熊南安,董 濱,戴曉虎 (同濟大學環(huán)境科學與工程學院,污染控制與資源化研究國家重點實驗室,上海 200092)

近年來,隨著我國污水處理能力的不斷提高,污泥產量逐年增加.在污泥處理處置過程中,厭氧消化成為目前污泥處理的主流技術之一.而污泥厭氧消化過程中所引發(fā)的惡臭問題、腐蝕問題,越來越引起人們的關注.研究表明,污泥厭氧消化過程中,硫轉化產生的H2S和 VOSCS是引發(fā)惡臭問題、導致設備腐蝕的主要原因[1].通常,污泥中的含硫量可占污泥干重的 0.2%～2.3%[2-5],其中含硫氨基酸作為主要的含硫有機質,在厭氧消化過程中能通過有機硫轉化途徑轉化為 H2S和 VOSCS[6].因此,探究和識別污泥中含硫氨基酸在厭氧消化過程中的轉化機制對于調控硫轉化尤為重要.目前,由于缺乏直接定量檢測污泥中含硫氨基酸的方法,對于有機硫轉化機制的研究,僅停留在外源投加不同含硫氨基酸為硫源的實驗階段.這極大的制約了對污泥厭氧消化體系中有機硫轉化機制的研究.因此,建立一種準確且可靠的測定污泥中不同含硫氨基酸含量的方法迫在眉睫.

分類定量氨基酸的檢測方法眾多,主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法和近紅外光譜法等,但此類方法多應用于醫(yī)藥、食品領域氨基酸的檢測[7-9].由于污泥體系成分復雜,針對其中氨基酸的分類定量檢測方法報道相對較少且主要集中在對沼液中游離氨基酸的檢測[10-12],鮮有專門針對污泥中含硫氨基酸的檢測研究.污泥中大部分含硫氨基酸以肽鍵相連結合于蛋白質中,并與其它有機質結合成復雜的超分子結構,所以需要通過一定手段將氨基酸水解至游離態(tài),在醫(yī)藥、食品領域常用的水解方法為酸水解法.由于含硫氨基酸的-S-鍵在水解過程中極易被破壞,水解前通常采用過甲酸將蛋白質中的半胱氨酸和蛋氨酸分別保護氧化為穩(wěn)定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜[13-14].由于污泥是由復雜有機組分、無機顆粒、鹽分等物質構成的復雜體系,按照文獻中醫(yī)藥、食品樣品中過0.22μm濾膜的預處理方法難以達到理想的提純與回收效果,必須采取更為針對性的預處理手段才能達到色譜類儀器的上機要求,目前常用的預處理手段有固相萃取和超濾[12,15].半胱氨酸和蛋氨酸兩種含硫氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特性,為使其在經反相色譜柱分離后能被紫外或熒光檢測器定量識別,通常需要進行柱前或柱后衍生,常用的衍生劑有 NBD-F(4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑)、OPA(鄰苯二甲醛)、DNSYL-Cl(9-氯甲酸芴甲酯)等[16-19],但由于半胱氨酸和蛋氨酸含-S-鍵,在其檢測過程中與其它氨基酸的檢測存在一定的差別.然而,目前針對污泥中含硫氨基酸定量檢測的研究相對較少,對污泥樣品的色譜條件、預處理條件等信息較為匱乏.

本文以污泥為研究對象,提出基于反相高效液相色譜法分類定量測定污泥中含硫氨基酸的方法.旨在為探究污泥體系中含硫氨基酸的轉化途徑提供方法支撐,為后續(xù)污泥中硫的物質流研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半胱氨酸標準品、蛋氨酸標準品、磺基丙氨酸標準品、蛋氨酸砜標準品及17種氨基酸標準品(上海安譜實驗科技股份有限公司)、濃縮污泥(上海曲陽污水處理廠)、30%過氧化氫、88%過甲酸、鹽酸(優(yōu)級純)、偏重亞硫酸鈉、硼酸、磷酸(HPLC 級)、鄰苯二甲醛(HPLC 級)、巰基丙酸(HPLC級)、二水合磷酸二氫鈉(HPLC級)等(除特殊說明外,其它均為分析純)、實驗所用水均為Milli-Q水(Millipore, USA).

1.2 試劑配制

磺基丙氨酸及蛋氨酸砜混合標準品：準確稱取磺基丙氨酸標準品42.3mg(濃度25mmol/L)、蛋氨酸砜標準品45.3mg(濃度25mmol/L),溶于水中,定容至 10mL,制備 25mmol/L的標準儲備液.使用時,將儲備液及 17種氨基酸混標(混標濃度為25mmol/L)共同稀釋成系列梯度5,50,100,200,300,400,500μmol/L.

過甲酸溶液：將30%的過氧化氫溶液與88%的甲酸溶液按1：9(V：V)混合,在常溫下放置1h制得,此溶液現用現配.

偏重亞硫酸鈉溶液：將 33.6g偏重亞硫酸鈉加水定容至100mL.

硼酸緩沖鹽溶液：稱取 2.5g硼酸,加水溶解,于 100mL容量瓶定容得 0.4mol/L硼酸溶液,用10mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至10.2.

OPA 衍生劑：稱取 80.0mg鄰苯二甲醛,加7mL硼酸緩沖液溶解,再加1mL乙腈和125μL巰基丙酸混勻.

1.3 儀器與設備

安捷倫1260G1321B FLD熒光檢測器,安捷倫1260G 1311C四元泵,安捷倫1260G1329B 標準自動進樣器,安捷倫1260G1316A柱溫箱,安捷倫ZORBAX Eclipse AAA 3.5μm×4.6mm×150mm,烘箱,耐壓性水解管(配聚四氟乙烯墊片,購自上海衛(wèi)程科學儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋,3KD Millipore超濾離心管(購自默克密理博生命科學業(yè)務部),高速離心機,旋轉蒸發(fā)儀,樣品瓶,內插管.

1.4 色譜條件

熒光檢測器波長設置為 Ex=340nm,Em=460nm;PMT=10;柱溫為 40℃;流動相 A 為0.04mol/L的NaH2PO4(用10mol/L NaOH將其pH值調至 6.5),流動相 B 為超純水：乙腈：甲醇以10：45：45(V：V：V)配比的混合溶液,洗脫梯度見表1.

表1 流動相洗脫梯度Table 1 Scheme of elution gradient

1.5 預處理方法

污泥冷凍干燥以后,用球磨機磨碎,過200目篩,密封保存于-20℃冰箱備用.預處理步驟主要包括氧化保護、水解、超濾提純,預處理所得濾液用于上機檢測.

1.5.1 氧化保護 準確稱取 50mg污泥于水解管中,加入過甲酸 1.5mL,于 50℃條件下,水浴氧化30min;向污泥氧化液中加0.4mL偏重亞硫酸鈉溶液,終止氧化反應.

1.5.2 水解 向上述污泥氧化液中加入 5.1mL濃度為 8.2mol/L的鹽酸溶液至最終液體體積為7mL且鹽酸濃度為 6mol/L,密封水解管,將水解管置于105℃烘箱中水解24h.

1.5.3 超濾提純 取出水解管,置于室溫冷卻,開啟水解管,將水解管內污泥水解液移入茄形旋轉蒸發(fā)瓶中,并用1mL濃度為0.1mol/L鹽酸洗出殘留水解液,反復 3次,將污泥水解液于40℃、-10bar條件下,旋轉蒸發(fā)至干;用0.1mol/L鹽酸將茄形旋轉蒸發(fā)瓶中的氨基酸樣品溶出,并定容至 10mL.取定容后的水解液 400μL于3kD超濾離心管中,14000g離心40min制得污泥氨基酸超濾液.

1.5.4 預處理方法的優(yōu)化 準確稱取 50mg污泥冷干樣,通過安瓿瓶與水解管比較實驗、過甲酸用量實驗、氧化時間實驗得出污泥中含硫氨基酸檢測的最佳參數條件,確定污泥中含硫氨基酸的最佳預處理方法.

1.6 樣品衍生

取污泥氨基酸超濾液200μL于內插管中,依據如下程序步驟進行在線衍生：進樣針吸取2.5μL pH=10.2的硼酸緩沖鹽溶液,吸取0.5μL污泥氨基酸超濾液,吸取0.5μL鄰苯二甲醛衍生劑,吸取 3μL空氣以最大速率混合 6次;吸取 32μL pH=6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液,吸取空氣18μL以最大速率混合2次,完成氨基酸衍生過程.

1.7 系統(tǒng)重現性實驗、精密度及回收率實驗

將 100μmol/L磺基丙氨酸和蛋氨酸砜混合標準溶液,在線衍生后連續(xù)進樣9次,根據峰面積計算相對標準偏差(RSD),檢測系統(tǒng)的重現性.

將污泥樣品按照上述方法平行進行 6次實驗,根據檢測結果計算RSD,得出方法的精密度.

將適量半胱氨酸和蛋氨酸標準品置于污泥冷干樣中,按上述方法平行進行 6次樣品的加標回收率實驗.

2 結果與討論

2.1 色譜峰條件的選擇

2.1.1 色譜峰的定性、色譜圖與系統(tǒng)的重現性 對色譜柱溫度、流動相pH值、洗脫梯度進行了優(yōu)化.結果表明,色譜柱溫度超過 40℃,色譜柱峰形惡化,色譜峰難以分開,色譜柱溫度低于 40℃分析時間延長.因此本實驗選取柱溫為 40℃.實驗表明,降低流動相pH值能使氨基酸的保留時間延長,有利于氨基酸實現基線分離,實驗流動相pH值選定為 6.5,磺基丙氨酸和天門冬氨酸、蛋氨酸砜和精氨酸實現了更好地分離.此外,針對洗脫梯度進行大量實驗,最終選定的洗脫梯度如表1所示.

圖1 混合標準氨基酸的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard amino acids 1-磺基丙氨酸 2-天門冬氨酸 3-精氨酸 4-蛋氨酸

圖1(a)為根據文獻[12],流動相pH=7.8及相應洗脫梯度下,100μmol/L磺基丙氨酸(CysA)、蛋氨酸砜(Met(O2))與 17中氨基酸標準品的色譜圖,磺基丙氨酸和天門冬氨酸、蛋氨酸砜和精氨酸分離效果不佳,影響實驗的準確性,采取降低流動相 pH值和調節(jié)洗脫梯度的方法能有效實現磺基丙氨酸及蛋氨酸砜與周圍氨基酸的分離.圖1(b)為優(yōu)化后,100μmol/L磺基丙氨酸、蛋氨酸砜與 17中氨基酸標準品的色譜圖,磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的保留時間分別為 3.00,15.12min,二者可以達到很好的分離,目標色譜峰附近無干擾峰.

100μmol/L磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的混合標準瓶連續(xù)進樣 9次,其峰面積的 RSD分別為0.18%和0.41%,可見該儀器的重現性良好.

2.1.2 檢測限及線性范圍 準確吸取適量磺基丙氨酸和蛋氨酸砜標準儲備液,分別配制成5, 50,100, 200, 300, 400, 500μmol/L 7個不同濃度的混合標準溶液,在線衍生后取 36μL進樣,以氨基酸濃度為橫坐標,吸收峰面積為縱坐標做標準曲線,結果見表2.由表2可知,在5～500μmol/L范圍內,磺基丙氨酸和蛋氨酸砜均有較好的線性范圍,2種標準氨基酸的最低檢出限(LOD)值小,分別為0.02,0.12μmol/L,檢測靈敏度較高;最低定量限(LOQ)較低且在線性范圍內相關系數R2≥0.9997,線性良好,可用作標準曲線.

表2 標準氨基酸的方法檢測限及線性范圍Table 2 Detection limits and linear ranges of the established method for standard amino acids

2.2 預處理方法的優(yōu)化

采用不同的過甲酸用量及氧化時間對污泥樣品進行預處理,優(yōu)化預處理過程.固定氧化時間為 25min,得出過甲酸用量對檢測結果的影響,固定過甲酸用量為1.5mL,由圖2可知,過甲酸用量對污泥中半胱氨酸和蛋氨酸的檢測具有較大的影響,這可能是由于當過甲酸投加量較少時,氧化劑與待測物接觸不充分,當過甲酸添加量為 1mL以上時,過甲酸與含硫氨基酸充分反應,達到最佳檢測效果,故選取50mg冷干泥對1.5mL過甲酸作為最佳氧化劑添加參數.氧化時間對污泥中半胱氨酸的影響大于蛋氨酸,在氧化時間為 25min以上時,半胱氨酸和蛋氨酸均可達到最佳檢測效果,選取30min作為最佳氧化時間參數.

圖2 過甲酸用量及氧化時間對檢測結果的影響Fig.2 Effect of different performic acid dosage and oxidization time on the detection of Cys and Met

2.3 樣品分析及結果

圖3 污泥樣品水解氨基酸色譜圖Fig.3 Chromatograms of hydrolyzed amino acids of sludge

2.3.1 樣品精密度及回收率 污泥中的含硫氨基酸為半胱氨酸和蛋氨酸,對污泥進行常規(guī)水解時,得到半胱氨酸和蛋氨酸;采取過甲酸處理后,巰基和二硫鍵均被氧化為磺酸基,蛋氨酸則被氧化為蛋氨酸砜.由于采取常規(guī)水解將導致含硫氨基酸在水解過程中大量被破壞,從而降低實驗的回收率和準確性[20],因此,本研究采用過甲酸氧化+酸水解的預處理方法.圖3為污泥樣品采取上述預處理方法及衍生化步驟后,檢測所得色譜圖.由圖3可知,磺基丙氨酸、蛋氨酸砜與周圍氨基酸分離效果好,其與左右氨基的分離度分別為(-)/13.1、(2.19)/5.6,均符合《中國藥典》中分離度大于1.5的規(guī)定[21].

由表3可以看出,在高量和低量加標情況下,半胱氨酸和蛋氨酸在污泥體系中的加標回收率基本均在90%以上,回收率良好,說明該分析方法滿足方法學要求.

將冷干樣進行 6次平行試驗檢測半胱氨酸和蛋氨酸含量,其RSD分別為2.3%和3.6%,說明該檢測方法精密度良好,定量結果準確.

表3 污泥中含硫氨基酸加標回收率結果(n=6)Table 3 Spiked recovery rates of sulfur-containing amino acids in sludge (n=6)

表4 不同污泥樣品半胱氨酸及蛋氨酸含量[mg/(g DS)]Table 4 Concentrations of Cys and Met in different sludges [mg/(g DS)]

2.3.2 方法的應用 將來自上海某污水處理廠的濃縮泥和 160℃熱水解污泥及二者經厭氧消化后的污泥冷干,進行含硫氨基酸的檢測.結果見表4,濃縮泥中半胱氨酸和蛋氨酸的含量分別是3.86, 6.20mg/(g DS),在 160℃條件下熱水解后,污泥中的含硫氨基酸含量明顯降低,分別降低了48.0%, 51.9%.經熱水解處理后的污泥較原泥,其厭氧消化后,含硫氨基酸的轉化率存在明顯差異.熱水解對污泥厭氧消化過程中含硫氨基酸的利用和轉化機理產生一定影響.因此,應該在此分析方法的基礎上進一步研究不同條件下,厭氧消化過程中硫的轉化機理.

3 結論

3.1 通過優(yōu)化預處理條件、洗脫梯度條件,開發(fā)了一種檢測污泥中含硫氨基酸的高效液相色譜檢測方法.在色譜柱溫度40℃,流動相pH值為6.5,梯度洗脫條件下,目標色譜峰實現了基線分離.通過對過甲酸用量及氧化時間的優(yōu)化,確立了50mg冷干污泥對應1.5mL過甲酸、30min氧化時間的最優(yōu)參數.該方法中半胱氨酸和蛋氨酸能與其他氨基酸實現良好分離,兩種氨基酸均具有良好的線性關系(R2≥0.9997),檢出限(0.02, 0.12μmol/L)和定量限(0.24,1.21μmol/L)低,重復性好(RSD為0.18%,0.41%),加標回收率高(＞90%).

3.2 應用該方法對不同條件下污泥中的含硫氨基酸含量測定表明,經熱水解預處理后,污泥厭氧消化過程中含硫氨基酸轉化發(fā)生改變.該檢測方法可為探究含硫氨基酸的轉化途徑和機制提供方法支撐.

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