倪知游，夏 惠 ，2，高 帆 ，劉 繼，胡容平 ，梁 東，2*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學果蔬研究所，成都 611130；3.成都市農(nóng)林科學院，成都 611130；4.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，成都 610066）

外源褪黑素對獼猴桃幼苗鹽脅迫的緩解作用

倪知游1，夏 惠1，2，高 帆1，劉 繼3，胡容平4，梁 東1，2*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學果蔬研究所，成都 611130；3.成都市農(nóng)林科學院，成都 611130；4.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，成都 610066）

【目的】探討外源褪黑素（MT）對鹽脅迫下獼猴桃幼苗生理特性的影響，為提高獼猴桃抗鹽性提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳援斈晟牢东J猴桃（Actinidia deliciosa）實生苗為試驗材料，通過分別根灌0、0.1、0.5和1 μmol/L MT溶液進行預(yù)處理5d后，再全部根灌100 mmol/L NaCl溶液進行脅迫處理12 d，以處理過程全部根灌清水的植株為空白對照，在脅迫處理結(jié)束后測定盆栽獼猴桃幼苗的相關(guān)生理指標?！窘Y(jié)果】與空白對照相比，100 mmol/L NaCl脅迫顯著增加獼猴桃葉片相對電導率、過氧化氫（H2O2）含量、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、抗氧化保護酶（超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT））活性，減少可溶性蛋白含量；與僅根灌NaCl溶液的植株（S）相比，根灌不同濃度的MT溶液預(yù)處理可使鹽脅迫下獼猴桃葉片相對電導率降低11.01%～35.33%，活性氧H2O2含量降低10.64%～34.04%，MDA含量減少9.99%～24.61%，同時緩解可溶性蛋白的降解，增加脯氨酸和可溶性糖含量，使SOD、POD和CAT活性分別提高2.01%～2.71%、49.78%～58.82%和7.19%～26.14%?！窘Y(jié)論】MT可有效緩解鹽脅迫對獼猴桃幼苗的傷害，以0.1 μmol/L的MT溶液預(yù)處理效果最好。

褪黑素；獼猴桃；鹽脅迫；緩解作用

土壤鹽漬化是農(nóng)業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境所面臨的主要危機之一，果樹鹽堿地栽培研究也是國內(nèi)外關(guān)注的重點。鹽脅迫可以引發(fā)離子毒害、滲透脅迫和氧化脅迫從而導致代謝紊亂，嚴重影響果樹的生長發(fā)育[1]。獼猴桃（Actinidia）在植物分類學上屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）、獼猴桃屬（Actinidia Lindl）植物，是原產(chǎn)于中國的古老野生藤本果樹，其果實質(zhì)地柔軟，口感酸甜，含有豐富的微量元素、人體所需的17種氨基酸和豐富的維生素C[2]。已有研究表明，獼猴桃樹不耐離子脅迫[3]，因此，提高獼猴桃的抗鹽性對保證獼猴桃維持正常的生理水平并獲得較為理想的果實產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。褪黑素（melatonin，MT）是一種吲哚類小分子物質(zhì)，存在于絕大多數(shù)生物有機體中[4-5]。MT在植物體中具有多種功能，包括調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，如促進不定根形成、改變花期、延緩葉片衰老等[6-8]。此外，MT通過清除活性氧和自由基，可提高植物對干旱[9]、鹽害[10]、重金屬[11]、UV 輻射[12]、高溫[13]、冷害[14]等多種逆境的抗性。已有研究表明，MT可以緩解鹽脅迫對平邑甜茶的傷害，提高蘋果砧木的耐鹽性[10]；可以提高鹽脅迫下番茄果實的品質(zhì)[15]。目前，有關(guān)獼猴桃耐鹽性的研究已有一些報道[16-17]，但關(guān)于外源MT對鹽脅迫下獼猴桃抗逆生理特性的研究還未見報道。本試驗通過測定不同濃度外源MT和NaCl脅迫處理下獼猴桃葉片膜脂過氧化、滲透調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化保護酶活性等生理指標，探明外源MT影響獼猴桃鹽脅迫響應(yīng)的生理機制，并篩選出適宜的MT濃度，為合理利用MT解決獼猴桃栽培中的鹽害問題和培育耐鹽獼猴桃品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年1—8月在四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院人工氣候室內(nèi)進行（30°42′N，103°51′E），以野生美味獼猴桃為試驗材料。取飽滿的種子經(jīng)低溫層積和變溫催芽后，播入裝有基質(zhì)（草炭，椰殼，珍珠巖）的穴盤中，放在（25±2）℃的人工氣候室中培養(yǎng)，白晝設(shè)置為12 h/12 h，待幼苗完全展開子葉后澆1/2 Hoagland營養(yǎng)液，幼苗長到3葉1心時，洗凈幼苗根部泥土，移栽到裝有珍珠巖的營養(yǎng)缽（10 cm×10 cm）中，每缽3株。

1.2 試驗處理

待幼苗長至5葉1心時，選取長勢一致的幼苗分成5組，其中3組分別連續(xù)5 d晚上根灌50 mL 0.1、0.5和1 μmol/L MT溶液，其余兩組根灌50 mL清水。在最后1次根灌MT溶液的第2天開始鹽脅迫處理。任選1組根灌清水的植株作為空白對照（CK），即繼續(xù)根灌清水，其余4組植株均根灌50 mL濃度為100 mmol/L的NaCl溶液，連續(xù)根灌12 d，處理期間定期補充1/2 Hoagland營養(yǎng)液。各處理組分別用 CK（清水）、S（清水+100 mmol/L NaCl）、T1（0.1μmol/LMT+100mmol/LNaCl）、T2（0.5μmol/LMT+100 mmol/L NaCl） 和 T3（1μmol/L MT+100 mmol/L NaCl）表示，每處理組10缽，重復(fù)3次。處理結(jié)束后分別采取各組植株根基向上3～5位葉的葉片用于各項生理指標測定。

1.3 測定項目及方法

相對電導率和H2O2含量測定參照張以順[18]的方法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[18]；游離脯氨酸含量測定采用李合生[19]的方法；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[19]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[19]；采用氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[19]；采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶（POD）活性[19]，用分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性[19]；上述指標均以鮮葉為材料，重復(fù)測定3次以上，以平均值作為各處理的實測值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以平均值±標準差（SD）表示；用SPSS 22.0進行顯著性分析，運用one-way ANOVA方法進行Duncan檢驗（P＜0.05）；采用Sigma Plot 12.0進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗葉片膜脂過氧化和活性氧含量的影響

植物細胞膜是逆境脅迫攻擊的對象，由圖1A可以看出，鹽脅迫使獼猴桃葉片的相對電導率升高，S的相對電導率最高，達到61.86%，比CK升高了70.80%。外源MT預(yù)處理顯著抑制了相對電導率的升高，T1的相對電導率為40.00%，比S降低了35.33%，降幅最大。隨MT濃度升高，其抑制作用減弱，相對電導率均升高，T2和T3僅比S分別降低26.25%和11.01%（圖1A）。H2O2是植物體的內(nèi)源活性氧化合物，鹽脅迫導致獼猴桃葉片H2O2大量積累，S的H2O2含量最高，為65.82 μmol/g，是CK的1.86倍。外源MT預(yù)處理可降低鹽脅迫下H2O2含量，其變化趨勢與相對電導率一致，T1、T2和T3分別比S降低34.04%、22.70%和10.64%（圖1B）。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，也是反映細胞膜被破壞的標志性物質(zhì)，鹽脅迫下獼猴桃葉片的MDA含量顯著升高，S的MDA含量最高，為5.06 nmol/g，比CK增加了61.93%，而外源MT預(yù)處理可降低鹽脅迫下MDA含量，T1、T2和T3分別比S降低24.61%、21.96%和9.98%，其中T1與T2的MDA含量差異不顯著（圖1C）。

圖1 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃葉片相對電導率（A）、H2O2含量（B）和MDA含量（C）的影響Figure1 Effects of exogenous melatonin on relative conductivity（A），H2O2content（B）and MDA content（C）of kiwifruit leaves under salt stress

2.2 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖2可知，鹽脅迫使可溶性糖含量升高，S的可溶性糖含量為3.13%，比CK增加了33.32%。MT預(yù)處理各組的可溶性糖含量差異顯著且均高于CK和S，且隨MT濃度增加而增幅減小，其中T1可溶性糖含量最高，為3.73%，比CK增加了58.72%（圖2A）。鹽脅迫下獼猴桃幼苗葉片中脯氨酸含量也顯著增加，T1的脯氨酸含量為521.14 μg/g，相比于CK，其增幅最大，達到74.95%；其次是T2，較CK增加了59.95%，S和T3分別增加了19.46%和27.44%，但兩者差異不顯著（圖2B）。鹽脅迫下獼猴桃葉片中可溶性蛋白含量顯著下降，S的可溶性蛋白含量最低，為5.34 mg/g，較CK下降了28.76%，T1的可溶性蛋白含量為6.97 mg/g，較CK降幅最少，為6.96%，T2和T3分別較CK減少了11.37%和18.11%（圖2C）。

2.3 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗葉片保護酶活性的影響

鹽脅迫下獼猴桃葉片中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性均升高，外源MT預(yù)處理也使其活性顯著增加。單獨鹽處理（S）時 SOD活性為 884.02 U/g，顯著高于 CK；T1的SOD活性最高，為907.99 U/g，比S高2.71%，其次是T2，比S升高2.01%，而T3的SOD活性與S和CK均差異不顯著（圖3A）。鹽脅迫下POD活性變化幅度較大，S的POD活性為5334 U/（g/min），是CK的1.9倍，T1和T2的POD活性分別比S增加了58.82%和49.78%，但兩者差異不顯著，而T3與S的POD活性差異不顯著（圖3B）。另外，鹽脅迫下各處理的CAT活性均顯著升高，其中T1的CAT活性最高，為8.58 U/（g/min），比S增加26.14%，S、T1和T3顯著高于CK，但三者之間不存在顯著差異（圖3C）。

圖2 外源褪黑素對干旱脅迫下獼猴桃葉片可溶性糖含量（A）、脯氨酸含量（B）和可溶性蛋白含量（C）的影響Figure2 Effects of exogenous melatonin on soluble sugar content（A），Proline content（B）and soluble protein content（C）of kiwifruit leaves under salt stress

圖3 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃葉片SOD活性（A），POD活性（B）和CAT活性（C）的影響Figure3 Effects of exogenous melatonin on SOD activity（A），POD activity（B）and CAT activity（C）of kiwifruit leaves under salt stress

3 討論

細胞內(nèi)一價離子（Na+，K+）與二價離子（Ca2+）的平衡維持著細胞質(zhì)膜的完整性和選擇透過性，而NaCl脅迫使細胞內(nèi)Na+濃度升高，破壞了離子平衡，導致細胞膜透性增大[20]；鹽漬條件還導致植物體內(nèi)源活性氧大量積累，誘發(fā)膜脂過氧化生成MDA損害膜的正常功能，影響細胞代謝，對植物產(chǎn)生傷害[21]。本研究結(jié)果表明，外源0.1～1 μmol/L MT預(yù)處理顯著降低了鹽脅迫下獼猴桃幼苗葉片的相對電導率和H2O2含量，抑制MDA積累，這與王偉香等[22]的結(jié)論一致，其作用機理可能是MT作為抗氧化物質(zhì)參與到細胞活性氧清除過程，使活性氧維持在相對較低的水平，同時抑制膜脂過氧化，保護膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而減輕鹽脅迫對獼猴桃幼苗的傷害。

有研究認為脯氨酸積累可維持細胞膨壓，保護酶與膜系統(tǒng)免受毒害，從而提高植株抗鹽性，是植物對鹽脅迫的適應(yīng)[21]?？扇苄蕴鞘谴蠖鄶?shù)非鹽生植物的主要滲透調(diào)節(jié)劑，可以穩(wěn)定細胞膜和原生質(zhì)膠體，也可以在細胞內(nèi)無機離子濃度較高時起到保護作用[23]。本試驗中，外源MT預(yù)處理促進了鹽脅迫下獼猴桃幼苗葉片中的脯氨酸和可溶性糖積累，說明其積累是對鹽脅迫的適應(yīng)，MT能調(diào)控植株脯氨酸和可溶性糖的代謝，增強獼猴桃幼苗的耐鹽性。逆境脅迫下，植物中正常的可溶性蛋白降解或其合成受到抑制，也可能有新的蛋白被誘導合成[24]。本試驗表明，鹽脅迫下獼猴桃幼苗中可溶性蛋白減少，這與田曉艷[25]等的結(jié)果一致；而外源MT預(yù)處理可提高可溶性蛋白的含量，可能是MT抑制了可溶性蛋白的降解，或誘導了更多新蛋白的合成。

保護酶系統(tǒng)中的SOD、POD和CAT主要作用是清除活性氧自由基，防止其過度累積。SOD可以催化體內(nèi)的歧化反應(yīng)，使超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，H2O2再通過 CAT和POD分解成沒有毒害的H2O和O2，從而使需氧生物體免受傷害[26]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下SOD、POD和CAT活性均升高，可能是活性氧的積累誘導了保護酶的合成；外源MT預(yù)處理顯著提高了3種酶的活性，使其協(xié)同作用清除超氧自由基，緩解了鹽脅迫對獼猴桃幼苗的傷害。其作用機理可能是MT與細胞內(nèi)受體結(jié)合，誘導保護酶基因表達，提高保護酶活性[27]。另外，MT預(yù)處理組的POD和CAT活性增幅均比SOD大，因此猜測MT主要誘導POD和CAT酶基因表達。

綜上所述，根灌MT預(yù)處理可使鹽脅迫下獼猴桃幼苗葉片相對電導率降低，減輕膜脂過氧化程度，減少MDA的積累，降低活性氧H2O2含量，緩解可溶性蛋白的降解，增加脯氨酸和可溶性糖含量，提高保護酶活性。推測MT作為抗氧化物質(zhì)參與到細胞活性氧清除過程，同時抑制膜脂過氧化，通過誘導抗氧化酶基因的表達增加其活性從而提高植株抗氧化能力，減輕鹽脅迫對獼猴桃幼苗的傷害，并且0.1 μmol/L的MT溶液預(yù)處理效果最好。但是MT具體調(diào)控這些生理代謝的機制還有待進一步研究。

［1］陳莎莎，蘭海燕.植物對鹽脅迫響應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導途徑［J］.植物生理學報，2011，47（2）：119-128.

［2］崔致學.中國獼猴桃［M］.濟南：山東科學技術(shù)出版社，1993：64-65.

［3］馬凱，汪良駒，王業(yè)遴，等.十八種果樹鹽害癥狀與耐鹽性研究［J］.果樹科學，1997，14（1）：1-5.

［4］TILDEN A R，BECKER M A，AMMA L L，et al.Melatonin production in an aerobic photosynthetic bacterium：An evolutionarily early association with darkness［J］.Journal of Pineal Research，1997，22（2）：102-106.

［5］ARNAO M B，HERNANDEZ RUIZ J.Functions of melatonin in plants：a review［J］.Journal of Pineal Research，2015，59（2）：133-150.

［6］MURCH S J，CAMPBELL S S B，SAXENA P K.The role of serotonin and melatonin in plant morphogenesis：Regulation of auxin-induced root organogenesis in in vitro-cultured explants of st.John's Wort（Hypericum perforatum L.）［J］.In Vitro Cellular&Developmental Biology Plant，2001，37（6）：786-793.

［7］劉夢昕.外源褪黑素對擬南芥開花時間的調(diào)節(jié)作用［D］.西安：西北大學，2015.

［8］WANG P，SUN X，XIE Y，et al.Melatonin regulates proteomic changes during leaf senescence in Malus hupehensis［J］.Journal of Pineal Research，2014，57（3）：291-307.

［9］ZHANG N，ZHAO B，ZHANG H J，et al.Melatonin promotes water-stress tolerance，lateral root formation，and seed germination in cucumber（Cucumis sativus L.）［J］.Journal of Pineal Research，2013，54（1）：15-23.

［10］LI C，WANG P，WEI Z，et al.The mitigation effects of exogenous melatonin on salinity-induced stress in Malus hupehensis［J］.Journal of Pineal Research，2012，53（3）：298-306.

［11］LIMSON J，NYOKONG T，DAYA S.The interaction of melatonin and its precursors with aluminium，cadmium，copper，iron，lead，and zinc：an adsorptive voltammetric study［J］.Journal of Pineal Research，1998，24（1）：15-21.

［12］王英利，王英娟，郝建國，等.褪黑素對綠豆在增強UV-B輻射下的防護作用［J］.光子學報，2009，38（10）：2629-2633.

［13］BYEON Y，BACK K.Melatonin synthesis in rice seedlings in vivo is enhanced at high temperatures and under dark conditions due to increased serotonin N-acetyltransferase and N-acetylserotonin methyltransferase activities［J］.Journal of Pineal Research，2014，56（2）：189-195.

［14］POSMYK M M，BALABUSTA M，WIECZOREK M，et al.Melatonin applied to cucumber（Cucumis sativus L.）seeds improves germination during chilling stress［J］.Journal of Pineal Research，2009，46（2）：214-423.

［15］杜天浩，周小婷，朱蘭英，等.褪黑素處理對鹽脅迫下番茄果實品質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)的影響［J］.食品科學，2016，37（15）：69-76.

［16］劉旭峰.獼猴桃耐鹽性比較試驗［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學，1992，（1）：19-19.

［17］周立名，王飛，王佳.EMS誘變處理定向篩選獼猴桃耐鹽突變體研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2009，18（5）：330-335.

［18］張以順.植物生理學實驗教程［M］.北京：高等教育出版社，2009：128-136.

［19］李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2000：164-201.

［20］戴高興，彭克勤，皮燦輝.鈣對植物耐鹽性的影響［J］.中國農(nóng)學通報，2003，19（3）：97-101.

［21］KERSHAW K A，LEVITT J.Responses of plant to environmental stress［J］.The Bryologist，1980，76（2）：328-328.

［22］王偉香，張銳敏，孫艷，等.外源褪黑素對硝酸鹽脅迫條件下黃瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響［J］.園藝學報，2016，43（4）：695-703.

［23］王學征，王華，吳鳳芝，等.鹽脅迫下苯丙烯酸對黃瓜幼苗生理特性的影響［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2007，1（1）：58-61.

［24］湯章城.逆境條件下植物脯氨酸的累積及其可能的意義［J］.植物生理學報，1984（1）：17-23.

［25］趙可夫.植物抗鹽生理［M］.北京：中國科學技術(shù)出版社，1999.

［26］徐海霞，張霞，王紹明，等.芨芨草遺傳多樣性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，9（1）：21-23.

［27］田曉艷，劉延吉，郭迎春.鹽脅迫對NHC牧草Na+、K+、Pro、可溶性糖及可溶性蛋白的影響［J］.草業(yè)科學，2008，25（10）：34-38.

［28］宋士清，郭世榮，尚慶茂，等.外源SA對鹽脅迫下黃瓜幼苗的生理效應(yīng)［J］.園藝學報，2006，33（1）：68-72.

［29］RODRIGUEZ C，MAYO J C，SAINZ R M，et al.Regulation of antioxidant enzymes：a significant role for melatonin［.J］.Journal of Pineal Research，2004，36（1）：1-9.

Alleviation of Exogenous Melatonin on Kiwifruit Seedlings under Salt Stress

NIZhi-you1，XIAHui1，2，GAOFan1，LIUJi3，HURong-ping4，LIANGDong1，2*
（1.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.Institute of Pomology and Olericulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Chengdu 611130，China；4.Institute of Plant Protection，Sichuan Academy of Agricultural Sciences/MOA Key Laboratory of Integrated Management of Pests on Crops in Southwest China，Chengdu 610066，China）

【Objective】This study aimed to investigate the effect of exogenous melatonin(MT)on the physiological characteristics of kiwifruit seedlings under salt stress and to provide a theoretical basis for improving salt tolerance of kiwifruit.【Method】One-year-old Actinidia deliciosa seedlings were watered with 0，0.1，0.5 and 1 μmol/L of exogenous melatonin solution for 5 days in a row，respectively.Then they were all rhizospheric treatment with 12-day 100mmol/L NaCl solution.Water irrigation in the whole process was used as the blank control.The related physiological indexes of kiwifruit seedlings were determined after stress.【Results】The relative conductivity，malondialdehyde(MDA)，hydrogen peroxide(H2O2)，solublesugar，proline，protectiveenzyme(superoxidedismutase，SOD，peroxidase，PODandcata－lase，CAT)of kiwifruit seedlings were increased significantly and the content of soluble protein was reduced under salt stress compared with the control(CK).Compared with plants only irrigated with NaCl solution(S)，the relative conductivity of kiwifruit leaves was reduced by 11.01%～35.33%，the content of reactive oxygen species(H2O2)was decreased by 10.64%～34.04%，and the content of MDA was lowered by 9.99%～24.61%in the plants pretreated with different concentrations of MT solution under salt stress.At the same time，the soluble protein degradation was slowed down;both proline and soluble sugar were increased;and SOD，POD and CAT were increased by 2.01%～2.71%，49.78%～58.82%and 7.19%～26.14%，respectively.【Conclusion】The damage of kiwifruit seedlings under salt stress was alleviated by MT and the pretreatment with 0.1 μmol/L MT solution was the most significant.

melatonin；kiwifruit；salt stress；alleviation

S663.4；Q945

A

1000-2650（2017）04-0535-05

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.012

2017-06-09

四川省國際獼猴桃生物技術(shù)育種平臺項目（2016NZ0105）；四川省科技廳重點研發(fā)項目（2017FZ0022）。

倪知游，碩士研究生。*責任作者：梁東，博士，副教授，碩士生導師，主要從事果實品質(zhì)調(diào)控研究，E-mail：liangeast@sina.com。

（本文審稿：李 寶；責任編輯：鞏艷紅；英文編輯：徐振鋒）