張 千,徐曉晨,王 超,王曉靜,楊鳳林 (大連理工大學環(huán)境學院,工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室,遼寧 大連 116024)

與傳統(tǒng)的脫氮工藝相比,厭氧氨氧化工藝具有不需添加有機碳源、不需曝氣、剩余污泥量小、節(jié)省成本的優(yōu)點,已逐漸被應用到廢水脫氮領域中[1].但因厭氧氨氧化(anammox)菌倍增時間長(約 10.5d),增長緩慢,純種培養(yǎng)難以進行,導致應用于實際廢水處理啟動周期過長.世界上第一個工業(yè)化厭氧氨氧化工藝處理氨氮廢水裝置用時長達3.5a之久[2].因此培養(yǎng)保藏厭氧氨氧化菌,建立菌種儲庫,為污水處理應用提供足夠量的菌種成為工業(yè)化規(guī)模應用的關鍵.

菌種保藏的方法主要有液體石蠟法、沙土保藏法、液氮法、冷藏法、冷凍法、凍干法及凝膠包埋法等[3].這些保藏方法的原理主要是根據(jù)微生物的生理生化特點,人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧條件,抑制微生物的代謝作用,使其生命活動降至最低程度或處于休眠狀態(tài),使菌株很少發(fā)生突變,以達到保持純種的目的[4].

目前,厭氧氨氧化菌種保藏的方法集中于冷藏法、冷凍法及凍干法[5],同時添加低溫保護劑(如二甲亞砜、海藻糖、甘油、葡萄糖、聚乙烯醇、海藻酸鈉等)、保藏基質(NH4+-N、NO2--N 等)或緩沖液(鉬酸鹽、NO3--N 等)[6-13].但冷藏法保藏效果較差,菌體死亡率較高;冷凍法和凍干法設備成本高且操作繁瑣,同時不利于大規(guī)模的工業(yè)化應用.因此對于anammox菌的保藏仍未得到一種經(jīng)濟、有效、簡單的方法來應用到實踐中,仍需對anammox菌的保藏技術進行深一步的探索與研究.

本研究首次提出采用高溫法對anammox進行干法保藏,通過真空干燥法對anammox菌進行干燥,并對聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纖維素鈉(CMC)、海藻酸鈉(SA)、海藻糖和去離子水五種烘干保護劑種類進行篩選及實驗條件優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 厭氧氨氧化菌種

實驗所用的 anammox菌種取自大連理工大學環(huán)境污染控制研究室長期培養(yǎng)的厭氧氨氧化反應器.反應器類型為連續(xù)攪拌釜式反應器(CSTR),有效容積為 80L.所培養(yǎng)菌群呈紅褐色、絮狀、密度大、活性高.進水總氮(TN)最高可達550mg/L,去除率最高為92%.其混合液懸浮固體(SS)濃度約為 7000mg/L,揮發(fā)性懸浮固體濃度(VSS)約為 4000mg/L.進水采用人工模擬廢水,成分除氨氮與亞硝氮外,還包括碳酸氫鉀450mg/L、磷酸二氫鉀 45mg/L,微量元素 I和 II各1mL/L.其中微量元素成分參考Graff等[14]的文獻.

1.2 干粉菌劑的制備

將取出的anammox菌用0.01mol/L PBS緩沖溶液(pH=7.0)清洗,渦旋器渦旋5min,然后用離心機(6000r/min,10min)去除上清液,重復 3次.將稱量后的污泥與定量的保護劑溶液在培養(yǎng)皿(經(jīng)高溫滅菌)平面內(nèi)于氮氣吹掃下混合均勻,然后置于真空干燥箱中,設置烘干溫度,21kPa條件下進行干燥,達到干粉狀態(tài)時停止干燥(含水率為(20±5)%).然后將干粉用真空包裝機抽真空密封,置于4℃冰箱中恒溫避光保存.

1.3 菌體復壯實驗

將保藏1個月的干粉取出,用PBS緩沖溶液洗滌3次,方法同1.2中清洗方法.所用模擬廢水成分同 1.1中模擬廢水,除氨氮和亞硝氮濃度變化外,其他成分濃度不變,pH值為7.5～7.8.批式實驗中,在血清瓶中加入100mL模擬廢水和0.3g干粉,使血清瓶內(nèi)的 VSS約為3000mg/L,用丁基橡膠塞塞緊瓶口并用鋁蓋加固,然后充氮氣置換其中的空氣 20min.將血清瓶置于恒溫搖床中于37℃、160r/min條件下進行復壯,每24h取樣測定 NH4+-N、NO2--N、NO3--N濃度及其他活性指標,每個樣品設置2個平行;在連續(xù)實驗中,同樣加入干粉使反應器內(nèi)的 VSS約為 3000mg/L,然后啟動反應器進行為期 1個月的復壯實驗,連續(xù)實驗反應器的流程圖如圖1所示.反應器的有效容積為 500mL,水力停留時間 HRT=24h,并采用間歇式曝氣除氧.

圖1 連續(xù)實驗反應器工藝流程示意Fig.1 Process flow-chart of continuous experiment reactor

1.4 分析方法

實驗過程中,氨氮(NH4+-N)、亞硝酸氮(NO2--N)、硝酸氮(NO3--N)采用標準方法分析[15];菌體存活率及雜菌情況采用 PI單染-流式細胞儀檢測[16];微生物活性測試測量采用批式實驗的方法測定[17];微生物形態(tài)表征采用掃描電子顯微鏡(SEM)[18];菌群定性及定量分析采用熒光原位雜交(FISH)并結合 Image-Pro Plus軟件進行分析[19].

2 結果與討論

2.1 烘干保護劑的篩選

配制 5種保護劑溶液,濃度均為 2%(m/v),將anammox菌放在不同保護劑中于40℃下進行真空干燥并真空密封,之后放置在 4℃恒溫避光冰箱中保藏,保藏1個月后進行不同保護劑下anammox菌的存活率、復壯性能及菌群變化實驗.

2.1.1 不同保護劑下菌體的存活率 配制培養(yǎng)基將洗凈保護劑殘留的 5種菌劑復水 24h,利用PI單染-流式細胞儀檢測干粉菌劑的存活率,結果如圖2所示,5種保護劑下制備的干粉菌劑,其存活率從高到低的順序為：海藻酸鈉＞羧甲基纖維素鈉＞海藻糖＞去離子水＞聚乙烯醇.同時發(fā)現(xiàn),5種條件下得到的菌體存活率均在98%以上,由此推斷在 40℃溫度下進行真空干燥對anammox菌傷害較小.

圖2 保藏30d后干粉菌劑的存活率Fig.2 Survival rate of dry powder agents after preservation for 30days

2.1.2 不同保護劑下菌體的復壯性能 采用批式實驗確定5種保護劑的復壯活性,參考指標為總氮(TN)去除率,如圖3所示.實驗結果表明聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉及海藻酸鈉的TN去除率較高,但結合氨氮及亞硝氮的去除率可知,以聚乙烯醇作為保護劑的氨氮去除率平均值為9.0%,而亞硝氮的去除率平均值達 71.4%,說明其反硝化作用較強,而并不是表現(xiàn)出較強的厭氧氨氧化活性.

圖3 5種保護劑的批式實驗的總氮去除率Fig.3 TN removal efficiency of batch tests of five protective agents

圖4 菌體復壯后的FISH圖像Fig.4 FISH pictures of anammox sludge after reactivation綠色：全菌 紅色：anammox 菌

2.1.3 菌群變化實驗 在干粉菌劑保藏過程中菌體的死亡或雜菌的增殖,以及復壯過程中對環(huán)境適應性的不同會造成菌群的變化,故在批式實驗結束后,取血清瓶內(nèi)的菌懸液進行 FISH實驗,利用真細菌探針EUB338[20]標記全菌、AMX820[21]標記anammox菌,以anammox菌在全菌中的占比來判斷各保護劑下菌體的復壯效果.結果如圖4所示,聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、去離子水、海藻酸鈉及海藻糖5種保護劑復壯7d后,anammox菌所占全菌的比例依次為25.3%、45.4%、23.1%、47.5%及27.4%.由海藻酸鈉作為保護劑,anammox菌在復壯后占比最高.

在測定菌體存活率中,存活率最高的為海藻酸鈉;而且在 7d的批式復壯實驗中,海藻酸鈉的TN去除率除較特殊的聚乙烯醇外,在復壯的第4～7d最高;同時根據(jù)FISH圖像分析anammox菌占比的結果來看,海藻酸鈉的anammox菌占比最高.由此可知,海藻酸鈉為 5種保護劑中最適宜anammox菌保藏的保護劑.

2.2 烘干溫度條件優(yōu)化

在篩選出烘干保護劑為海藻酸鈉之后,制備烘干溫度為 40,45,50,55,60,65℃,海藻酸鈉濃度為2%(m/v)的干粉菌劑,并進行真空密封4℃恒溫避光保藏,保藏30d后進行相關分析實驗.

首先利用PI單染-流式細胞儀檢測保藏后干粉菌劑的雜菌情況,在復水 24h后測定.二維點圖FSC-SSC可觀察細胞的大小和粒度,其中FSC反映顆粒的大小尺寸,SSC反映顆粒的內(nèi)部結構復雜程度,圖中以積分面積作為信號的表現(xiàn)方式反映細胞熒光的總和[22].結果如圖5所示,在 60℃及 65℃下制備的干粉菌劑的雜菌比例少于在40～55℃范圍內(nèi)制備的雜菌比例.分析可能原因是：在較低溫度條件下烘干時,真空干燥箱內(nèi)的其他微生物未被殺死且提供了其滋生的溫床,而且海藻酸鈉由于微生物的滋生而腐敗發(fā)出臭味,由此造成雜菌的生長;當溫度達到 60℃及以上時,周圍微生物被殺死,而包裹在海藻酸鈉中的 anammox菌得到保護,巴氏滅菌方法指出一般細菌的致死點均為溫度 68℃,這種殺菌方法通過急劇的熱與冷變化促使細菌的死亡[23].

圖5 保藏30d后各烘干溫度下的干粉菌劑的雜菌情況Fig.5 Condition of sundry bacteria of dry powder agents at different drying temperatures after preservation for 30days

表1 烘干溫度條件優(yōu)化結果Table 1 Results of optimization of drying temperature

同時,進行了不同烘干溫度下制備的干粉菌劑在不同干燥時間的存活率實驗與批式復壯活性實驗,實驗結果匯總如表1.表中菌體水解期是指在利用保藏的厭氧氨氧化污泥進行批式復壯實驗時需經(jīng)歷的第一個階段,由于菌體自溶而出現(xiàn)氨氮去除率小于0的情況[24],其長短可反映菌體的死亡情況.

隨著烘干溫度的升高,烘干時間降低,而菌體存活率也隨之降低,但在 60℃時出現(xiàn)極值點.考慮到工業(yè)化應用,烘干時間越短經(jīng)濟型越強.而且60℃時,菌體的水解期僅為1d,TN去除率平均值最大.再升高溫度到 65℃時,菌體存活率下降,水解期變長,TN去除率急劇下降.因此,確定最佳的烘干溫度為60℃.

2.3 保護劑濃度條件優(yōu)化

確定最佳烘干溫度為60℃之后,對保護劑海藻酸鈉的濃度進行優(yōu)化,分別制備海藻酸鈉濃度為1%、2%及3%的干粉菌劑,烘干溫度采用優(yōu)化結果60℃,保藏30d后進行相關分析實驗.

首先,對保藏的菌劑復水 24h后利用 SEM進行菌落形態(tài)的觀察,如圖6所示.Anammox菌正常的菌落結構呈現(xiàn)花椰菜狀[25],在本研究中對 3種濃度下制備的菌體：濃度為 1%海藻酸鈉和 2%海藻酸鈉制備的干粉菌劑的菌落遭到較為嚴重的破壞,而在 3%海藻酸鈉保護下的菌體結構較為完整,仍能觀察到花椰菜的聚集狀菌落形態(tài).

圖6 不同海藻酸鈉濃度下制備的干粉菌劑掃描電鏡圖像Fig.6 SEM images of dry powder agents at different concentrations of SA

圖7 不同濃度海藻酸鈉的連續(xù)實驗TN去除率的變化Fig.7 Changes on TN removal efficiency of continous experiment of different concentrations of SA

之后利用連續(xù)反應器進行為期 30d的復壯實驗,復壯過程中的TN去除率如圖7所示.TN去除率均呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢,這是因為由于菌體自溶釋放出有機物導致反硝化菌的增殖,使進水中的大量亞硝氮得到去除.而隨著菌體自溶減弱,反硝化作用也隨之減弱,而此時厭氧氨氧化活性仍未得到及時恢復,造成 TN去除率的降低.隨后厭氧氨氧化活性的復蘇使 TN去除率開始回升.在回升階段,TN去除率由高到低的順序為3%＞2%＞1%.

在連續(xù)實驗過程中分別在運行的第 10、20、30d進行了比厭氧氨氧化活性(SAA)的測定.厭氧氨氧化反應的基質消耗速率與污泥濃度之比稱為 SAA,它是反映 anammox菌脫氮性能的重要指標,單位為 kg N/(kg VSS·d),結果如圖8所示.由圖可知,隨著運行時間的延長,anammox菌復壯的 SAA均不斷提高.在啟動反應器的第10d,2%海藻酸鈉制備的干粉菌劑的 SAA最高,而后3 %海藻酸鈉制備的干粉菌劑的SAA后者居上,在運行 30d結束時達到 0.16kg N/(kg VSS·d),為新鮮菌液SAA的41.0%,而在1%及2%海藻酸鈉條件下分別達28.2%及33.3%.

根據(jù)以上實驗結果,可以確定最佳的海藻酸鈉濃度為3%.

圖8 不同海藻酸鈉濃度下制備的干粉菌劑的SAA的變化Fig.8 Changes on SAA of different concentrations of SA

2.4 技術優(yōu)勢

與已報道的anammox菌保藏方法不同的是,本研究創(chuàng)新性地采用高溫即熱干燥法對anammox菌進行干法保藏,意在探求出一種經(jīng)濟、有效、簡單的方法實現(xiàn)菌種的有效保藏.冷凍干燥法、冷藏法及熱干燥法的比較如表2所示.

表2 保藏方法對比Table 2 Table of comparison of storage methods

在此研究中,本實驗最終的優(yōu)化結果顯示干燥時間可控制在6h左右,并可通過真空干燥箱及4℃保藏溫度實現(xiàn) anammox菌的短期保藏.但可取得較好保藏效果的冷凍干燥法其設備投資高、干燥時間長,而本研究采用的熱干燥法可實現(xiàn)保藏效果與經(jīng)濟性的雙贏,對于厭氧氨氧化工藝的工業(yè)化應用在投產(chǎn)方面具有很大的優(yōu)勢.

3 結論

3.1 在聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、去離子水、海藻酸鈉、海藻糖 5種備選烘干保護劑中,最適宜anammox菌的保護劑為海藻酸鈉：其存活率在5種保護劑中最高,達99.8%;批式實驗中TN去除率在7d內(nèi)的平均值達19.5%;而且在結束7d的批式實驗后,anammox菌占全菌的比例在5種保護劑中最高值.

3.2 在對烘干溫度進行優(yōu)化時,60℃時雜菌較少、存活率較高為96.4%、烘干時間較短為6h、菌體水解期為 1d,TN去除率平均值達 36.1%,因此是最適宜的烘干溫度.在對海藻酸鈉的濃度進行優(yōu)化時,3%海藻酸鈉在保藏30d后的菌落形態(tài)破壞程度最小、連續(xù)實驗復壯時的TN去除率最高,而且其活性恢復至 41%,故成為最適宜的海藻酸鈉作為anammox菌烘干保護劑的濃度條件.本論文只是探討了保護劑種類及濃度、烘干溫度的影響,后續(xù)還可對保藏基質、保藏溫度、保藏時間等進行研究,以此來進一步優(yōu)化保藏方案.

3.3 在烘干溫度為 60℃、濃度為 3%的海藻酸鈉條件下制備的anammox菌干粉菌劑并于4℃保藏 30d,其經(jīng)過 30d的連續(xù)實驗活性恢復至41%,還需要進一步研究提高活性的恢復方法.

[1] Ma B, Wang S, Cao S, et al. Biological nitrogen removal from sewage via anammox： Recent advances [J]. Bioresource Technology, 2016,200：981-990.

[2] Wr V D S, Abma W R, Blommers D, et al. Startup of reactors for anoxic ammonium oxidation： experiences from the first full-scale anammox reactor in Rotterdam [J]. Water Research, 2007,41(18)：4149-4163.

[3] 董 昧.微生物菌種保藏方法 [J]. 煤炭與化工, 2009,32(7)：34-35.

[4] 付美紅,王耀耀,朱研研,等.微生物菌種的保藏方法 [J]. 煤炭與化工, 2010,33(4)：33-34.

[5] Michael J, Rorhrock Jr, Matias B, et al. Long-term preservation of anammox bacteria [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011,92：147.

[6] Vlaeminck S E, Geets J, Vervaeren H, et al. Reactivation of aerobic and anaerobic ammonium oxidizers in OLAND biomass after long-term storage [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007,74(6)：1376-1384.

[7] Heylen K, Ettwig K, Hu Z, et al. Rapid and simple cryopreservation of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria [J].Applied & Environmental Microbiology, 2012,78(8)：3010-3013.

[8] Ali M, Oshiki M, Okabe S. Simple, rapid and effective preservation and reactivation of anaerobic ammonium oxidizing bacterium “Candidatus, Brocadia sinica” [J]. Water Research,2014,57(5)：215-222.

[9] 汪彩華,鄭 平,蔡 靖,等.厭氧氨氧化菌混培物保藏方法的研究 [J]. 中國環(huán)境科學, 2013,33(8)：1474-1482.

[10] 金仁村,姬玉欣,彭亭瑜,等.海藻糖在厭氧氨氧化顆粒污泥保存中的應用：中國, 201410031291.0 [P]. 2014-4-20.

[11] Ji Y X, Jin R C. Effect of different preservation conditions on the reactivation performance of anammox sludge [J]. Separation &Purification Technology, 2014,133(36)：32—39.

[12] Xing B S, Guo Q, Jiang X Y, et al. Long-term starvation and subsequent reactivation of anaerobic ammonium oxidation(anammox) granules [J]. Chemical Engineering Journal, 2015,287：575-584.

[13] Xing B S, Guo Q, Jiang X Y, et al. Influence of preservation temperature on the characteristics of anaerobic ammonium oxidation (anammox) granular sludge [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016,(10)：1-13.

[14] Graaf A A V D. Autotrophic growth of anaerobic ammoniumoxidizing micro-organisms in a fluidized bed reactor [J].Microbiology, 1996,142(8)：2187-2196.

[15] 劉思彤.電/磁場強化厭氧氨氧化及多菌群協(xié)同自養(yǎng)生物脫氮[D]. 大連：大連理工大學, 2009.

[16] 劉新星,霍轉轉,云 慧,等.流式細胞術在細菌快速檢測中的應用 [J]. 微生物學通報, 2014,41(1)：161-168.

[17] Tang C J, Zheng P, Mahmood Q, et al. Start-up and inhibition analysis of the Anammox process seeded with anaerobic granular sludge [J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2009,36(8)：1093-1100.

[18] 王 棟.AnHA-SNAD 耦合工藝處理城鎮(zhèn)污水研究 [D]. 大連：大連理工大學, 2015.

[19] Shi Y, Wells G, Morgenroth E. Microbial activity balance in size fractionated suspended growth biomass from full-scale sidestream combined nitritation-anammox reactors [J].Bioresource Technology, 2016,218：38.

[20] Fromm J, Rockel B S, Windeisen E, et al. Lignin distribution in wood cell walls determined by TEM and backscattered SEM techniques [J]. Journal of Structural Biology, 2003,143(1)：77-84.

[21] Schmid M, Schmitz-Esser S, Jetten M, et al. 16S-23S rDNA intergenic spacer and 23S rDNA of anaerobic ammoniumoxidizing bacteria： implications for phylogeny and in situ detection [J]. Environmental Microbiology, 2001,3(7)：450-459.

[22] 陳朱波,曹雪濤.流式細胞術：原理、操作及應用 [M]. 北京：科學出版社, 2014.

[23] 范允實.冷飲生產(chǎn)技術 [M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社, 2008.

[24] 丁 爽.厭氧氨氧化關鍵技術及其機理的研究 [D]. 杭州：浙江大學, 2014.

[25] Van N L, Geerts W J, van Donselaar E G, et al. Linking ultrastructure and function in four genera of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria： cell plan, glycogen storage, and localization of cytochrome C proteins [J]. Journal of Bacteriology,2008,190(2)：708.