丁振東， 齊 玲， 張玉影， 張 宇， 王東東， 鐘 越， 溫 娜， 于洪泉

五味子多糖影響腦腫瘤干細(xì)胞的增殖

丁振東1， 齊 玲2， 張玉影3， 張 宇1， 王東東1， 鐘 越2， 溫 娜2， 于洪泉1

目的探討五味子多糖對腦腫瘤干細(xì)胞增殖的作用。方法培養(yǎng)人腦腫瘤細(xì)胞，采用CD133免疫磁珠分選法獲得腦腫瘤干細(xì)胞，MTT法檢測五味子多糖對腦腫瘤干細(xì)胞生長增殖率的影響，ELISA法檢測腦腫瘤干細(xì)胞分泌HIF、VEGF、Neun和GFAP蛋白變化。結(jié)果五味子多糖可以濃度依賴性地抑制腦腫瘤干細(xì)胞的增殖率，與對照組比較，800 mg/L 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ELISA結(jié)果顯示，五味子多糖作用后腦腫瘤干細(xì)胞分泌HIF和VEGF蛋白降低，分泌Neun和GFAP蛋白增高，與對照組比較，800 mg/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論五味子多糖通過誘導(dǎo)腦腫瘤干細(xì)胞分化和調(diào)控VEGF表達(dá)而抑制腦腫瘤干細(xì)胞的增殖。

五味子多糖； 腦腫瘤干細(xì)胞； 抑制； 分化； 生長

最近，腫瘤生物學(xué)的研究表明：腦腫瘤干細(xì)胞( brain tumor stem cells，BTSCs) 是腦腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)及放化療抵抗的根源[1，2]，腦腫瘤中由于BTSCs的存在，使其缺乏有效的藥物治療。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，五味子甲素、乙素和多糖等都可以明顯地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長[3～5]，但五味子多糖(Schisandra chinensis polysaccharides，SCP)對BTSCs生長增殖的作用還未見相關(guān)報(bào)道。因此，為新藥開發(fā)，有必要研究對BTSCs的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 五味子多糖(中國藥品生物制品檢定所)；DMEM/F12培養(yǎng)液、神經(jīng)培養(yǎng)基、B27添加劑和小牛血清(美國Gibco公司)；人堿性成纖維生長因子(bFGF)和人表皮生長因子(EGF)(英國PeproTech公司)；木瓜蛋白酶(Worthington DBA，F(xiàn)reehold，NJ)；CD133免疫磁珠(Miltenyi Biotec)，二甲基亞楓(DMSO)和四甲基偶氮唑(MTT)(美國Sigma公司)；HIF、VEGF、Neun和GFAP抗體(北京中杉公司)。CB150型CO2培養(yǎng)箱(德國Binder公司)；J-26XP型超低溫高速離心機(jī)(美國貝克曼公司)；PLUS 384型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國MDC公司)；IX-70型倒置式顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取新鮮人腦腫瘤組織(病理診斷為Ⅲ～Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤)，將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入木瓜蛋白酶置于37 ℃水浴中消化45 min，300 r/min離心5 min，加入卵類黏蛋白液3 ml終止反應(yīng)，反復(fù)吹打過濾，300 r/min速度離心5 min，加入紅細(xì)胞去除液，搖床振蕩10 min。離心后細(xì)胞中加入無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞(神經(jīng)培養(yǎng)基含有EGF 20 μg/L、bFGF 20 μg/L、B27添加物)，再次離心后細(xì)胞重懸培養(yǎng)液中，臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以2×106/75 cm2密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)12 h。

1.3 CD133免疫磁珠分選法篩選BTSCs 次日吹打混勻后70 μm濾器過濾，計(jì)數(shù)活細(xì)胞。分選緩沖液洗滌，800 g速度離心3 min，將沉淀加入300 μl分選緩沖液混勻，再加入100 μl CD133免疫磁珠，混勻后4℃避光孵育30 min，再加入緩沖液洗滌，以800 r/min速度離心10 min，棄上清，再用緩沖液重懸細(xì)胞。先用500 μl緩沖液沖洗分選柱，將細(xì)胞懸液過柱，緩沖液洗分選柱3次，移柱出磁場，1 ml緩沖液洗柱，用泵加壓，收集洗液為CD133+細(xì)胞(即BTSCs)。

1.4 細(xì)胞增殖能力分析 機(jī)械分離，將BTSCs制成單細(xì)胞懸液，按5×103個(gè)/孔密度均勻?qū)⑵浣臃N于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜。次日加入SCP(0 mg/L、200 mg/L、400 mg/L和800 mg/L)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，藥物作用24 h時(shí)，各孔再加入MTT 20 μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO150 μl，振蕩后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定各孔570 nm區(qū)的吸光度值，并依據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率=(A用藥組/A對照組)×100%。

1.5 ELISA法檢測BTSCs分泌相關(guān)蛋白變化 取BTSCs培養(yǎng)上清，將上清液與包被液按1∶1的比例包被后4 ℃過夜封閉，然后分別加入一抗HIF、VEGF、Neun和GFAP抗體(1∶1000稀釋)于4 ℃過夜。加入二抗(1∶1000稀釋)室溫下孵育2 h，加顯色液室溫避光顯色后于自動(dòng)酶標(biāo)儀492 nm處測定A值。

2 結(jié) 果

2.1 SCP對BTSCs增殖的影響 200 mg/L、400 mg/L和800 mg/L SCP作用于BTSCs 24 h時(shí)，均可以抑制BTSCs的增殖，尤其800 mg/L組BTSCs的增殖率明顯降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2 SCP對BTSCs分泌蛋白的影響 ELISA結(jié)果顯示，SCP作用BTSCs后，SCP各濃度組分泌HIF(缺氧誘導(dǎo)因子)、VEGF蛋白降低，與對照組比較，800 mg/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。SCP各濃度組分泌Neun、GFAP明顯升高，與對照組比較，800 mg/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果(見表2)。

表1 SCP對BTSCs增殖能力的影響

與對照組比較*P<0.01

表2 BTSCs分泌Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的變化

與對照組比較*P<0.01

3 討 論

腦腫瘤是病死率最高的成人腫瘤之一，也是兒童發(fā)病率最高的實(shí)體瘤。腦腫瘤以膠質(zhì)瘤最為常見，70%以上是惡性。在全球，原發(fā)惡性腦腫瘤的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，其預(yù)后極差。綜合治療中位生存期只有1 y，5 y生存率只有2%。結(jié)合各種新療法，如：分子靶向治療、免疫療法、基因療法、替莫唑胺療法等，其預(yù)后仍不樂觀，患者生存期延長極為緩慢[6]。

五味子是一種五味俱全、五行相生的果實(shí)，能對人體五臟-心、肝、脾、肺及腎發(fā)揮平衡作用，從而在單一藥物治療時(shí)可以發(fā)揮多方面的功效。SCP是從五味子干燥成熟果實(shí)中提取的總多糖，具有抗腫瘤作用。黃玲等[7]研究五味子多糖的抑瘤率結(jié)果表明：高濃度的五味子多糖有較好的抑瘤作用，可在一定程度上使腫瘤細(xì)胞蛻變、凋亡，使瘤內(nèi)炎細(xì)胞增多，瘤周浸潤部瘤細(xì)胞部分蛻變。另外，五味子多糖對S180荷瘤小鼠有較好的抑瘤作用，并能延長H22荷瘤小鼠的生存時(shí)間[8]。本項(xiàng)目組也已證實(shí)，SCP可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長[9]。但SCP對BTSCs是否有作用還不清楚。

本項(xiàng)目組分離、提取原代腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用CD133免疫磁珠分選法獲得CD133+細(xì)胞，即BTSCs。當(dāng)用不同濃度的SCP作用于BTSCs達(dá)到24 h時(shí)發(fā)現(xiàn)：各濃度SCP作用后均可以抑制BTSCs的增殖能力，尤其是高濃度SCP組細(xì)胞的增殖率明顯下降(P<0.01)。這一結(jié)果表明：SCP可以抑制BTSCs的增殖，并呈明顯的劑量效應(yīng)。但SCP抑制BTSCs增殖的機(jī)制還不知道。

本項(xiàng)目組應(yīng)用ELISA法檢測SCP作用BTSCs后Neun和GFAP蛋白變化，結(jié)果表明：SCP可以促進(jìn)Neun和GFAP蛋白分泌增加。BTSCs的生物學(xué)特性之一是具有多向分化能力，可以分化成神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。Neun和GFAP蛋白分別是神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白[10]。所以，以上結(jié)果顯示：SCP可以誘導(dǎo)BTSCs多向分化，這可能促使分化后的腫瘤細(xì)胞容易被SCP殺傷。HIF、VEGF和Neun蛋白分泌減少，HIF是VEGF的上游調(diào)控基因[11]，兩者結(jié)果一致。這可能說明：SCP可能通過調(diào)控VEGF來抑制BTSCs的增殖。

本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)，但SCP抗BTSCs研究對于長白山特色中藥材五味子的深開發(fā)具有十分重要的意義，也會給腦腫瘤等患者帶來福音。

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Schisandrachinensispolysaccharidesaffecttheproliferationonbraintumorstemcells

DINGZhendong，QILing，ZHANGYuying，etal.

(DepartmentofNeurosurgery，F(xiàn)irstHospital，JilinUniversity，changchun130021，China)

ObjectiveTo analysis the effect of Schisandra chinensis polysaccharide (SCP) on the growth of brain tumor stem cells (BTSCs).MethodsHuman glioma cells were cultured，then BTSCs were obtained by CD133 immunomagnetic sorting assay. Expression of HIF，VEGF，Neun and GFAP proteins were examined by ELISA assay.ResultsDifferent doses of SCP could inhibit the proliferation rates of BTSCs，compared with control group，800 mg/L group was statistically significant (P<0.01). Results of ELISA showed that，expressions of HIF and VEGF were decreased but Neun and GFAP were increased，compared with control group，800 mg/L group was statistically significant (P<0.01).ConclusionsSCP could induce the differentiation，and regulate VEGF protein，finally cause the growth inhibiting of BTSCs.

Schisandra chinensis polysaccharides； Brain tumor stem cells； Inhibtion； Differentiation； Growth

1003-2754(2017)11-1010-03

2017-07-10；

2017-09-25

吉林省科技廳項(xiàng)目(20140101114JC；20160101195JC)；吉林省產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新專項(xiàng)(2016C049-2)；吉林省教育廳項(xiàng)目(2016236)

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春 130012)

于洪泉，E-mail：hqy1974@ 163.com

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