卜令君,周石慶,施 周,王 濤,衣啟航,孫聚龍 (湖南大學(xué)土木工程學(xué)院,建筑安全與節(jié)能教育部重點實驗室,湖南 長沙 410082)

農(nóng)業(yè)化肥的流失、生活污水的過度排放等人類活動使得大量氮、磷流入湖泊、河流及海灣,在全球范圍內(nèi)造成了嚴重的水體富營養(yǎng)化,藻類爆發(fā)現(xiàn)象也隨之頻繁發(fā)生[1-2].藻類爆發(fā)及其衍生物的釋放等問題給人類生產(chǎn)生活及自來水廠的正常運行帶來了巨大影響[3],因此,如何有效抑制藻類爆發(fā)已成為世界性難題.化學(xué)修復(fù)方法由于見效快,目前被廣泛應(yīng)用于控制藻類爆發(fā)[4].但有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),該類方法雖然能有效抑制藻類生長,但在滅活藻細胞的過程中會伴隨有胞內(nèi)有機物的釋放,有可能對機體健康和生態(tài)平衡造成更大的危害,這類胞內(nèi)有機物包括藻毒素、嗅味物質(zhì)等受到了廣泛關(guān)注[3,5-7].

在藻類釋放的眾多衍生物中,藻源性內(nèi)毒素作為一種外源性致熱源,未能引起國內(nèi)外研究者足夠的關(guān)注.藻源性內(nèi)毒素是藍藻細胞壁的脂多糖復(fù)合物,主要由藻類死亡后釋放[8-10].內(nèi)毒素一般由3部分組成：類脂A、核心寡糖以及O-特異多糖,其中類脂A可以通過一系列反應(yīng)激活炎癥信號,是其毒性中心[11].內(nèi)毒素可通過血液、呼吸、胃腸等暴露途徑使人體患上各種疾病[9],研究發(fā)現(xiàn)將 0.1～0.5ng/kg內(nèi)毒素進行靜脈注射即可引起人體發(fā)熱反應(yīng)[12];空氣中內(nèi)毒素濃度達到1000～2000ng/m3時則可能使人體患上有機粉塵毒性綜合征[13].目前我國相關(guān)文件中規(guī)定的血液透析用水及制藥用水對內(nèi)毒素濃度的限制分別為1.0,0.25EU/mL[14].

調(diào)查發(fā)現(xiàn)芬蘭某水源在藻類爆發(fā)時內(nèi)毒素活性可達 20～38000EU/mL(1EU/mL = 0.1ng/mL),嚴重威脅著機體健康[15].除此之外,內(nèi)毒素近年來在各地水源水、飲用水中被頻繁檢出[14,16],更是為水處理工作者敲響了警鐘.目前已經(jīng)有研究人員考察了常規(guī)水處理工藝、活性炭吸附、液氯、高錳酸鉀、中壓汞燈等對內(nèi)毒素的去除效果[14,17-18],但其機理及動力學(xué)還有待進一步的研究.

由于藻細胞凋亡解體之后會釋放大量內(nèi)毒素,因此化學(xué)修復(fù)除藻的過程中必然會伴隨有內(nèi)毒素的釋放.本文選用了 4種常見的化學(xué)除藻劑(次氯酸鈉、雙氧水、硫酸銅及敵草隆),對比了其對藻類的滅活效果及過程中內(nèi)毒素的釋放和降解,以期為高藻水源水的處理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料及器具

銅綠微囊藻藻種(FACHB-912)購自中科院武漢水生所,培養(yǎng)于 BG-11培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱溫度設(shè)為25℃,光照周期為12h光照-12h黑暗.

BG-11培養(yǎng)基所需藥劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司.顯色基質(zhì)鱟試劑盒、無熱原試管、無熱源移液槍頭、內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標準品購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司.其他所用玻璃器皿清洗后于250℃干烤60min以上.

1.2 試驗方法

本研究所采用藻細胞溶液濃度約為 1.5×106個/mL.取 100mL待處理藻溶液,分別投加 0.10,0.25,0.50mg/L次氯酸鈉,0.10,0.25,0.50mmol/L雙氧水,0.5,1.0,2.5μmol/L 硫酸銅,5,10,25μmol/L 敵草隆,充分混勻后,置于光照恒溫培養(yǎng)箱中,分別于24,48,96,168h取樣,測定其 OD680及內(nèi)毒素含量,每個樣品測試2次取平均值.

1.3 分析方法

藻細胞濃度由紫外-可見光分光光度計(U-3900, Hitachi)于波長680nm處測得.

內(nèi)毒素含量利用顯色基質(zhì)鱟試劑盒進行定量測定.鱟試劑為鱟科動物東方鱟的血液変形細胞溶解物的冷凍干燥品,在溫育(37℃)條件下,內(nèi)毒素可與鱟試劑發(fā)生一系列酶促反應(yīng),激活凝固酶原形成凝固酶,凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì),使其分解為多肽和黃色的對硝基苯胺(λmax=405nm),對硝基苯胺的生成量與內(nèi)毒素濃度成正比,但為了避免待測樣品本身的顏色對405nm處吸收峰的干擾,遂利用偶氮化試劑將對硝基苯胺染成玫瑰紅色(λmax=545nm)再使用紫外-可見光分光光度計(U-3900, Hitachi)進行測定.采用內(nèi)毒素標準樣品作標準曲線(R2＞0.98),并采用內(nèi)毒素檢查用水作陰性對照,該方法檢測限可達0.01EU/mL.

2 結(jié)果與討論

2.1 次氯酸鈉對藻類活性及內(nèi)毒素的影響

次氯酸鈉由于其強氧化性是目前飲用水廠最常用的消毒劑,可有效殺滅水中的細菌,同樣也常被用來滅活水中的藻類.一般飲用水中余氯含量不超過0.5mg/L即對人體沒有危害,因此,本文分別選取0.10,0.25,0.50mg/L(以Cl2計)的次氯酸鈉溶液對水中的銅綠微囊藻進行滅活.如圖1(a)所示,在未加次氯酸鈉的控制樣中,藻細胞在168h內(nèi)穩(wěn)步繁殖生長,其OD680由0.0890逐步增至 0.2735;低濃度(0.10mg/L)的次氯酸鈉雖未能完全去除溶液中的藻細胞,但有效抑制了藻細胞的生長,其OD680在168h后逐漸降至0.0444.0.25,0.50mg/L的次氯酸鈉對銅綠微囊藻的去除效果顯著,168h后其溶液吸光度分別降至 0.0046和0.0041,溶液幾乎呈透明狀.

其內(nèi)毒素含量的變化情況如圖1(b)所示.控制樣中內(nèi)毒素含量1周內(nèi)均在80EU/mL上下波動,沒有明顯變化,這是因為所使用的藻溶液尚未進入衰亡期(圖1(a)),而內(nèi)毒素主要是由死亡的細胞釋放.內(nèi)毒素含量增長最明顯的是經(jīng)0.10mg/L次氯酸鈉處理后的藻溶液,168h內(nèi)其內(nèi)毒素含量持續(xù)增長,且最終激增至 1564.78EU/mL;而經(jīng)較高濃度(0.25,0.50mg/L)次氯酸鈉處理后的藻溶液中雖然藻細胞死亡數(shù)目更多,但內(nèi)毒素含量反而只有 872.14,852.03EU/mL,這可以歸因為次氯酸鈉的強氧化性,導(dǎo)致內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)在處理過程中被破壞,這與Anderson等[17]的研究結(jié)果一致.

圖1 次氯酸鈉對藻類活性(a)和內(nèi)毒素含量(b)的影響Fig.1 Effect of sodium hypochlorite on the activity of algae (a) and concentration of endotoxins (b)

2.2 雙氧水對藻類活性及內(nèi)毒素的影響

雙氧水由于其氧化性較強且產(chǎn)物綠色環(huán)保,被越來越多的用于藻類爆發(fā)時藻細胞的滅活[19].有研究表明,在滅藻過程中,若雙氧水投量小于19.7mg/L(約 0.58mmol/L),便不會對一般水生動物的健康造成危害[20],因此,本文分別選取 0.10,0.25,0.50mmol/L的雙氧水溶液對水中的銅綠微囊藻進行滅活.如圖2(a)所示,藻細胞活性在經(jīng)不同濃度雙氧水處理后受到了不同程度的破壞,其溶液吸光度均持續(xù)下降,經(jīng)0.10,0.25,0.50mmol/L雙氧水處理168h后的藻溶液在680nm處的吸光度由0.089分別降至0.0133、0.0027和0.0054.

圖2 雙氧水對藻類活性(a)和內(nèi)毒素含量(b)的影響Fig.2 Effect of hydrogen peroxide on the activity of algae(a) and concentration of endotoxins (b)

雙氧水處理過程中內(nèi)毒素的含量變化如圖2(b)所示.與次氯酸鈉類似,內(nèi)毒素釋放最顯著的是經(jīng)0.25mmol/L雙氧水處理后的藻溶液,其內(nèi)毒素濃度由初始的 55.30EU/mL分別漲至 48h和96h的1038.26,1750.35EU/mL;168h時又稍微降至1706.22EU/mL.而經(jīng)0.10mmol/L和0.50mmol/L雙氧水處理的藻溶液在反應(yīng)168h后內(nèi)毒素濃度則分別只增至 732.23,944.84EU/mL,這一現(xiàn)象是因為當雙氧水濃度較低時,部分藻細胞并未被完全破壞至釋放內(nèi)毒素;而當雙氧水濃度較高時,多余的氧化劑則可以破壞部分內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu),因此內(nèi)毒素濃度會相對減小.

2.3 硫酸銅對藻類活性及內(nèi)毒素的影響

圖3 硫酸銅對藻類活性(a)和內(nèi)毒素含量(b)的影響Fig.3 Effect of copper sulfate on the activity of algae (a)and concentration of endotoxins (b)

驗不同,經(jīng)硫酸銅處理后的藻溶液中內(nèi)毒素含量隨著接觸時間及硫酸銅濃度的增長而增長,在168h的反應(yīng)時間結(jié)束后,3組樣品中的內(nèi)毒素含量由 55.30EU/mL分別增至 854.60,1055.45,1513.15EU/mL,該現(xiàn)象是由于硫酸銅本身并無氧化性,無法降解死亡藻細胞釋放的內(nèi)毒素,因此,隨著硫酸銅濃度及細胞死亡數(shù)目的增加,溶液中的內(nèi)毒素也會相應(yīng)增加.

2.4 敵草隆對藻類活性及內(nèi)毒素的影響

圖4 敵草隆對藻類活性(a)和內(nèi)毒素含量(b)的影響Fig.4 Effect of diuron on the activity of algae (a) and concentration of endotoxins (b)

硫酸銅在其常規(guī)用量(0.5～1.0mg/L,即3.125～6.25μmol/L)的情況下對人體健康無害,且可導(dǎo)致藻細胞中類囊體破裂、DNA原纖維聚集,從而使藻細胞死亡[21].硫酸銅因其除藻效果好且價格便宜,是目前室外游泳池最常用的除藻劑.因此,本文選用 0.5,1.0,2.5μmol/L硫酸銅對水中的銅綠微囊藻進行滅活,結(jié)果如圖4所示.相較于次氯酸鈉和雙氧水,硫酸銅的除藻效果稍差,但可以看出其仍可以有效抑制藻類的生長,經(jīng) 0.5,1.0,2.5μmol/L硫酸銅處理168h后的藻溶液在680nm處的吸光度由0.089分別降至0.0713、0.0411及0.0135(圖3(a)).另一方面(圖3(b)),與以上2組實

敵草隆又名二氯苯基二甲脲,是一種光合作用抑制劑,其可以阻止葉綠素的合成和阻斷電子傳遞,從而破壞植物的光合系統(tǒng)II導(dǎo)致細胞死亡,但由于敵草隆屬于難降解有機物,且其部分中間產(chǎn)物具有極強的基因毒性,因此在其應(yīng)用過程中應(yīng)酌情使用[22].本文選用了 5,10,25μmol/L敵草隆進行了藻類滅活實驗.如圖4(a)所示,5 μmol/L的敵草隆在前 96h內(nèi)對藻細胞的生長并無明顯抑制作用,而 10μmol/L和 25μmol/L的敵草隆在96h內(nèi)雖能抑制藻細胞的生長,仍無法有效去除藻細胞,但3組溶液在觀察過程中均已明顯變黃,說明了其光合系統(tǒng)已遭破壞,細胞中葉綠素含量減少,且3組溶液在168h反應(yīng)時間結(jié)束后OD680分別驟降至0.0279、0.0223和0.0179.同樣,與硫酸銅相似,由于敵草隆本身不具有氧化性,所以溶液中的內(nèi)毒素含量與死亡細胞數(shù)目基本成正比,因此,經(jīng)敵草隆處理后的藻溶液中內(nèi)毒素含量也隨著反應(yīng)時間及敵草隆濃度的升高而升高,由圖4(b)可知,3組溶液內(nèi)毒素濃度在前96h增幅不大,由 55.30EU/mL分別增至 476.94,632.32,942.43EU/mL,然后隨著細胞死亡數(shù)據(jù)激增,168h時內(nèi)毒素濃度分別增至 1802.23,1788.11,1886.14EU/mL.

2.5 4種除藻劑的對比

現(xiàn)將次氯酸鈉、雙氧水、硫酸銅和敵草隆4種除藻劑在 168h(7d)時對銅綠微囊藻的抑制率及內(nèi)毒素的釋放進行分析如表1所示.由表1可知,本實驗所采用的4種除藻劑在1周內(nèi)均能高效的滅活水中的銅綠微囊藻,且當采用較高濃度時對藻類的抑制率均可達到 90%以上.這與其他參考文獻中的實驗結(jié)果一致[4,6],除藻劑能夠有效擬制藻細胞的光量子產(chǎn)率,進而降低光捕獲能力并阻斷電子傳遞,最終造成藻細胞完全喪失光合作用能力,因此本研究中藻細胞與除藻劑接觸一段時間后逐漸死亡,OD680值降至0.02以下.

與此同時,本研究所進行的12組不同濃度除藻劑實驗中,藻類被滅活的過程均伴隨有不同濃度內(nèi)毒素的釋放,且隨著接觸時間的延長,內(nèi)毒素釋放的濃度越來越大.7d除藻實驗中4種除藻劑造成內(nèi)毒素釋放的濃度在 732.30～1886.14EU/mL之間,均遠遠大于控制樣在7d時釋放的內(nèi)毒素濃度(113.86EU/mL).這一結(jié)果可以歸結(jié)于2個原因：一是藻細胞在正常生長過程中會向周圍水體釋放內(nèi)毒素,如控制樣水中內(nèi)毒素濃度隨著時間延長逐漸升高;二是除藻劑與藻細胞作用后,細胞壁破裂或細胞死亡裂解,從而不斷釋放內(nèi)毒素至周圍水體中,且隨著除藻劑投加量增加,內(nèi)毒素釋放有上升趨勢.本研究中內(nèi)毒素的釋放規(guī)律與其他文獻氧化劑除藻過程中藻毒素的釋放過程類似[4,23],均是由于藻細胞破裂或裂解所致.

以上實驗結(jié)果表明在使用化學(xué)除藻劑滅藻過程中,即使水源水中藻類已被除藻劑有效去除,因其除藻過程中釋放了大量的內(nèi)毒素,人們?nèi)圆荒苤苯优c含藻水源接觸,以避免因暴露于過量內(nèi)毒素之下而引發(fā)病癥.

表1 168h時各除藻劑對銅綠微囊藻的抑制率和內(nèi)毒素的釋放情況Table 1 Inhibition rate of different algaecides on Microcystis aeruginosa and the release of endotoxin

3 結(jié)論

3.1 次氯酸鈉、雙氧水、硫酸銅及敵草隆等化學(xué)除藻劑在滅活藻類的同時會伴隨有大量內(nèi)毒素的釋放(732.30～1886.14EU/mL),遠大于藻類自然代謝產(chǎn)生的內(nèi)毒素(113.86EU/mL),嚴重危害著機體健康.

3.2 次氯酸鈉、雙氧水等具有氧化性的除藻劑在用量較大時能一定程度上降解部分內(nèi)毒素(7d時間分別釋放內(nèi)毒素852.03,944.84EU/mL),而硫酸銅、敵草隆等非氧化性的除藻劑則無法降解釋放的內(nèi)毒素(7d時間分別釋放內(nèi)毒素 1513.15,1886.14EU/mL).

3.3 人們應(yīng)避免與化學(xué)修復(fù)法處理的高藻水直接接觸,以減少內(nèi)毒素暴露風(fēng)險.

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