趙燕平 余亞平 胡 潔

浙江省中醫(yī)院下沙院區(qū) 浙江 杭州 310018

破壁靈芝孢子粉對刀豆蛋白A誘導(dǎo)免疫損傷小鼠外周血CD4+和CD8+細(xì)胞因子水平的影響及護(hù)肝作用*

趙燕平 余亞平 胡 潔

浙江省中醫(yī)院下沙院區(qū) 浙江 杭州 310018

破壁靈芝孢子粉 刀豆蛋白A 免疫損傷 小鼠

細(xì)胞水平抗病毒是目前臨床上治療慢性乙型肝炎（以下簡稱“慢乙肝”）的最有效手段，但現(xiàn)有抗病毒藥物只能抑制病毒而不能清除病毒[1]。目前的共識是，激活機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答，特別是增強(qiáng)HBV特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答是打破HBV感染耐受、達(dá)到清除病毒的關(guān)鍵因素[2-3]，而中醫(yī)藥在慢乙肝免疫調(diào)控上具有獨(dú)特的優(yōu)勢。破壁靈芝孢子粉是臨床和民間常用的提高正氣、增強(qiáng)免疫的珍貴中藥，筆者采用ConA誘導(dǎo)免疫肝損傷小鼠模型，觀察破壁靈芝孢子粉干預(yù)效果，探討破壁靈芝孢子粉的護(hù)肝作用及其可能的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：采用清潔級Balb/c雄性小鼠46只，體重20～30g，6～8周齡，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號[SCXK（滬）2013-2016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障環(huán)境內(nèi)，使用許可證號[SYXK（浙）2013-0184]，環(huán)境溫度為23±1℃，相對濕度為50%～65%，飼喂全價營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水。

1.2 藥物和試劑：破壁靈芝孢子粉：購自壽仙谷藥業(yè)公司，使用時用生理鹽水調(diào)配成兩組濃度備用：低劑量組0.1g/ml、高劑量組0.2g/ml；刀豆蛋白A(ConA)購自Sigma公司（C2010，批號80M7680V），使用時溶于生理鹽水；肝功能氨基轉(zhuǎn)移酶試劑購自德國DiaSysDiagnoticsSystemsGmbH(批號分別為07235/00002244、07218/00001951)；抗CD4FITC，抗CD8FITC熒光單克隆抗體：購自BD公司（批號分別為557303、553035）。

1.3 方法：分述如下。

1.3.1 分組造模與給藥：將46只Balb/c雄性小鼠正常飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組：空白組10只；模型組12只；低劑量破壁靈芝孢子粉組（低靈組）12只；高劑量破壁靈芝孢子粉組（高靈組）12只?？瞻捉M正常飼養(yǎng)。造模參考劉光偉等[4]的方法，模型組及低靈組、高靈組均用ConA 5mg/kg尾iv，隔天1次，共2周。造模成功后，空白組及模型組予生理鹽水0.1ml/10g ig，低靈組和高靈組分別用破逼靈芝孢子粉以1.0g/kg及2.0g/kg ig，共4周。

1.3.2 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測：4周后摘眼球取血，檢測ALT、AST水平，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心協(xié)助完成。

1.3.3 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測：摘眼球取血，加入抗凝管，PBS緩沖液稀釋，加入淋巴細(xì)胞分離液，1800r/min，離心10min，吸取白色絮狀淋巴細(xì)胞層，PBS緩沖液洗滌2次，棄上清，加抗體試劑，流式檢測。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 破壁靈芝孢子粉對小鼠血清ALT、AST水平的影響：實(shí)驗(yàn)過程中，由于灌胃操作失誤，導(dǎo)致高靈組死亡2只，低靈組死亡1只。破壁靈芝孢子粉干預(yù)后，小鼠ALT、AST水平較模型組明顯好轉(zhuǎn)，高靈組較低靈組好轉(zhuǎn)更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示破壁靈芝孢子粉可以改善ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷。具體見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST的比較（±s，U/L）

表1 各組小鼠血清ALT、AST的比較（±s，U/L）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低靈組比較，&P＜0.05。

AST 86.45±28.76 223.63±77.31*101.76±34.56#&134.38±42.67#組別空白組模型組高靈組低靈組只數(shù)10 12 10 11 ALT 67.45±23.46 201.78±62.47*92.76±33.78#&129.62±44.65#

2.2 破壁靈芝孢子粉對外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響：與空白組比較，模型組小鼠CD4+%明顯上升、CD8+%明顯下降，藥物干預(yù)后，小鼠CD4+%下降、CD8+%上升，且在一定范圍內(nèi)，藥物濃度越高，效果越明顯。具體見表2。

表2 各組外周血T細(xì)胞亞型的比較（±s）

表2 各組外周血T細(xì)胞亞型的比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低靈組比較，&P＜0.05。

CD4+/CD8+3.29±1.78 21.5±12.5*2.99±0.7#&11.57±7.5#組別空白組模型組高靈組低靈組只數(shù)10 12 10 11 CD4+%10.5±2.6 29.6±3.1*19.2±2.4#&22.1±4.4#CD8+%3.8±1.5 1.6±0.5*6.6±1.3#&3.42±1.2#

3 討論

慢乙肝的發(fā)病與機(jī)體的免疫功能紊亂密切相關(guān)，其中HBV特異性的CD4+和CD8+T細(xì)胞的低擴(kuò)增和弱效應(yīng)作用被確認(rèn)為是其中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。CD4+T細(xì)胞因其具有輔助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能被稱為輔助性T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞主要為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），可以識別并殺傷HBV感染的細(xì)胞，因此CD4+/CD8+比值的改變可以直接反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)。如果我們能通過藥物等手段調(diào)整T淋巴細(xì)胞亞群的失衡，減弱其免疫抑制功能，提高表位特異性CTL的免疫效應(yīng)，將為慢乙肝的治療找到新的策略。

現(xiàn)有的免疫抑制劑如胸腺肽、治療性乙肝疫苗因存在療效不夠理想、價格昂貴、注射不便等原因?qū)е屡R床應(yīng)用不多。近年來研究較多的Toll樣受體激動劑、CTL調(diào)節(jié)劑、TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞治療等[5-6]尚局限在動物實(shí)驗(yàn)或小樣本臨床研究。中醫(yī)藥作為我國防治慢乙肝的重要措施，雖然在直接抑制病毒復(fù)制的近期療效方面與干擾素、核苷類似物存在一定差距，但在整體免疫調(diào)控上卻有著獨(dú)特的優(yōu)勢，如豬苓多糖、香菇多糖、云芝多糖等藥物成分可以提高巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)形成和轉(zhuǎn)化，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生多種與免疫和抗炎反應(yīng)有關(guān)的生物活性因子，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生[7]。因此研發(fā)出具有相關(guān)免疫調(diào)控作用的中藥，使其與直接抑制病毒復(fù)制的西藥聯(lián)合應(yīng)用，將病因治療和病機(jī)治療有機(jī)地結(jié)合起來，就有可能從根本上提高療效。

靈芝，又稱“仙草”，是一種珍貴的藥用真菌，靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的淡霧狀的極其微小的孢子，含有比靈芝子實(shí)體更加豐富的多糖類、三萜類、脂肪酸類、氨基酸等活性成分，具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗炎、保肝、抗病毒等功能，且破壁后的靈芝孢子粉效果更好[8]。臨床醫(yī)生及民間百姓也會將靈芝制劑用于慢乙肝、紅斑狼狼瘡、萎縮性肌強(qiáng)直、惡性腫瘤等免疫功能低下患者疾病的治療中[9]，但尚缺乏大樣本、系統(tǒng)化的研究。

ConA是誘導(dǎo)免疫性肝損傷的經(jīng)典試劑，其機(jī)制與T細(xì)胞和KC細(xì)胞相關(guān)，與人類慢性肝炎發(fā)病機(jī)制非常相似[10]，我們以ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷為模型，模擬慢乙肝的免疫失衡狀態(tài)，觀察破壁靈芝孢子粉干預(yù)后的血清ALT、AST水平外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化。研究發(fā)現(xiàn)破壁靈芝孢子粉可以有效降低小鼠血清肝酶水平，下調(diào)小鼠外周血的CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、而CD8+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯上升，說明破壁靈芝孢子粉可能通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群比例，減弱CD4+輔助性T細(xì)胞及相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞因子對機(jī)體的免疫抑制作用，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)CTL識別并滅殺感染細(xì)胞的作用，且隨著藥物劑量的增加，其護(hù)肝及免疫調(diào)節(jié)作用在一定范圍內(nèi)有所提高。筆者預(yù)測破壁靈芝孢子粉可以通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例、提高CTL活性來幫助機(jī)體產(chǎn)生有效抗病毒免疫應(yīng)答，提高抗病毒療效。今后我們也將更深入地研究破壁靈芝孢子粉的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及臨床療效，希望為實(shí)現(xiàn)慢乙肝的臨床治愈提供更多安全有效的藥物選擇。

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2017-08-17