何錫忠，倪建平，李春華，林 鷙，潘 潔，彭麗英*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

豬圓環(huán)病毒2型培養(yǎng)方法的研究

何錫忠1，倪建平2，李春華1，林 鷙1，潘 潔1，彭麗英1*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

利用有限稀釋法從含豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的PK15細(xì)胞中克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞株，初步研究了該克隆株中PCV2增殖的特性及穩(wěn)定性。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，將該克隆株在方瓶中靜置培養(yǎng)連續(xù)傳代40代后病毒滴度最高可達(dá)107.5TCID50/mL，用生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒滴度最高可達(dá)108.0TCID50/mL以上。利用常規(guī)方瓶培養(yǎng)細(xì)胞方法，在37℃培養(yǎng)96 h，收獲得到豬圓環(huán)病毒2型病毒液。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效價(jià)的PCV2全病毒滅活疫苗奠定了基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒2型；細(xì)胞克??；病毒培養(yǎng)

以豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）為主要致病因子引起的疾病統(tǒng)稱(chēng)為豬圓環(huán)病毒?。≒CV2-associated disease，PCVAD）。目前，PCVAD正在世界各地持續(xù)發(fā)生與流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。使用PCV2疫苗免疫是目前防控豬圓環(huán)病毒病的主要手段之一，而疫苗的一個(gè)重要指標(biāo)需要高滴度PCV2病毒。目前，對(duì)PCV2的培養(yǎng)都建立在豬腎細(xì)胞系PK15上，直接培養(yǎng)常因毒價(jià)低難以達(dá)到制苗所需的效價(jià)。

提高PCV2病毒滴度的方法一般是采用D-氨基葡萄糖處理細(xì)胞增強(qiáng)病毒的增殖能力，或者采用病毒在細(xì)胞上連續(xù)培養(yǎng)傳代，使分離株隨細(xì)胞傳代次數(shù)的遞增，病毒滴度有所升高［1-2］，但研制周期長(zhǎng)，工藝復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量較難控制，成本較高，不利于規(guī)模化生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)多家單位研究通過(guò)對(duì)PK15母細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋和細(xì)胞克隆，得到對(duì)PCV2具有高敏感性的細(xì)胞系［2-3］，其他類(lèi)型的細(xì)胞系進(jìn)行有限稀釋和細(xì)胞克隆的報(bào)道也較多。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)通過(guò)含豬圓環(huán)病毒2型的PK15細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞克隆后培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的報(bào)道。本研究對(duì)含豬圓環(huán)病毒2型的PK15細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法方式克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15細(xì)胞株，進(jìn)行培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型，毒價(jià)可達(dá)到107.5TCID50/mL，利用微載體培養(yǎng)病毒毒價(jià)可達(dá)108.0TCID50/mL以上，種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)收獲液即為疫苗的原液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與毒株

PK15細(xì)胞（無(wú)PCVl污染）由國(guó)外引進(jìn)，PCV2/SN07-12株（微生物保藏登記號(hào)：CCTCC NO：V201304）由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品；特異性抗PCV2血清、PCV2間接免疫熒光試劑（韓國(guó)JBT生物技術(shù)公司）。

Retiga 2000R高敏感度冷CCD熒光數(shù)碼顯微鏡（日本OLYMPUS）、Centrifuge 5804（R）臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）。生物反應(yīng)器購(gòu)自New Brunswick Scientific Co.Ltd.，USA。

1.2 方法

1.2.1 單個(gè)含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆及其亞群的培養(yǎng)

將PCV2 SN07-12種毒接種于PK15細(xì)胞（無(wú)PCVl污染），37℃培養(yǎng)72 h，胰酶消化PK15細(xì)胞，采用有限稀釋法，按照每孔100μL含20%牛血清細(xì)胞生長(zhǎng)液、0.5個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞數(shù)加入96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取有單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞孔中細(xì)胞繼續(xù)克隆培養(yǎng)，待細(xì)胞初步長(zhǎng)成單層后胰酶消化，加入含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基，再一傳二對(duì)應(yīng)接種到另外一96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，其中一塊板收獲，進(jìn)行篩選鑒定。高陽(yáng)性細(xì)胞孔連續(xù)克隆2次。

1.2.2 陽(yáng)性含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞克隆株的篩選

取長(zhǎng)滿單層96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次，經(jīng)無(wú)水乙醇在-20℃固定2 h，封閉液洗滌1次，再用封閉液在37℃作用30 min，加PCV2特異性血清100μL，37℃作用1 h，PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入熒光標(biāo)記抗體，在37℃作用1 h，洗滌3次后加封片液（Mounting-Fluid），熒光顯微鏡下挑選熒光數(shù)量最多的克隆株為豬圓環(huán)病毒2型高感染性的PK15細(xì)胞亞群，重復(fù)克隆1次，對(duì)含豬圓環(huán)病毒2型PK15細(xì)胞株進(jìn)行純化。

1.2.3 豬圓環(huán)病毒2型的增殖

利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，在37℃先培養(yǎng)24 h，棄生長(zhǎng)液，加入細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，收獲，反復(fù)凍融，即得到豬圓環(huán)病毒2型。

1.2.4 含豬圓環(huán)病毒2型PK15-A8細(xì)胞株的傳代

將高陽(yáng)性細(xì)胞孔連續(xù)克隆2次得到的含豬圓環(huán)病毒2型PK15-A8細(xì)胞株按照常規(guī)傳代細(xì)胞培養(yǎng)方法在中方瓶中連續(xù)傳代，每隔5代進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定，傳代至第40代。

1.2.5 IFA法測(cè)定PCV2 TCID50

將健康的PK15細(xì)胞（無(wú)PCV1污染）用胰酶消化，分裝到96孔細(xì)胞板，90μL/孔，用含細(xì)胞生長(zhǎng)液將含PCV2高感染比例的 PK15-A8細(xì)胞系第5、10、15、20、30、35、40代次病毒液作10倍遞增稀釋 10-1→10-8，每孔10μL病毒液接種90μL PK15細(xì)胞懸液，每個(gè)稀釋度的病毒液接種96孔微量培養(yǎng)板一縱排8孔，同時(shí)設(shè)兩縱排正常細(xì)胞對(duì)照，震蕩后放入5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。

將96孔微量培養(yǎng)板從37℃培養(yǎng)箱取出，甩掉板內(nèi)液體，PBS洗滌1次，無(wú)水乙醇-20℃固定2 h，封閉液（含100 mL/L胎牛血清的PBS）洗滌1次，封閉液37℃作用30 min，加一抗37℃作用1 h，洗滌液清洗3次，加熒光標(biāo)記抗體37℃作用1 h，洗滌液清洗3次，每孔加1滴Mounting-Fluid，在熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。按Reed-Muench法計(jì)算PCV2的TCID50［4］。

1.2.6 5 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)PCV2病毒

采用微載體濃度為5 g/L，取10、20、30、40代含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系的細(xì)胞接種到微載體，細(xì)胞密度4.5萬(wàn)個(gè)/mg，使用低糖 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余培養(yǎng)條件按照常規(guī)方法控制，培養(yǎng)96 h收獲。

2 結(jié)果與分析

2.1 1株含PCV2高感染比例的PK15細(xì)胞系獲得

通過(guò)對(duì)含PCV2高感染比例的PK15細(xì)胞進(jìn)行2輪克隆篩選，第2輪克隆篩選IFA法測(cè)定的陽(yáng)性率為100%，獲得了1株含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞克隆株（圖1）。該克隆細(xì)胞株培養(yǎng)收獲液的毒價(jià)達(dá)107.0TCID50/mL（表1）。

圖1 含豬圓環(huán)病毒2型PK 15細(xì)胞克隆株的篩選結(jié)果Fig.1 Screening of PCV2-containing cloned strain of PK15 cells

2.2 豬圓環(huán)病毒2型的增殖結(jié)果

37℃培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，即得到豬圓環(huán)病毒2型病毒液。

2.3 含豬圓環(huán)病毒2型PK15-A8細(xì)胞株的傳代結(jié)果

通過(guò)連續(xù)傳代PK15-A8細(xì)胞克隆株至第40代，觀察到PK15-A8細(xì)胞系每個(gè)代次的細(xì)胞均呈現(xiàn)典型的梭狀，并且形態(tài)未發(fā)生變化。對(duì)于PCV2的增殖特性試驗(yàn)表明，40代后方瓶收獲細(xì)胞培養(yǎng)物的毒價(jià)維持在107.0TCID50/mL以上（表1）。

表1 PK15-A8細(xì)胞不同代次病毒增殖情況Table 1 PCV2 proliferation in different passages of PK 15-A8

2.4 微載體培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的結(jié)果

利用5 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)4代次病毒增殖特性比方瓶更好，毒價(jià)可達(dá)108.0TCID50/mL以上（表1）。

3 討論

3.1 過(guò)去PCV2在PK15細(xì)胞上病毒增殖滴度較低，難以達(dá)到制備全病毒滅活疫苗的要求［5-6］。本課題組利用PCV2在PK15細(xì)胞內(nèi)繁殖時(shí)不產(chǎn)生細(xì)胞病變這一特性，又避免PK15細(xì)胞對(duì)不同PCV2種毒敏感性存在差異［7-8］。本研究對(duì)含PCV2高感染比例的PK15細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞克隆，挑選出含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞克隆株。該克隆細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)均一、生長(zhǎng)性能好、消化分散，連續(xù)傳代40代，病毒毒價(jià)可穩(wěn)定在107.0TCID50/mL以上。

3.2 本試驗(yàn)研究了利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)24 h，棄生長(zhǎng)液，再加入細(xì)胞維持液，于37℃培養(yǎng)96 h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，即得到豬圓環(huán)病毒2型病毒液。省去傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中的種毒復(fù)壯、病毒接種、吸附和采用D-氨基葡萄糖處理細(xì)胞等工藝，優(yōu)點(diǎn)為工藝簡(jiǎn)單、操作方便、病毒滴度高、易于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化控制，為PCV2滅活疫苗開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

3.3 國(guó)內(nèi)獸用生物制品企業(yè)以前生產(chǎn)大多屬于采用手工作坊方式，生產(chǎn)成本高且生產(chǎn)率低，而生物反應(yīng)器生產(chǎn)成本低產(chǎn)能高。因此通過(guò)生物反應(yīng)器生產(chǎn)可以克服PCV2在培養(yǎng)過(guò)程中效價(jià)低的缺點(diǎn)，為病毒的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)［7］。國(guó)內(nèi)有些單位已通過(guò)在生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)時(shí)的初始接種密度和微載體接入量的優(yōu)化，使該懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)所培養(yǎng)的PK15-B1細(xì)胞能達(dá)到高細(xì)胞密度352—380萬(wàn)個(gè)/mL；利用NBS生物反應(yīng)器自動(dòng)補(bǔ)料程序收獲病毒液，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)收獲5 d，病毒滴度均不低于107.4TCID50/mL，提高了病毒收獲率［8］。本項(xiàng)目組利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)毒價(jià)可達(dá)108.0TCID50/mL以上，不僅優(yōu)于本細(xì)胞系方瓶的靜止培養(yǎng)，同時(shí)也優(yōu)于其他細(xì)胞系培養(yǎng)；對(duì)于PCV2高感染比例的PK15-A8細(xì)胞系在生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)，如何通過(guò)生物反應(yīng)器自動(dòng)補(bǔ)料程序收獲病毒液，進(jìn)行連續(xù)收獲，有待進(jìn)一步研究。

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Study on a culturemethod of porcine circovirus type 2

HE Xi-zhong1，NIJian-ping2，LIChun-hua1，LIN Zhi1，PAN Jie1，PENG Li-ying1*

（1Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China；2Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai201106，China）

From PK15 cells containing porcine circovirus type 2（PCV2），a PK15-A8 cell strain with a high PCV2 infection rate was cloned by a limiting dilution method，and then its PCV2 proliferation characteristics and stability were preliminarily studied.The indirect immunofluorescence test showed that the cloned strain could be up to 107.5TCID50/mL in virus titer after static culture and continuous passage for40 times in a square bottle，and could be over 108TCID50/mL in virus titer after bioreactor cultivation.The PCV2 was harvested after 96-h conventional culture at37℃in a square bottle.The above results laid a foundation for further development of high-titer inactivated PCV2 totivirus vaccine.

PCV2；Cell clone；Virus culture

2016-11-02

上海市閔行區(qū)科委項(xiàng)目（2014MH254）

何錫忠（1966—），男，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向：獸醫(yī)傳染病的診斷和疫苗研制

*通信作者，E-mail：pengliying2010＠aliyun.com，Tel：021-62202534

S852.65

A

1000-3924（2017）06-049-04

程智強(qiáng)）