何 梅，羅 勛

生物與制藥

UVB對(duì)秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)及機(jī)制研究

何 梅，羅 勛

紫外線（UV）輻射可導(dǎo)致生物有機(jī)體多種損傷，其中UVB起重要作用，UVB照射所造成的損傷主要是皮膚老化（光老化）和癌癥.但其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和生殖毒性及機(jī)制至今仍不清楚.本研究利用UVB對(duì)模式生物秀麗隱桿線蟲進(jìn)行輻照，評(píng)估UVB對(duì)秀麗隱桿線蟲生殖腺細(xì)胞凋亡和生殖毒性的影響，及參與UVB作用的信號(hào)途徑；并分析DNA損傷反應(yīng)DDR（DNA Damage Reaction，DDR）途徑中的關(guān)鍵攔截點(diǎn)基因.結(jié)果表明：UVB能誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲生殖腺凋亡細(xì)胞顯著增加及線蟲生殖腺有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)與線蟲子代數(shù)量明顯減少；在DDR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，其中關(guān)鍵攔截點(diǎn)基因CED-3、CED-4、CED-9、EGL-1、HUS-1和CEP-1均參與了對(duì)UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控.本研究結(jié)果揭示了UVB可誘導(dǎo)DNA損傷，從而導(dǎo)致顯著的生殖毒性效應(yīng).

UVB；細(xì)胞凋亡；DDR途徑；生殖毒性；秀麗隱桿線蟲

紫外線（UV）是波長100～400nm的電磁波.UV的形式包括UVA（315～400nm），UVB（280～315nm）和UVC（100～280nm）.經(jīng)UV輕度暴露有助于增加皮膚黑色素的產(chǎn)生［1］，可增強(qiáng)先天免疫.UV照射也有助于維生素D合成.UVB的波段在蛋白質(zhì)和核酸的最大吸收峰附近，其能量被這些大分子吸收后所發(fā)生的光化學(xué)反應(yīng)，會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生較為明顯的影響.適量UVB照射是生物體維持正常的生命活動(dòng)所不可缺少的，如可以促進(jìn)骨骼中鈣的吸收，但過量的UVB照射會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生損害，持續(xù)接觸UVB可能導(dǎo)致慢性不可逆轉(zhuǎn)的損傷范圍（從太陽燒傷到皮膚癌）.McK-enzie等人［2］研究發(fā)現(xiàn)，中緯度地區(qū)夏季紫外線暴露1分鐘將合成足夠的維生素D.然而，持續(xù)暴露至15min即可導(dǎo)致皮膚損傷.皮膚長期暴露于紫外線輻射會(huì)導(dǎo)致過早衰老或光老化，其特點(diǎn)是皺紋形成，色素沉著病變或老年斑，并減少皮膚的完整性［3］.UVB照射可以通過碎片來表征并減少皮膚中的膠原蛋白的產(chǎn)生.降低皮膚中的紫外線輻射劑量會(huì)影響其活性膠原蛋白［4］.隨著照射強(qiáng)度增加，存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白將被破壞，且新膠原蛋白合成將受到阻礙.另研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)UVB暴露可導(dǎo)致膠原蛋白降解、基質(zhì)金屬蛋白酶的上調(diào)（MMP）和活性氧（ROS）積累將導(dǎo)致光老化.Bonaventura等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，UVB照射能夠阻礙海膽骨的正常發(fā)育.UVB照射對(duì)植物也能產(chǎn)生嚴(yán)重的損害作用，如可以破壞植物的DNA，影響光合作用，減弱其自身的防護(hù)作用，抑制生長等［6］.然而，經(jīng)UVB暴露后是否會(huì)導(dǎo)致生殖毒性，至今尚未見報(bào)道.

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）作為模式生物，被廣泛用于生殖毒性方面的研究.Wang等［7］研究環(huán)境脅迫作用后可顯著誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲生殖腺細(xì)胞凋亡增加.很多具有與凋亡及衰老相關(guān)的信號(hào)通路，以及信號(hào)通路中的主要基因原件也已被闡釋清楚［8］.

本研究利用UVB對(duì)秀麗隱桿線蟲進(jìn)行暴露，通過評(píng)價(jià)經(jīng)過UVB暴露后的線蟲生殖毒性效應(yīng)，分析DNA損傷相關(guān)的信號(hào)通路，探索UVB照射導(dǎo)致的毒性效應(yīng)機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 UVB的準(zhǔn)備和輻照方法

所有實(shí)驗(yàn)的處理都是利用UVB照射，波長294nm，照射強(qiáng)度為7.5μW/cm2.幼蟲接種在小皿上，用UVB照射時(shí)間分別為0、5、10、15、20s，成蟲后測定各類指標(biāo).

1.2 C.elegans品系及培養(yǎng)

線蟲品系有野生型 N2、hus-1（WS2277）、cep-1（VC172）、egl-1（MT1082）、ced-9（MT4770）、ced-4（MT2547）、ced-3（MT1522）.實(shí)驗(yàn)室保種的野生型N2及其他所有品系的C.elegans均購自國際線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC，University of Minnesota，USA），用標(biāo)準(zhǔn)的線蟲生長培養(yǎng)基（Nematode growth medium，NGM）于20°C培養(yǎng)，以活的Escherichia coliOP50細(xì)菌作為食物源.所有C.elegans實(shí)驗(yàn)操作程序均按照標(biāo)準(zhǔn)化操作完成.

1.3 UVB毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)

（1）生殖腺細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn).用吖啶橙（Acridine orange，AO）（Sigma）對(duì)秀麗隱桿線蟲進(jìn)行染色檢測生殖腺細(xì)胞凋亡［9］.被UVB暴露處理后的50～60條L4期幼蟲；20°C黑暗中培養(yǎng)24h后，線蟲被移入濃度為25μg/mL的500μL AO溶液中，20°C黑暗中染色1h；然后，將染色后的線蟲移入新的NGM培養(yǎng)皿上恢復(fù)培養(yǎng)40min，用鉑絲針將恢復(fù)后的線蟲挑出置載玻片上疊氮化鈉溶液中，蓋上蓋玻片，于Olympus IX71熒光顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）下，觀察計(jì)數(shù)AO染色呈陽性的凋亡細(xì)胞尸體.

（2）檢測生殖腺有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù).處理方法同細(xì)胞凋亡的方法，照射后經(jīng)72h發(fā)育到成蟲，再經(jīng)12h分別測定其生殖腺游離端有絲分裂的細(xì)胞的個(gè)數(shù).解剖線蟲，讓其暴露生殖腺，染色后在×63顯微鏡下拍照（用蔡司顯微鏡拍攝），取游離端50mm進(jìn)行計(jì)數(shù).

Craig等對(duì)C.elegans生殖腺有絲分裂期細(xì)胞數(shù)目評(píng)測程序已有報(bào)道，我們對(duì)其進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，并已有相應(yīng)的文章刊出［10-11］.首先，使用1μg/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在避光條件下將蟲體切開暴露出的生殖腺染色10min，然后，用PBST（PBS和0.1%Tween-20）5min洗3次，接著使用粘裱液（pH 8.0，90%甘油，20mM三羥甲基氨基甲烷和1mg/mL對(duì)苯二胺混合物）將生殖腺固定在載玻片上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片邊緣粘合封口，于Olympus IX71熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)生殖腺有絲分裂區(qū)（從遠(yuǎn)端細(xì)胞大約20個(gè)細(xì)胞的距離）細(xì)胞數(shù)目.

（3）子代數(shù)量實(shí)驗(yàn).子代數(shù)量實(shí)驗(yàn)按照前人描述的方法實(shí)施.將UVB暴露照射處理的C.elegansL1期幼蟲，培養(yǎng)至L4期后，每天將蟲子轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，直到線蟲停止產(chǎn)卵；移去線蟲的培養(yǎng)皿經(jīng)過24h后，于解剖鏡下計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中剛孵化不久的幼蟲數(shù)目.將產(chǎn)卵期每天計(jì)數(shù)的單個(gè)母體所產(chǎn)幼蟲總和加起來就是一個(gè)處理線蟲的子代數(shù)目.該實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.使用單因素方差分析將對(duì)照組與其他任意一組分析平均差，使用雙因素方差分析分析不同處理組間的平均差.統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著意義的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)是P＜0.05.作圖應(yīng)用origin軟件.

2 結(jié)果

2.1 UVB誘導(dǎo)C.elegans生殖腺減數(shù)分裂期細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加

秀麗隱桿線蟲daf-2編碼一個(gè)胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R），調(diào)節(jié)多種功能.為了檢測daf-2是否參與銀納米顆粒誘導(dǎo)線蟲生殖細(xì)胞凋亡，攜帶突變daf-2（e1370）喪失功能等位基因的線蟲被喂食不同劑量銀納米暴露處理的大腸桿菌.喂食24h后，線蟲生殖腺細(xì)胞尸體被AO活體染色，凋亡細(xì)胞顯示亮綠色，而減數(shù)分裂區(qū)完整的細(xì)胞呈均勻的綠色（圖1A和B）.與N2相比，攜帶daf-2等位基因的線蟲產(chǎn)生更多的生殖細(xì)胞尸體（圖1C）.與哺乳動(dòng)物PI3K、AGE-1同源的秀麗隱桿線蟲的基因位于daf-2的下游.銀納米顆粒通過大腸桿菌攜帶暴露處理的線蟲，與N2相比，在age-1（hx546）生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)目沒有顯著差別，而age-1（mg109）針對(duì)所有暴露劑量比N2產(chǎn)生更多的生殖細(xì)胞尸體.UVB誘導(dǎo)后，與N2相比，HUS-1（lf）導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡數(shù)增加，不同輻射劑量下凋亡數(shù)目沒有顯著性變化（圖1D）；CEP-1（lf）突變體生殖腺細(xì)胞凋亡同樣增加，與HUS-1（lf）有相同趨勢（圖1E）.圖2F顯示與N2相比，EGL-1（lf）導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡數(shù)增加，但與自身相比，凋亡數(shù)目沒有顯著性變化；圖2G顯示CED-9（lf）突變體生殖腺細(xì)胞凋亡明顯減少，與EGL-1（lf）有相同趨勢.圖3H顯示與N2相比，CED-4（lf）導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，但與自身相比，凋亡數(shù)目沒有顯著性變化；圖3I顯示CED-3（lf）突變體生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)亦明顯減少，與CED-4（lf）有相同趨勢.

圖1 UVB誘導(dǎo)野生型N2、突變體HUS-1（lf）和突變體CEP-1（lf）C.elegans生殖腺細(xì)胞凋亡

A.DNA損傷相關(guān)信號(hào)通路中的幾個(gè)關(guān)鍵攔截基因；B.未經(jīng)UVB暴露處理的對(duì)照組野生型N2生殖腺細(xì)胞凋亡照片；C.UVB暴露處理20s野生型N2生殖腺細(xì)胞凋亡照片，白色箭頭指示生殖腺細(xì)胞尸體，標(biāo)尺長度為50μm；D.與N2相比HUS-1（lf）導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡數(shù)；E.與N2相比CEP-1（lf）突變體生殖腺細(xì)胞凋亡.

注：*表示P＜0.05，即代表與未經(jīng)暴露處理的對(duì)照組N2相比有顯著性差異.**表示P＜0.05，即代表與經(jīng)UVB暴露處理的對(duì)照組N2相比有顯著性差異.為了方便比較，在本文所有圖中對(duì)N2野生型凋亡細(xì)胞進(jìn)行比較均與圖1表示相同.

圖2 UVB誘導(dǎo)野生型N2、突變體EGL-1（lf）（F）和突變體CED-9（lf）（G）C.elegans生殖腺細(xì)胞凋亡

圖3 UVB誘導(dǎo)野生型N2、突變體CED-4（lf）（H）和突變體CED-3（lf）（I）C.elegans生殖腺細(xì)胞凋亡

2.2 UVB誘導(dǎo)C.elegans生殖腺有絲分裂期細(xì)胞數(shù)顯著減少

針對(duì)C.elegans發(fā)育來說，有毒物質(zhì)潛在的毒性效應(yīng)，生殖提供了一個(gè)很好的指示作用.為了研究UVB對(duì)C.elegans發(fā)育的胚胎致死效應(yīng)可能的機(jī)制，我們檢測分析了C.elegans的細(xì)胞周期攔截.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4b所示，在實(shí)驗(yàn)室使用同一輻照強(qiáng)度的不同輻照時(shí)間對(duì)C.elegans暴露處理?xiàng)l件下，C.elegans的生殖腺有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)目明顯減少.圖4c所示，UVB暴露時(shí)間延長，有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)明顯減少，UVB輻射劑量所誘導(dǎo)的C.elegans的生殖腺有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)目與UVB暴露時(shí)間呈明顯的劑量依賴效應(yīng).

圖4 UVB誘導(dǎo)野生型N2 C.elegans生殖腺有絲分裂區(qū)細(xì)胞增殖降低

2.3 UVB誘導(dǎo)C.elegans子代數(shù)量明顯降低

為了進(jìn)一步闡明UVB對(duì)C.elegans發(fā)育的胚胎致死效應(yīng)可能的原因，我們還分析了C.elegans的子代數(shù)目.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在實(shí)驗(yàn)室使用同一輻照強(qiáng)度的不同輻照時(shí)間對(duì)C.elegans暴露處理?xiàng)l件下，C.elegans產(chǎn)生的子代數(shù)量明顯減少，UVB暴露劑量所誘導(dǎo)的C.elegans的子代數(shù)量與UVB暴露時(shí)間呈明顯的劑量依賴效應(yīng).

圖5 UVB誘導(dǎo)野生型N2 C.elegans子代數(shù)量

3 討論

至今，UVB對(duì)細(xì)菌或者別的生物有機(jī)體具有毒性作用，但是，UVB對(duì)環(huán)境的潛在生態(tài)毒性及其機(jī)制尚不能給出合理解釋，尤其是UVB對(duì)生物有機(jī)體產(chǎn)生毒性的時(shí)間效應(yīng).在本研究使用模式生物C.elegans研究UVB的毒性的時(shí)間效應(yīng)及機(jī)制.根據(jù)已有的UV作為殺菌手段［12-13］，UVB暴露劑量被設(shè)置在1～25μg/ml.

本研究結(jié)果表明UVB暴露誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲生殖細(xì)胞凋亡，揭示秀麗隱桿線蟲可作為一個(gè)體內(nèi)模型來評(píng)價(jià)UVB暴露誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑.已有研究結(jié)果顯示UV誘導(dǎo)多種細(xì)胞系和組織的細(xì)胞凋亡，但是涉及該過程的潛在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚未于哺乳動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)給予確切解釋.為了探索UVB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能涉及的信號(hào)通路，我們使用已知哺乳動(dòng)物基因的線蟲的突變等位基因參與凋亡調(diào)控進(jìn)行評(píng)價(jià).研究結(jié)果顯示DNA損傷應(yīng)答DDR信號(hào)基因HUS-1，EGL-1，CED-9，CED-4和CED-3在UV-B誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡中是必需的.

DDR信號(hào)：在秀麗隱桿線蟲中，生殖細(xì)胞凋亡受到進(jìn)化上保守的核心凋亡機(jī)制的調(diào)控；殺死過程需要caspase蛋白CED-3和凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）同源物CED-4.秀麗隱桿線蟲CED-9編碼與哺乳動(dòng)物Bcl-2同源的蛋白質(zhì)，其通過隔離CED-3和CED-4來抑制程序性細(xì)胞死亡.本研究顯示UVB誘導(dǎo)的生殖凋亡細(xì)胞在ced-3（n717）和ced-4（n1162）突變體中分別大大降低到接近背景（圖3H、I）.相反，經(jīng)UVB暴露處理的ced-9（n1950）突變體秀麗隱桿線蟲生殖腺凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加，且無時(shí)間效應(yīng)關(guān)系（圖2G）.這些數(shù)據(jù)表明UVB可誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲程序性生殖細(xì)胞死亡.

細(xì)胞凋亡是響應(yīng)于活躍的生理刺激或環(huán)境毒素而引起的組織細(xì)胞死亡形式.在秀麗隱桿線蟲中，生殖細(xì)胞凋亡可以通過輻射，重金屬和某些致病菌等各種環(huán)境脅迫來啟動(dòng).本研究結(jié)果亦顯示UVB誘導(dǎo)了生殖細(xì)胞凋亡明顯增加（圖1C、D、E），其信號(hào)途徑組成原件抗凋亡Bcl-2直系同源物CED-9，Apaf-1直系同源物CED-4的核心細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑半胱天冬酶CED-3（圖3I），此兩種基因缺陷型突變體經(jīng)UVB暴露后無時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，從而表明此兩種基因參與抗凋亡調(diào)控.秀麗隱桿線蟲CEP-1是具有保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的p53的古老直向同源物.CEP-1通過激活靶基因egl-1的轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)生殖細(xì)胞死亡.我們通過使用cep-1和egl-1基因缺陷型突變體經(jīng)UVB暴露后計(jì)數(shù)其生殖腺凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)獲得的數(shù)據(jù)表明，UVB通過基因毒性途徑誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲的生殖細(xì)胞凋亡（圖1E和圖2F）.

針對(duì)C.elegans發(fā)育來說，有毒物質(zhì)潛在的毒性效應(yīng)，生殖提供了一個(gè)很好的指示作用.為了研究UVB對(duì)C.elegans發(fā)育的胚胎致死效應(yīng)來檢測其潛在的危害，我們檢測分析了C.elegans的細(xì)胞周期攔截和子代數(shù)目.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4和圖5所示，經(jīng)UVB暴露處理后，C.elegans的生殖腺有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，子代數(shù)量顯著降低.此結(jié)果提示經(jīng)UVB暴露的秀麗隱桿線蟲誘導(dǎo)了生殖腺細(xì)胞凋亡上升，進(jìn)而導(dǎo)致生殖能力下降；而有絲分裂區(qū)細(xì)胞數(shù)目減少也是造成生殖腺凋亡細(xì)胞數(shù)目增加的直接原因，因?yàn)閁VB照射損傷了秀麗隱桿線蟲有絲分裂區(qū)細(xì)胞.本研究顯示UVB導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲繁殖力下降的結(jié)果相同［14］.

綜上所述，以秀麗隱桿線蟲作為體內(nèi)模型，本研究證明了DDR信號(hào)傳導(dǎo)成分HUS-1，CEP-1，EGL-1，CED-9，CED-3和CED-4參與了細(xì)胞凋亡調(diào)控.該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮正向作用.并最終導(dǎo)致繁殖力下降，即UVB具有顯著的生殖毒性作用.

X51

A

1008-7974（2018）01-0047-05

10.13877/j.cnki.cn22-1284.2018.02.013

2017-11-02

安徽省教育廳青年人才基金項(xiàng)目（2012SQRL178）.

何梅，女，安徽長豐人，淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院講師；羅勛，博士，副教授（安徽 淮南 232001）.

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