張彥君，魏 晉，周鑫輝，雍洪亮，李 鵬，馬顥榮，布同良，唐自鐘，陳 惠

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014）

響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基

張彥君，魏 晉，周鑫輝，雍洪亮，李 鵬，馬顥榮，布同良*，唐自鐘，陳 惠

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014）

【目的】對(duì)產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶重組大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化?！痉椒ā坎捎脝我蛩貙?shí)驗(yàn)和響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合，對(duì)培養(yǎng)基的碳源及濃度、氮源及濃度和無(wú)機(jī)鹽離子及濃度進(jìn)行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，最佳的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽離子及添加量分別為乳糖0.63%，酵母粉1.06%，氯化鎂0.11%，發(fā)酵產(chǎn)酶酶活最大值達(dá)到191.23 U/mL，比優(yōu)化前52.43 U/mL提高了3.65倍?！窘Y(jié)論】利用響應(yīng)面法Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的重組大腸桿菌K369R進(jìn)行培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化，為內(nèi)切葡聚糖酶在工業(yè)中的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

重組大腸桿菌；內(nèi)切葡聚糖酶；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，在自然界中分布廣泛，是取之不盡、用之不竭的天然高分子化合物[1]。由于其豐富性和特殊的性能，使纖維素成為石油最有潛力的替代品[2]。盡管植物來(lái)源的纖維素具有實(shí)現(xiàn)這目標(biāo)的潛力，但由于將植物纖維素轉(zhuǎn)化為生物醇衍生物和生物柴油時(shí)存在困難，目前大規(guī)模應(yīng)用是有問(wèn)題的[3]。目前纖維素的降解方式主要有酸降解、堿降解、熱降解、氧化降解和微生物降解等。利用微生物降解纖維素，可以有效提高其綜合利用率，因而成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[4-5]。

纖維素降解過(guò)程中需要3種酶，即內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）、外切葡聚糖酶（cellubiohydr alases，CBH）和 β-葡聚糖苷酶（β-glucosidases，BG）的協(xié)同作用將纖維素降解為葡萄糖。天然纖維素酶催化活性低、生產(chǎn)成本高，很難符合工業(yè)生產(chǎn)的需求[6]。通過(guò)基因工程、蛋白質(zhì)工程及發(fā)酵工程的手段可以對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行有效改造，優(yōu)化產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)而提高相關(guān)酶的活性及產(chǎn)酶效率。前期，本研究室利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶F-10基因進(jìn)行改造并獲得重組大腸桿菌K369R，其比活力及熱穩(wěn)定性較原始酶有明顯改觀，酶活性方面改變不明顯[7]。研究表明，通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化可以有效提高工程菌產(chǎn)酶能力。楊曉志等[8]研究通過(guò)對(duì)大腸桿菌工程菌K12△dapA發(fā)酵條件優(yōu)化，產(chǎn)L-蘇氨酸提高了近1.2倍。王華等[9]在原有培養(yǎng)基基礎(chǔ)上選用不同的碳源、氮源、金屬離子及磷酸鹽對(duì)重組大腸桿菌PUCRF產(chǎn)β-CGTase能力進(jìn)行比較，經(jīng)優(yōu)化β-CGTase酶活力提高1.34倍。張龍等[10]采用響應(yīng)面分析方法對(duì)重組大腸桿菌生產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶（ADI）的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后比初始培養(yǎng)基提高了1.53倍，比LB培養(yǎng)基提高了2.01倍。響應(yīng)面法可以有效優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件。本研究以前期構(gòu)建的重組大腸桿菌K369R為研究對(duì)象，在單因素基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，旨在進(jìn)一步提高重組大腸桿菌（K369R）產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的能力，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

試驗(yàn)菌株來(lái)自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的重組大腸桿菌K369R。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和氨芐青霉素（Amp）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基

LB+Amp培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入Amp使其終濃度為100 μg/mL。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，pH自然。

IPTG（24 mg/mL）和 Amp（100 mg/mL）參照李雨霏[7]的方法配置。

1.4 菌株的活化與發(fā)酵

將活化后的菌株由LB固體培養(yǎng)基接到液體培養(yǎng)基，于37℃180 r/min搖床震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以2%的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基在37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600達(dá)0.4～0.8。分別向各培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，在37℃、200 r/min培養(yǎng)5 h。

1.5 發(fā)酵粗酶液的制備

實(shí)驗(yàn)選用超聲波法進(jìn)行大腸桿菌細(xì)胞的破碎。具體方法參照李雨霏[7]的方法。

1.6 內(nèi)切葡聚糖酶活力的測(cè)定

內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定根據(jù)姚友旭[11]的方法略加改進(jìn)。酶活力的定義：在1.4節(jié)所述培養(yǎng)條件下，1 mL酶液每分鐘催化底物產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg葡萄糖所需的酶量即為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.7 單因素實(shí)驗(yàn)

1.7.1 碳源及濃度對(duì)重組大腸桿菌K369R產(chǎn)酶的影響

根據(jù)史永磊的方法[12]稍做改變。以1.0%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、麥芽糖和甘油為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，以0.5%的蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，測(cè)定酶活力，確定最佳碳源。在最佳碳源的基礎(chǔ)上，選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的最佳碳源的添加量為培養(yǎng)基的碳源，確定最佳碳源濃度。

1.7.2 氮源及濃度對(duì)重組大腸桿菌K369R產(chǎn)酶的影響

在最佳碳源及濃度的基礎(chǔ)上，選擇0.5%的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨為培養(yǎng)基的氮源，測(cè)定酶活力，確定最佳氮源濃度。選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的最佳氮源作為培養(yǎng)基的氮源，確定最佳氮源濃度[10]。

1.7.3 無(wú)機(jī)鹽離子及濃度對(duì)重組大腸桿菌K369R產(chǎn)酶的影響

在最佳碳源、氮源及濃度的基礎(chǔ)上，選擇0.1%的氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂和氯化錳添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，測(cè)定酶活力，確定促進(jìn)效果最佳的離子。選擇0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的最佳離子添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，確定最佳的離子濃度。

1.8 響應(yīng)面BOX-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的整理與分析，進(jìn)行響應(yīng)面分析。采用Design expert 8.0.6軟件程序數(shù)據(jù)處理，結(jié)合Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，選取自變量因素分別為乳糖（A），酵母粉（B）及氯化鎂（C）3個(gè)因素，響應(yīng)值設(shè)計(jì)為內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力（R1），運(yùn)用響應(yīng)曲面回歸分析（Response surface analysis，RSA）對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化[13-15]。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平各不同（見(jiàn)表1）。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table1 Factors levels in response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源及濃度對(duì)重組大腸桿菌K369R產(chǎn)酶的影響

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，不同的碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響各不相同[16]。由圖1a可知，重組大腸桿菌K369R在以乳糖為碳源時(shí)，內(nèi)切葡聚糖酶酶活力最高達(dá)70.97 U/mL；最低的為葡萄糖，僅為33.20 U/mL。選擇乳糖為下一步試驗(yàn)的碳源。由圖1b可知，乳糖的濃度對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響趨勢(shì)為先升高再降低，然后再升高。在乳糖為0.6%的添加量時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，為84.65 U/mL。而在添加量為1.2%時(shí)，酶活力又呈上升趨勢(shì)，達(dá)75.36 U/mL。兩者酶活力相差不多，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇0.6%乳糖繼續(xù)下一步試驗(yàn)。

2.3 氮源及濃度對(duì)重組大腸桿菌K369R產(chǎn)酶的影響

重組大腸桿菌K369R既可以利用有機(jī)氮源也可以利用無(wú)機(jī)氮源。由圖2a可知，重組大腸桿菌K369R對(duì)有機(jī)氮源的利用效率明顯高于無(wú)機(jī)氮源，其中內(nèi)切葡聚糖酶酶活力最高的為酵母粉，酶活高達(dá)94.74 U/mL。當(dāng)使用無(wú)機(jī)氮源時(shí)，酶活力較低，最低的為硝酸銨，僅為23.45 U/mL。選擇酵母粉作為氮源進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。由圖2b可知，在添加量小于1.0%時(shí)，隨著濃度的升高酶活力增加，在1.0%時(shí)達(dá)到最高值，為106.53 U/mL；而超過(guò)1.0%，濃度增加，酶活力降低。選擇1.0%酵母粉進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

圖1 不同碳源及濃度對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響Figure1 Effect of carbon source and concentration on endoglucanase activity

圖2 不同氮源及濃度對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響Figure2 Effect of nitrogen source and concentration on endoglucanase activity

2.5 無(wú)機(jī)鹽離子及濃度對(duì)重組大腸桿菌K369R產(chǎn)酶的影響

由圖3a可知，氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶都有促進(jìn)作用，且氯化鎂的效果最好，達(dá)118.43 U/mL。而氯化錳有抑制作用?？赡苁且?yàn)镸g2+是許多酶的輔助因子，并參與微生物細(xì)胞壁的形成，對(duì)產(chǎn)酶具有重要作用。選擇氯化鎂進(jìn)行下一步試驗(yàn)的。由圖3b可知，Mg2+的濃度對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶的影響趨勢(shì)是先升高在降低，最后在升高的趨勢(shì)，在濃度為0.10%時(shí)產(chǎn)酶活力到達(dá)峰值，為187.00 U/mL，選擇0.10%的氯化鎂進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖3 無(wú)機(jī)鹽離子及濃度對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響Figure3 Effect of inorganic salt and concentration on endoglucanase activity

2.7 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果分析

對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，獲得多元二次方程：R1=188.29+6.21A+9.44B+7.53C-1.25AB-11.79AC+0.42BC-13.65A2-14.89B2-16.81C2，其中R1是預(yù)測(cè)的內(nèi)切葡聚糖酶酶活力，A是乳糖濃度，B是酵母粉濃度，C是氯化鎂濃度。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析Table2 Response surface design and corresponding analysis

表3 方差分析Table3 ANOVA of regression analysis

對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析結(jié)果（見(jiàn)表3）。本試驗(yàn)所得擬合二次回歸方程響應(yīng)面分析模型P值具有顯著性（見(jiàn)表3），R2=0.9686。表明試驗(yàn)的因變量與自變量之間存在多元回歸性，且因素間多元回歸關(guān)系具有顯著性。試驗(yàn)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間相關(guān)性表明該實(shí)驗(yàn)方法具有極高的可靠性，并且也證明該回歸方程具有模擬真實(shí)曲面的真實(shí)性。從F值的大小可以推斷得出，試驗(yàn)選取三因素對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響排序?yàn)榻湍阜郏韭然V＞乳糖。

為求得每個(gè)條件的最佳值，對(duì)所得的回歸方程求一階偏導(dǎo)，得到 A=0.135，B=0.315，C=0.180，對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基配制實(shí)際值：乳糖0.63%，酵母粉1.06%，氯化鎂0.11%，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值R1最大預(yù)測(cè)值為190.872U/mL。利用Design-expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析，可以得到響應(yīng)面圖和等值線圖，3個(gè)因素之間的交互作用見(jiàn)圖4，從以下等值線圖和三維分析圖可見(jiàn)，響應(yīng)面的穩(wěn)定點(diǎn)在所實(shí)驗(yàn)的區(qū)域內(nèi)。在響應(yīng)面等高線分析中，橢圓形或者馬鞍形的等高線被認(rèn)為是參數(shù)之間交互作用顯著，而圓形則被認(rèn)為是不顯著[17]。由圖4a可知，當(dāng)氯化鎂的添加量為0.10%時(shí)，在一定范圍內(nèi)，內(nèi)切葡聚糖酶酶活力隨著乳糖和酵母粉的添加量的增加而增加，在0.63%的乳糖和1.06%的酵母粉的添加量時(shí)，酶活達(dá)到最高值。等高線為近橢形，說(shuō)明兩者的交互作用較為顯著。由圖4b可知，當(dāng)酵母粉的添加量為1.0%時(shí)，在一定范圍內(nèi)，內(nèi)切葡聚糖酶酶活力隨著乳糖和氯化鎂的添加量的增加而增加，在0.63%的乳糖和0.11%的氯化鎂的添加量時(shí)，酶活達(dá)到最高值。等高線為橢圓形，說(shuō)明兩者的交互作用較強(qiáng)。圖4c可知，在一定范圍內(nèi)，內(nèi)切葡聚糖酶酶活力隨著酵母粉和氯化鎂的添加量的增加而增加，在1.06%的酵母粉和0.11%的氯化鎂的添加量時(shí)，酶活達(dá)到最高值。等高線為扁圓形，說(shuō)明兩者的交互作用不顯著。

圖4 各因素的響應(yīng)面圖及等高圖Figure4 Response surface and contour plots of protease production

為了驗(yàn)證這個(gè)模型的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，用響應(yīng)面優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。做3次重復(fù)試驗(yàn)，所得的內(nèi)切葡聚糖酶酶活力分別為191.23 U/mL、189.75 U/mL和190.68 U/mL，與預(yù)測(cè)值190.872 U/mL想接近，可以說(shuō)明該模型具有實(shí)際意義。

3 討論

3.1 碳源的選擇

碳源為微生物的生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來(lái)源。選擇乳糖為最佳碳源可能是其一方面作為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供能量、為蛋白質(zhì)等的合成提供碳骨架，另一方面又可以作為有效的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)[18]。葡萄糖作為碳源時(shí)酶活力較低，可能是產(chǎn)生了“葡萄糖效應(yīng)”，即以葡萄糖作為碳源雖能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但對(duì)產(chǎn)酶相關(guān)基因的表達(dá)有阻遏作用，必須在這些物質(zhì)被耗盡后才開(kāi)始相關(guān)纖維素酶的合成[19]。

3.2 氮源的選擇

氮源是構(gòu)成微生物細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮元素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的作用。酶本身是蛋白質(zhì)，而氮元素是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要元素，因此氮源添加量對(duì)于產(chǎn)酶有重要作用[20]。達(dá)到一定濃度后，酶活力降低可能是由于添加量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致溶液變得更加黏稠，從而使底物流動(dòng)性下降，不利于菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。

3.3 響應(yīng)面分析

目前，用于優(yōu)化發(fā)酵條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法有很多，比如正交實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面分析。響應(yīng)面分析比正交實(shí)驗(yàn)法更為有效，因?yàn)轫憫?yīng)面法是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過(guò)試驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)[21]，采用多元二次回歸方程擬合多個(gè)因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)分析回歸方程尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的統(tǒng)計(jì)方法[22]，在化學(xué)工業(yè)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及食品學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

舒暢等對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化后提高了1.56倍[23]。和玉軍等對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶發(fā)酵條件優(yōu)化，利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后比優(yōu)化前提高了56.87%[24]。Chen等運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)雙歧桿菌和干酪乳桿菌的山羊奶發(fā)酵條件優(yōu)化，最佳發(fā)酵條件對(duì)山羊奶發(fā)酵制品的響應(yīng)值有正面影響[25]。Jia R.B.等通過(guò)單因素和響應(yīng)面方法中的復(fù)合設(shè)計(jì)對(duì)Monacus菌株M-3產(chǎn)TMP的培養(yǎng)基及也太發(fā)酵組成進(jìn)行優(yōu)化，TMP的產(chǎn)量最高可達(dá) 13.49 μg/mL[26]。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的重組大腸桿菌K369R進(jìn)行培養(yǎng)基發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基發(fā)酵條件為乳糖0.63%、酵母粉1.06%和氯化鎂0.11%，預(yù)測(cè)蛋白酶最大酶活為190.872 U/mL，實(shí)測(cè)最大值達(dá)到191.23 U/mL，比優(yōu)化前52.43 U/mL提高了3.65倍。

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Optimization of Culture Medium of Recombinant Escherichia Coli for Endoglucanase Production by Response Surface Methodology

ZHANG Yan-jun，WEI Jin，ZHOU Xin-hui，YONG Hong-liang，LI Peng，MA Hao-rong，BU Tong-liang*，TANG Zi-zhong，CHEN Hui
（ College of Life Science，Science Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China)

【Objective】The study aimed to optimize the fermentation medium of recombinant E.coli for endoglucanase production.【Method】Single factor experiment and response surface Box-Behnken design were used to optimize the carbon source and concentration，nitrogen source and concentration of the medium，and the concentration of inorganic salt.【Results】The results showed that the best carbon source，nitrogen source and inorganic salt ion were lactose，yeast powder and magnesium chloride respectively.The addition amount of various factor in fermentation medium was 0.63%lactose，1.06%yeast powder，0.11%magnesium chloride.Under the optimized conditions，the maximum endoglucanase activity reached to 191.23 U/mL，which was 3.65 times higher than that before optimization of 52.43 U/mL.【Conclusion】The fermentation conditions of recombinant Escherichia coli K369R were studied by using the response surface method Box-Behnken experiment.This research can provide the basis for the theoretical endoglucanase large-scale manufacture.

recombinant E.Coli；endoglucanase；response surface methodology；medium optimization

Q71

A

1000-2650（2017）04-0581-06

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.019

2017-05-05

四川省教育廳項(xiàng)目（13ZB0276）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科研興趣培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目。

張彥君，在讀碩士。*責(zé)任作者：布同良，博士，講師，主要從事微生物與生物質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用，E-mail：tlbu@163.com。

（本文審稿：陳 強(qiáng)；責(zé)任編輯：秦碧雯；英文編輯：劉益平）