段筱筠，張愛(ài)琳，2，苗 穎，2，陳丹香，李志文，2*

（1天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院；2天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

花生過(guò)敏原初步分離純化及紫外光譜分析

段筱筠1，張愛(ài)琳1，2，苗 穎1，2，陳丹香1，李志文1，2*

（1天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院；2天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

以新鮮花生仁為原料，采用丙酮和乙醚交替脫脂，PBS浸提、硫酸銨分級(jí)沉淀，再經(jīng)過(guò)透析袋處理小分子蛋白和鹽離子，獲得的蛋白通過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex G-100凝膠柱分離純化，得到花生中的主要過(guò)敏原蛋白。結(jié)果表明：該花生過(guò)敏蛋白的得率為13.5%；SDS-PAGE電泳測(cè)得花生過(guò)敏蛋白的分子量大約為15 kD和60 kD；紫外分光光度檢測(cè)顯示在210 nm處有最大吸收峰，且峰型單一，結(jié)合光學(xué)特征分析表明花生過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)中含有雙鍵或三鍵結(jié)構(gòu)。

花生；過(guò)敏原；分離；純化，紫外掃描

花生具有滋養(yǎng)補(bǔ)益、延年益壽的功效，其作為一味中藥，在治療營(yíng)養(yǎng)不良、脾胃失調(diào)、咳嗽痰喘、乳汁缺少等癥狀上有明顯的作用?；ㄉ姆N子蛋白含量占其種子干重的23%—33%［1］，但這些蛋白中含有很多致敏蛋白，會(huì)引起由IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，并導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂或組織損傷。目前，從花生中已經(jīng)分離出11種花生過(guò)敏原，按照國(guó)際過(guò)敏原統(tǒng)一命名標(biāo)準(zhǔn)分別為 Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7、Ara h8、Ara h9、Ara h10和Ara h11［2］。Ara hl占花生蛋白總量的12%—16%，它是分子量為63.5 kD的糖蛋白［3］，等電點(diǎn)為4.55［4］。食品過(guò)敏原檢測(cè)與評(píng)價(jià)是食品安全的一個(gè)重要方面［5］，目前還沒(méi)有針對(duì)花生過(guò)敏的特效療法，堅(jiān)果過(guò)敏患者嚴(yán)格避免食入含堅(jiān)果的食物是最佳選擇，因此堅(jiān)果檢測(cè)就顯得尤為重要。理論上，堅(jiān)果中任何一種蛋白都有可能是過(guò)敏原，目前普遍認(rèn)為主要過(guò)敏原是糖蛋白。作為一種常見(jiàn)的過(guò)敏原食物，花生引起的過(guò)敏占食物過(guò)敏的1%—20%［6］。由此可見(jiàn)，花生所引起的過(guò)敏嚴(yán)重影響了部分人群的生活質(zhì)量。此外，中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)變態(tài)反應(yīng)科對(duì)就診人群的調(diào)查表明，北京地區(qū)約有4%的食物過(guò)敏患者對(duì)花生過(guò)敏［7］?；ㄉ旅舻鞍滓琅f是當(dāng)今以及未來(lái)食品、醫(yī)學(xué)、變態(tài)反應(yīng)學(xué)研究的重要內(nèi)容。本試驗(yàn)對(duì)花生中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，以期為臨床花生過(guò)敏性疾病的特異性診斷進(jìn)一步開(kāi)展分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，也為低致敏原或無(wú)過(guò)敏原花生的研制及花生過(guò)敏癥的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用花生購(gòu)于天津市西青區(qū)紅旗農(nóng)貿(mào)農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。

試劑及儀器設(shè)備為：考馬斯亮藍(lán)G-250，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；牛血清白蛋白、85%磷酸（分析純），天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；Sephadex G-100、β-巰基乙醇（分析純），天津市雙船化學(xué)試劑廠；聚乙二醇20000（分析純），天津市江天化工技術(shù)有限公司；CBS-B程控多功能全自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；BT-100N數(shù)顯恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；LGR20-W高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；S21-2磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生粉末的制備

稱(chēng)取適量的花生，徹底除去紅衣外皮后，放入高速組織搗碎機(jī)中研磨成粉末（粉末應(yīng)達(dá)到40目篩要求），稱(chēng)取170 g粉末，轉(zhuǎn)移到大燒杯中。

1.2.2 花生脫脂

將上述花生粉末與丙酮按1∶3（W/V）混合，用磁力攪拌器在4℃條件下脫脂2 h，然后靜置1 h，去除上清液；所得沉淀與丙酮按1∶2.5（W/V）混合，用磁力攪拌器在4℃條件下脫脂1 h，然后靜置1 h，去除上清液；所得沉淀與無(wú)水乙醚按1∶1.5（W/V）混合，用磁力攪拌器在4℃條件下脫脂1 h，然后靜置1 h，去除上清液；所得沉淀與丙酮按1∶0.5（W/V）混合，用磁力攪拌器在4℃條件下脫脂0.5 h，然后靜置0.5 h，去除上清液；所得沉淀在通風(fēng)櫥中靜置過(guò)夜，使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)干凈。

1.2.3 花生浸提

（1）將上述脫脂花生粉和預(yù)冷的含有0.05%EDTA·2Na和0.01 mol/Lβ-巰基乙醇的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）的混合溶液按照1∶3（W/V）混合，在4℃條件下用磁力攪拌器緩慢攪拌過(guò)夜。（2）浸提液在4℃、13 000 g條件下離心20 min，分別合并上清液和沉淀。（3）將上述沉淀用PBS溶解后，繼續(xù)用PBS抽提4 h。（4）將浸提液在4℃、13 000 g條件下離心20 min，合并于（2）中的上清液。

1.2.4 硫酸銨分級(jí)沉淀

（1）向花生去脂提取液中加入67 g硫酸銨粉末，使硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到25%，邊攪拌邊緩慢加入，使硫酸銨徹底溶解，在0℃下放置4 h；然后在11 000 g、4℃條件下離心30 min，得沉淀1，收集全部上清液，即25%原液。在所得上清液中加入73 g硫酸銨粉末，使得硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，邊攪拌邊緩慢加入，使硫酸銨徹底溶解，在0℃下放置4 h；接著在11 000 g、4℃條件下離心30 min，得沉淀2，收集全部上清液，即50%原液。在所得上清液中加入79.5 g硫酸銨粉末，使得硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到75%，邊攪拌邊緩慢加入，使硫酸銨徹底溶解，在0℃下放置4 h；最后在11 000 g、4℃條件下離心30 min，得沉淀3，收集全部上清液，即75%原液。（2）將上述得到的3種沉淀分別裝入事先處理過(guò)的8 000—14 000 kD分子量透析孔的透析袋中，用透析夾封口，放入蒸餾水中進(jìn)行透析，期間多次更換透析液，直到用1%氯化鋇溶液在透析液中檢測(cè)，不產(chǎn)生絮狀沉淀為止。

1.2.5 聚乙二醇濃縮

在透析得到的目標(biāo)蛋白液表面于4℃下覆蓋一層薄薄的聚乙二醇（PEG，Mr20 000），待透析袋表面的聚乙二醇因吸水變濕后輕輕抹去聚乙二醇，按照上述過(guò)程對(duì)3個(gè)梯度的沉淀分別進(jìn)行濃縮，濃縮至25%硫酸銨分級(jí)沉淀最終收集11.5 mL，50%硫酸銨分級(jí)沉淀最終收集10.5 mL，75%硫酸銨分級(jí)沉淀最終收集10 mL。

1.2.6 凝膠柱純化

用凝膠柱Sephadex G-100進(jìn)行分離純化。操作參數(shù)為：上樣前用PBS溶液先洗脫平衡2個(gè)柱體積，再上樣，上樣體積為1 mL，上樣流速為1 mL/min，共洗脫2個(gè)柱體積，利用自動(dòng)分布收集器自動(dòng)收集。每種沉淀收集20個(gè)離心管，每管5 mL。

1.2.7 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量［8］

1.2.7.1 牛血清標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量的測(cè)定

取6支干凈的試管，按表1的要求分別加入所需試劑，搖勻，暗處?kù)o置5 min后，立即在595 nm條件下用可見(jiàn)分光光計(jì)測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用蒸餾水調(diào)零。

表1 牛血清標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量測(cè)定所需試劑Table 1 Reagent needed for determ ination of protein content in standard bovine serum

2.1.7.2 樣品蛋白含量的測(cè)定

凝膠柱層析之前，用蒸餾水調(diào)零，在干凈管中分別加入1 mL稀釋10倍的樣品和5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，暗處?kù)o置5 min后，立即在595 nm條件下用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。

凝膠柱層析之后，用PBS調(diào)零，在干凈管中分別加入1 mL樣品和5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，暗處?kù)o置5 min后，立即在595 nm條件下用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。

1.2.8 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)花生過(guò)敏蛋白

選取經(jīng)考馬斯亮藍(lán)測(cè)得蛋白含量較高的樣品，用PBS稀釋10倍之后，以PBS調(diào)零，于紫外分光光度計(jì)上測(cè)其波峰，確定花生過(guò)敏蛋白質(zhì)種類(lèi)。

1.2.9 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)花生中蛋白質(zhì)分子量的分布［9］

①準(zhǔn)備標(biāo)品及樣品；②制備分離膠和濃縮膠；③上樣；④電泳；⑤染色；⑥脫色；⑦凝膠成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以牛血清中蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)、OD595值為縱坐標(biāo)繪制牛血清中蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由圖1可見(jiàn)，牛血清蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y＝0.0064x+0.0411，R2＝0.9852，線(xiàn)性相關(guān)。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可以計(jì)算出待測(cè)蛋白的含量。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Fig.1 Standard curve of protein

2.2 硫酸銨鹽析后的蛋白質(zhì)含量

通過(guò)硫酸銨鹽析可使溶液中蛋白質(zhì)含量減少，隨著硫酸銨濃度的增加，蛋白質(zhì)含量顯著下降，即不同濃度的硫酸銨可以分離不同分子量的蛋白質(zhì)，具有明顯的分離效果。結(jié)合牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以計(jì)算出25%硫酸銨分級(jí)沉淀中的蛋白質(zhì)含量為16.491 mg，50%硫酸銨分級(jí)沉淀中的蛋白質(zhì)含量為15.057 mg，75%硫酸銨分級(jí)沉淀中的蛋白質(zhì)含量為14.26 mg。根據(jù)鹽溶鹽析規(guī)則，25%硫酸銨飽和溶解的花生蛋白在經(jīng)過(guò)鹽溶鹽析處理過(guò)程后，計(jì)算出花生中蛋白質(zhì)的最終得率為13.5%。

2.3 凝膠柱純化之后的蛋白質(zhì)含量

由圖2a可以看出：2號(hào)管蛋白質(zhì)含量比較多；由圖2b可以看出：4號(hào)管蛋白質(zhì)含量比較多；由圖2c可以看出：3、4號(hào)管蛋白質(zhì)含量比較多；可以進(jìn)一步測(cè)定其波峰，確定蛋白質(zhì)種類(lèi)。同時(shí)可以看出，所分離出來(lái)的蛋白質(zhì)含量峰值出現(xiàn)在2—5號(hào)管；由凝膠分離的特性可知，所分離的蛋白質(zhì)分子量較大。

圖2 不同濃度硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白含量Fig.2 Fractionated precipitation protein content of ammonium sulfate with different concentrations

2.4 紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果

2.4.1 凝膠柱純化之前

由圖3可知，25%、50%原液的峰譜圖峰值較多，即所含有的蛋白質(zhì)種類(lèi)較復(fù)雜；75%原液的峰譜圖峰值較少，即所含有的蛋白質(zhì)種類(lèi)較簡(jiǎn)單。其中25%原液在399 nm處有最大吸收峰2.7215；50%原液在431 nm處有最大吸收峰2.2445；75%原液在358 nm處有最大吸收峰1.4447；表明利用不同飽和濃度的硫酸銨可以獲得花生蛋白質(zhì)的不同組分。

圖3 凝膠層析前蛋白峰譜Fig.3 Protein peak spectra before gel chromatography

2.4.2 凝膠分離純化之后

由圖4可知，花生過(guò)敏蛋白在210 nm附近有最大吸收峰。可以判定，所測(cè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中含有雙鍵或三鍵，符合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)波峰單一且較明顯，提示經(jīng)凝膠柱層析后，花生過(guò)敏蛋白質(zhì)得以純化。

圖4 蛋白純化峰譜Fig.4 Peak spectra of protein purification

2.4.3 花生過(guò)敏原SDS-PAGE鑒定分析

由圖5可知，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，4號(hào)管的蛋白主要有2條帶，其中一條分子質(zhì)量為43—66 kD，與Ara h1蛋白分子量相符；另一條為14—20 kD，與Ara h2蛋白分子量相符。另外，也有少量的雜蛋白條帶。

圖5 75%硫酸銨分級(jí)純化后4號(hào)管的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoresismap of No.4 tube after classification and purification of 75%ammonium sulfate

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以市售花生仁為材料，經(jīng)去脂、浸提、硫酸銨分級(jí)沉淀及透析等方法獲得不同分子量的蛋白質(zhì)，結(jié)果表明蛋白質(zhì)得率為13.5%；通過(guò)凝膠柱的分離純化獲得花生的主要蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行紫外光譜檢測(cè)，結(jié)合電泳方法確定花生中的主要過(guò)敏原蛋白質(zhì)是Ara h1和Ara h2。在210 nm處有最大吸收峰，且峰型單一，光學(xué)特征表明花生過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)中含有雙鍵或三鍵結(jié)構(gòu)。

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Prelim inary separation and purification and ultraviolet spectrum analysis of peanut allergens

DUAN Xiao-yun1，ZHANG Ai-lin1，2，MIAO Ying1，2，CHEN Dan-xiang1，LIZhi-wen1，2*

（1College of Food Science and Biotechnology，Tianjin Agricultural University；2Tianjin Engineering and Technology Center of Agricultural Products Processing，Tianjin300384，China）

Taking fresh peanuts as raw material，through alternately degreasing with acetone and ether，PBS extraction，fractionated precipitation with ammonium sulfate，treating small molecule protein and salt ions by dialysis bag，separation and purification by Sephadex G-100 gel column，the main allergens in peanuts were obtained.The results showed that the yield of peanut allergens was 13.5%；the molecular weight of peanut allergensmeasured by SDS-PAGE electrophoresiswas about15 kD and 60 kD.UV spectrophotometry showed that there was amaximum absorption peak at 210 nm，and the peak type was single.Combined with optical feature analysis，there were double or triple bond structure in peanut allergen protein.

Peanut；Allergen；Separation；Purification；UV scan

2016-04-14

天津市優(yōu)秀博士后國(guó)際化培養(yǎng)計(jì)劃（2015018）；2015年大學(xué)生國(guó)家創(chuàng)新項(xiàng)目（201510061088）

段筱筠（1996—），女，本科，主要從事食品安全檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail：1569667215＠qq.com

*通信作者：李志文（1981—），女，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)

R392.8

A

1000-3924（2017）06-091-05

閆其濤）