12種.這些蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息列見(jiàn)表1.

表1 雙氯芬酸鈉脅迫下蘇云金芽孢桿菌差異表達(dá)蛋白Table 1 Differential expressed proteins in Bacillus thuringiensis with diclofenac sodium treatment

續(xù)表1

2.3 蛋白質(zhì)GO功能注釋

通過(guò)蛋白質(zhì) GO 分析(圖2)可以看出,得到的17種蛋白質(zhì)中對(duì)應(yīng)到生物過(guò)程,其中10種蛋白參與代謝過(guò)程,占58.82%,其次有5種蛋白參與細(xì)胞過(guò)程,占29.41%,主要涉及到酰基輔酶A脫氫酶、尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、核糖體蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白.細(xì)胞組分類以細(xì)胞部分和細(xì)胞器為主,分別占62.5%和25%,其中細(xì)胞部分主要包括翻譯延伸因子、核苷酸激酶、磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶.有16種差異蛋白對(duì)應(yīng)分子功能,涉及結(jié)合(如酰基輔酶A脫氫酶、5'-甲基硫代腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶、50S核糖體蛋白)、催化活性(如寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白、核苷酸激酶、丙酮酸脫氫酶)、結(jié)構(gòu)分子活性、翻譯調(diào)節(jié)器活動(dòng)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性.

圖2 差異表達(dá)蛋白的GO分析Fig.2 Protein GO analysis of Bacillus thuringiensis under diclofenac sodium stress

2.4 KEGG代謝通路分析

使用KEGG pathway對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)可能參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與的代謝通路中,其中上調(diào)蛋白,Upp涉及DNA和RNA的合成,核糖體蛋白R(shí)plM和RplL參與蛋白質(zhì)的合成;下調(diào)蛋白,Prs、MtnN和PdhA分別參與磷酸戊糖途徑、甲硫氨酸代謝和丙酮酸代謝,RpoA參與DNA和RNA的合成(圖3),AtpH和OppF分別參與氧化磷酸化和群體感應(yīng).總體來(lái)看,差異蛋白質(zhì)主要參與的代謝通路包含細(xì)胞核酸代謝、胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和能量代謝,這與 GO 功能注釋結(jié)果類似,研究證實(shí),雙氯芬酸鈉脅迫主要在細(xì)胞核心代謝網(wǎng)絡(luò)能量代謝中抑制 ATP合成,蛋白質(zhì)合成中在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)功能蛋白質(zhì)的合成造成了障礙,造成了有氧代謝受阻,直接影響到乙酰輔酶 A的形成,繼而影響三羧酸循環(huán)和隨之的能量代謝,隨之影響細(xì)胞中絕大部分的代謝活動(dòng),從而使細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出受抑制.

2.5 差異表達(dá)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及其功能

通過(guò) STRING系統(tǒng)構(gòu)建差異表達(dá)蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖4),包含 10個(gè)存在密切關(guān)系的相互作用蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和位于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)周邊的7個(gè)離散蛋白質(zhì).該蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)以RpoA、RplM、RplL、Tuf、InfA 5個(gè)蛋白連接度較高,屬于網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn).

圖3 差異蛋白質(zhì)代謝通路Fig.3 Analysis of differential protein metabolism pathway

圖4 差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Interaction between differential expressed proteins

芽孢桿菌的一個(gè)重要特性是能夠產(chǎn)生對(duì)不利條件具有特殊抵抗力的芽孢,而在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中又能夠重新萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞.SpoVR是芽孢形成過(guò)程中的關(guān)鍵酶[22-23],參與芽孢皮質(zhì)的形成[24].此外,微生物在脅迫耐受中生物膜的形成會(huì)顯著加強(qiáng)[25-26],5'-甲硫基腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(MtnN)間接減少生物膜的形成[27].本研究中,芽孢形成蛋白 SpoVR 上調(diào),說(shuō)明雙氯芬酸鈉可能誘導(dǎo)了蘇云金芽孢桿菌的芽孢形成以抵抗不利環(huán)境.同時(shí),菌體細(xì)胞通過(guò)下調(diào)MtnN加強(qiáng)了蘇云金芽孢桿菌生物膜的形成,以此來(lái)降低雙氯芬酸鈉對(duì)菌體細(xì)胞的毒性.

在細(xì)胞核酸代謝中,核糖磷酸焦磷酸激酶(Prs)可將 ATP和核糖 5磷酸 R5P催化轉(zhuǎn)化為AMP和磷酸核糖焦磷酸(PRPP),PRPP是眾多生化反應(yīng)的共同底物,作為關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)代謝物,對(duì)于嘌呤、嘧啶和吡啶核苷酸的合成具有重要意義[28-30].在嘧啶的合成途徑中,PRPP是尿苷一磷酸合成酶 UMPS的重要輔因子.PRPP也為合成吡啶核苷酸 NAD+和 NADP+提供了核苷部分.除此之外,PRPP也在嘌呤的補(bǔ)救合成途徑中確保了嘌呤堿基和核苷的有效重新利用,該補(bǔ)救途徑合成PRPP僅需1mol ATP,而從頭合成1mol核苷酸需消耗 7mol ATP[31].本研究中,雙氯芬酸鈉處理后,細(xì)胞中Prs的下調(diào)不僅對(duì)正常的DNA及RNA的合成代謝造成了負(fù)面影響,也可能對(duì)能量代謝產(chǎn)生影響.

在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成過(guò)程中,核糖體蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)合成中起關(guān)鍵作用,包括催化肽鍵形成活性,提供G蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)(輔助起始、延伸和終止),幫助合成后的蛋白質(zhì)正確折疊等[32-33]. RNA聚合酶亞基α(RpoA)是RNA聚合酶在細(xì)菌中高度保守并且是基因轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵酶,它有助于穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,啟動(dòng)子識(shí)別,并調(diào)節(jié)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄.抑制RpoA會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶復(fù)合物不穩(wěn)定,從而會(huì)直接干擾 mRNA的形成

[34-35].除此之外,核糖體蛋白R(shí)plM和RplL也參與蛋白質(zhì)的合成.本研究中,菌體細(xì)胞中 RpoA、RplM和RplL均表現(xiàn)出下調(diào),說(shuō)明雙氯芬酸鈉脅迫在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)功能蛋白質(zhì)的合成造成了障礙.

三羧酸循環(huán)是生物細(xì)胞最重要的基礎(chǔ)代謝過(guò)程之一.細(xì)胞丙酮酸脫氫酶(PDH)復(fù)合體(PdhA、PdhB、PdhC、PdhD)的 E1組分亞單位α(PdhA)將糖酵解/葡萄糖醛酸代謝與三羧酸循環(huán)連接,其功能是產(chǎn)生乙酰輔酶A,乙酰輔酶A不僅參與各種生物合成途徑,如氨基酸、脂肪酸、聚酮化合物,并作為生長(zhǎng)信號(hào)起到關(guān)鍵作用[36],還可以幫助細(xì)胞在三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生 NAD+/NAD,作為細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)供給的信號(hào)[37].PdhA是催化丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)的起始酶,在整個(gè)氧化脫羧反應(yīng)過(guò)程中,其所催化的反應(yīng)是唯一的不可逆步驟.PdhA的下調(diào),使得蘇云金芽孢桿菌的有氧代謝受阻,直接影響到乙酰輔酶A的形成,繼而影響三羧酸循環(huán)和隨之的能量代謝[34],隨之影響細(xì)胞中絕大部分的代謝活動(dòng),從而使細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出受抑制.

生物細(xì)胞的能量代謝是整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的核心,在有氧呼吸中,能量代謝主要產(chǎn)生過(guò)程是三羧酸循環(huán)釋放出的電子經(jīng)過(guò)電子傳遞鏈而產(chǎn)生.NadK(NAD+激酶)催化NAD+進(jìn)行磷酸化反應(yīng)生成NADP+,在這個(gè)過(guò)程中與ATP的生成相偶聯(lián),在細(xì)胞能量代謝中扮演關(guān)鍵角色.FadE是?；o酶A脫氫酶(ACAD)的一種,?；o酶A脫氫酶是含有黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的酶家族,黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔因子,催化酰基輔酶 A在脂肪酸和一些氨基酸分解代謝第一步中關(guān)鍵的酶[38],ACAD將電子從其相應(yīng)的輔酶A酯底物轉(zhuǎn)移到電子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ETF),伴隨 ATP的生成[39].無(wú)論是NAD還是FAD介導(dǎo)的電子傳遞,最終ATP的生成需ATP合成酶的催化才能完成,而F0F1-ATP合成酶是與ATP合成相關(guān)的主要膜蛋白復(fù)合物,其中AtpH(ATP合成酶亞基delta)是 F0F1-ATP合成酶中 F1的主要組成部分[40],AtpH下調(diào)直接影響到 ATP的合成.有文獻(xiàn)報(bào)道[11-13]真核細(xì)胞中,ATP合成損傷可能是雙氯芬酸鈉引起肝細(xì)胞毒性的關(guān)鍵原因.在本研究中,也觀察到與ATP合成直接相關(guān)的AtpH及間接相關(guān)的NadK、PdhA均下調(diào)表達(dá),說(shuō)明雙氯芬酸鈉也抑制蘇云金芽孢桿菌的 ATP合成.但同時(shí)也發(fā)現(xiàn),FadE作為與 ATP合成相關(guān)蛋白,卻表現(xiàn)出上調(diào),意味著雙氯芬酸鈉對(duì)蘇云金芽孢桿菌甚至對(duì)原核生物的ATP代謝的影響是非常復(fù)雜的,需要進(jìn)一步深入研究.另外,在能量合成受損的情況下,催化反應(yīng)需消耗ATP的Prs也相應(yīng)下調(diào),使得菌體細(xì)胞嘌呤、嘧啶和吡啶核苷酸合成代謝所需的PRPP轉(zhuǎn)向消耗更少能量的補(bǔ)救途徑進(jìn)行,以適應(yīng)受脅迫的環(huán)境.

3 結(jié)論

3.1 在雙氯芬酸鈉的處理下,蘇云金芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制.

3.2 蛋白質(zhì)組分析共檢測(cè)到108個(gè)蛋白,其中有17個(gè)差異表達(dá)蛋白,包括5個(gè)上調(diào)蛋白和12個(gè)下調(diào)蛋白,主要涉及到脂肪酸生物合成、DNA和RNA的合成、氧化磷酸化、丙酮酸代謝、糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和氨基酸代謝等代謝通路.

3.3 差異表達(dá)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中,RpoA、RplM、RplL、Tuf、InfA 5個(gè)蛋白連接度較高,屬于網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),可能起著重要的調(diào)控作用.

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