(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江 佳木斯 154007)

鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的制備①

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體，探討制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的最優(yōu)處方及最佳制備工藝。方法：采用醋酸鈣梯度法制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體。以包封率為考察指標，在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化最優(yōu)處方及最佳制備工藝，采用紫外分光光度法對鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體包封率進行測定。結(jié)果：最終確定制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的最優(yōu)處方及最佳制備工藝為藥脂比1:20、孵育時間1.5h、醋酸鈣濃度100mmol/L、孵育溫度45℃，所制備的鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體包封率達80.94%。結(jié)論:醋酸鈣梯度法制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體方法可行，所制得載藥脂質(zhì)體包封率達到制劑學(xué)要求，且重現(xiàn)性好。

鹽酸法舒地爾；脂質(zhì)體；醋酸鈣梯度法；包封率

鹽酸法舒地爾具有廣泛的抗纖維化作用。鹽酸法舒地爾其化學(xué)名為：六氫-1-(5-磺?；愢?-1(H)-1, 4二氮-雜鹽酸鹽，分子式：C14H17N3O2SHCl，分子量為327.83，為白色、類白色或微黃色的結(jié)晶性粉末。無臭、微苦，有引濕性。極易溶于水，溶于甲醇。pH值為4.5～6.0。是1999年由日本旭化成株式會社上市的商品名為Eril的新型的鈣拮抗的血管擴張劑[1]。鹽酸法舒地爾是目前唯一用于臨床治療的Rho激酶抑制劑，Rho激酶在多種細胞發(fā)揮功能作用中有參與。鹽酸法舒地爾可以通過阻斷Rho激酶通路影響多種細胞發(fā)揮其功能，近而發(fā)揮其廣泛的藥理作用。鹽酸法舒地爾對于急性腦梗死預(yù)后改善[2]、蛛網(wǎng)膜下腔出血[3]、椎-基底動脈供血不足、血管痙攣[4]、心力衰竭、心絞痛[5]等都能夠產(chǎn)生治療作用。深入病例研究中發(fā)現(xiàn)，鹽酸法舒地爾在抑制肺、肝、心臟纖維化及尿道瘢痕等發(fā)病過程中起到了一定的抑制和改善作用。本實驗旨在制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體，探討制備的最優(yōu)處方及最佳制備工藝，為鹽酸法舒地爾微粒制劑的研究與開發(fā)提供參考。

1 儀器及材料、試劑

1.1 儀器

FA2004 電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；LE-80K型超高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；UV-2550紫外分光光度計(日本島津)；RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KQ-200KDB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料和試劑

鹽酸法舒地爾原料藥(上海源葉生物科技有限公司)；鹽酸法舒地爾對照品(上海源葉生物科技有限公司)；大豆卵磷脂(上海源葉生物科技有限公司)；膽固醇(上海源葉生物科技有限公司)；三氯甲烷(分析純)；磷酸氫二鈉(分析純)；磷酸二氫鈉(分析純)；甲醇 (分析純)；硫酸銨(分析純)；醋酸鈣(分析純)；pH6.5PBS(0.1mol/L，實驗室自制，分析純)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的制備方法

采用醋酸鈣梯度法制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體，精密稱取一定量的膽固醇和磷脂，用適量的三氯甲烷溶解，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35℃減壓蒸除有機溶劑成薄膜，加入一定濃度的醋酸鈣溶液20mL使薄膜脫落溶解，40℃常壓下水化1h使其均勻分散，制得空白脂質(zhì)體混懸液。以0.9%氯化鈉溶液為透析液，將制得的空白脂質(zhì)體混懸液透析至最適宜載藥pH值梯度范圍，稱取適量藥物置于透析過的空白脂質(zhì)體混懸液中，在一定溫度下進行孵育。即制得鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體混懸液。

2.2 正交試驗設(shè)計

在單因素實驗考察基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計，篩選影響脂質(zhì)體包封率的4個主要因素，每個因素設(shè)3個水平進行正交試驗設(shè)計。正交試驗因素水平見表1。

表1 因素水平表

以包封率為評價指標，以L9(34)正交表安排試驗。正交試驗結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2結(jié)果顯示，在本實驗所選取的因素和水平中，最優(yōu)處方及最佳制備工藝為A1B3C3D3，即主藥與磷脂質(zhì)量比為1:20、孵育時間為1.5h、醋酸鈣溶液濃度為100mmol/L、孵育溫度為45℃。由表3分析結(jié)果顯示，極差值越大，該因素影響越明顯，各因素影響的主次順序B>C>D>A。

2.3 鹽酸法舒地爾含量分析方法的建立

2.3.1 檢測波長的確定

本文采用紫外分光光度法對鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體中鹽酸法舒地爾的含量進行測定。精密稱取鹽酸法舒地爾5mg用甲醇溶解并定量稀釋成一定濃度的鹽酸法舒地爾甲醇溶液，根據(jù)《中國藥典》2015版中記載，鹽酸法舒地爾在275nm、312nm、324nm處均有紫外吸收峰，取鹽酸法舒地爾甲醇溶液在紫外波長200～300nm進行紫外掃描，見圖1。

圖1 鹽酸法舒地爾紫外掃描圖

2.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取鹽酸法舒地爾標準品10mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。即得100μg/mL的貯備液，分別精密量取貯備液0.60、0.90、1.50、2.40、3.00、4.50、5.40mL于10mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，以甲醇作為空白，于275nm處分別測定吸光度，以濃度(C)對吸光度(A)作線性回歸，繪制標準曲線，標準曲線見圖2。得回歸方程：A=0.0187C-0.0106(R2=0.9995)。結(jié)果表明：鹽酸法舒地爾在6.00～54.00μg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度對吸光度呈良好線性關(guān)系，符合Lanbert-Beer規(guī)則。

圖2 鹽酸法舒地爾含量測定的標準曲線

2.3.3 精密度

分別精密配制6.00、30.00、54.00μg/mL低、中、高三個濃度的供試品溶液，分別于275nm處紫外測定吸光度，1d內(nèi)連續(xù)測定6次，連續(xù)測3d。計算日內(nèi)RSD及日間RSD，取平均值。日內(nèi)RSD為0.61%，日間RSD為1.1%。

2.3.4 回收率

分別精密配制6.00、30.00、54.00μg/mL低、中、高三個濃度的供試品溶液，分別于275nm處紫外測定吸光度，同一天內(nèi)測定3次，計算回收率，其平均回收率為99.49%，RSD為0.24%。

2.4 鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體包封率的測定

精密量取載藥脂質(zhì)體混懸液1mL置于2mL的離心管中，高速冷凍離心機4℃、12000r/min、離心2h，取上清液0.5 mL置于10mL容量瓶中甲醇稀釋定容，經(jīng)紫外測定，記錄吸光度(A)值，代入標準曲線中，計算出樣品中游離鹽酸法舒地爾的濃度C游；另精密量取同一批載藥脂質(zhì)體混懸液1mL置于2mL離心管中，加入0.5mL甲醇溶液，超聲15min破膜，高速冷凍離心機4℃、12000r/min、離心2h，取上清液0.5mL置于10mL容量瓶中甲醇稀釋定容，經(jīng)紫外測定，記錄吸光度(A)值，代入標準曲線中計算樣品中鹽酸法舒地爾的總濃度C總；按照下式計算出鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的包封率：包封率=(1-C游/C總)×100%。測得3批樣品平均包封率為(81.24±3.45)%。

3 討論

3.1 鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體制備方法的選擇

鹽酸法舒地爾為弱酸性、水溶性藥物，目前，采用薄膜分散法等所制備的載水溶性藥物脂質(zhì)體的包封率較低，為提高載藥脂質(zhì)體包封率，本文通過比較篩選，最終確定采用pH梯度法中的醋酸鈣梯度法制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體，在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化處方及制備工藝，最終確定了制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體的最優(yōu)處方及最佳制備工藝。該方法操作簡單，適用于弱酸性、水溶性藥物鹽酸法舒地爾載藥脂質(zhì)體的制備，且包封率達到制劑學(xué)要求，方法重現(xiàn)性好。

3.2 透析除鹽法在醋酸鈣梯度法制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體過程中的應(yīng)用

在考察醋酸鈣梯度法的pH梯度過程中，采用透析除鹽的方法，在透析過程中，要求操作嚴格縝密，考察透析液加入量、透析時間等因素的影響，以確保透析操作產(chǎn)生的pH梯度達到高包封率的條件，并保證實驗的重復(fù)性良好。同時，醋酸鈣梯度法制備鹽酸法舒地爾脂質(zhì)體過程中，采用透析法作為除鹽方法，方法簡便，易于操作。

[1]孟祥軍, 齊杰, 田莉. 鹽酸法舒地爾的合成、藥理和臨床研究進展[J]. 沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2010, 12(1): 45-50

[2]莊禮源. 鹽酸法舒地爾在改善腦梗死患者預(yù)后中的作用研究[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究, 2017, 15(9): 101-103

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[4]焦洋, 周云松, 熊葶. 鹽酸法舒地爾治療蛛網(wǎng)膜下腔出血所致腦血管痙攣的臨床分析[J]. 臨床醫(yī)學(xué)研究與實踐, 2017, 4(10):15-16

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Thepreparationoffasudilhydrochlorideliposomes

HUYan-qiu1,HUJun-hua2,SUNChang-hai1,ZHANGYun-jie1,CHAIJia-li1,LIUWen-wen1

(1.College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2.Jiamusi Center for Disease Control and Prevention, Jiamusi 154007, China)

ObjectiveTo prepare and discuss optimal prescription and the best preparation process for fasudil hydrochloride liposomes.MethodThe fasudil hydrochloride lipsomes were prepared by calcium acetate gradient method. Based on the single factor experiment, the optimum formulation and optimum preparation were optimized by orthogonal design. The encapsulation efficiency of fasudil hydrochloride lipsomes were determined by ultraviolet-visible spectrophotometry.ResultsThe optimum formulation and optimum preparation for fasudil hydrochloride liposomes were as follows: the proportion of fasudil hydrochloride and lipids in weight was 1:20, incubation time was 1.5h, the concentration of calcium acetate was 100mmol/L, incubation temperature was 45°C. The encapsulation efficiency of fasudil hydrochloride liposomes were 80.94%.ConclusionsCalcium gradient preparation of fasudil hydrochloride liposome method is feasible, the prepared drug loaded liposomes reached the requirements of pharmaceutics, and had good reproducibility.

fasudil hydrochloride; liposome; calcium acetate gradient method; encapsulation efficiency

1.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目，編號：201510222006;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)研究類(自然類)面上項目，編號：JMSUJCMS2016-068；3.黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題，編號：2016-323。

胡艷秋(1983～)女，黑龍江雙鴨山人，碩士，講師。

胡俊華(1985～)男，黑龍江雙鴨山人，學(xué)士，主管藥師。E-mail: huyanqiu8392@163.com。胡艷秋1，胡俊華2，孫長海1，張云杰1，柴佳麗1，劉文文1

R285.5

A

1008-0104(2017)06-0028-03

2017-05-18)