孫 原 石秋艷 王德龍 張春陽 李 弘 楊 斌 李艷玲

華北理工大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 唐山 063000

·論著科研之窗·

瑞替加濱對大鼠局灶性缺血再灌注損傷的保護機制

孫 原 石秋艷 王德龍 張春陽 李 弘 楊 斌 李艷玲

華北理工大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 唐山 063000

目的研究M型鉀離子通道開放劑瑞替加濱(retigabine，RTG)對大鼠局灶性缺血再灌注損傷的影響。方法選取SD大鼠110只，隨機分為假手術組(10只，Sham組)，模型對照組(20只，MCAO組)，治療組(80只，RTG組)。按照給藥時間再將RTG組分為0 h、1 h、3 h及6 h 4個亞組，每組20只。采用線栓-再通法建立大鼠模型，于腦缺血2 h后恢復灌注。RTG組經(jīng)尾靜脈注射瑞替加濱10.5 mg/kg，假手術組和缺血再灌注組給予等量生理鹽水。比較腦梗死體積變化，并進行神經(jīng)功能評分，檢測各組大鼠缺血半影區(qū)星形膠質細胞的增殖和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3) 的表達，觀察梗死皮質區(qū)域神經(jīng)元的存活數(shù)量。結果Sham組未發(fā)現(xiàn)腦梗死病灶，無神經(jīng)功能損傷，Caspase-3陽性細胞及星形膠質細胞少見，腦皮質含有大量神經(jīng)元。MCAO組和RTG組均可見大腦中動脈供血區(qū)梗死灶及神經(jīng)功能損傷，但RTG治療組梗死體積及神經(jīng)功能評分均較MCAO組明顯減少(P<0.05)，RTG6h組較其他給藥組大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能評分增加(P<0.05)。MCAO組大鼠梗死周圍區(qū)Caspase-3陽性細胞數(shù)、星形膠質細胞明顯增多，梗死區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，但RTG各組大鼠梗死周圍區(qū)Caspase-3陽性細胞數(shù)、星形膠質細胞均較MCAO組明顯下降(P<0.05)，梗死區(qū)神經(jīng)元的存活數(shù)量明顯增加(P<0.05)，RTG0h組、RTG1h、RTG3h組最為明顯。結論瑞替加濱對缺血性腦卒中具有腦保護作用，其機制可能是降低神經(jīng)細胞的興奮性，減輕缺血半影區(qū)的炎癥反應，從而抑制細胞凋亡。瑞替加濱的腦保護作用具有時間依賴性，即超過一定的時間窗，腦保護作用會減弱。

瑞替加濱；腦卒中；腦梗死；鉀離子通道；缺血再灌注損傷；神經(jīng)興奮性毒性；腦保護；大鼠

缺血性腦卒中已成為成人死亡和殘疾的主要原因之一，腦缺血后繼發(fā)性腦損傷涉及多種機制，包括興奮性氨基酸毒性、自由基產(chǎn)生、鈣超載、炎癥反應和凋亡等，這些因素相互影響，是加重腦神經(jīng)損傷的重要原因。其中興奮性氨基酸毒性是缺血再灌注損傷級聯(lián)反應中非常關鍵的一個環(huán)節(jié)。因此，以降低神經(jīng)細胞的病態(tài)興奮性為靶點，治療缺血性腦卒中具有潛在的臨床價值。瑞替加濱(RTG)是第一個應用于臨床的M型鉀離子通道開放劑[1]，因其能明顯降低神經(jīng)元的興奮性主要用于抗癲癇治療與研究。也有研究提示瑞替加濱對缺血性腦卒中再灌注損傷有一定的抑制作用[2]。

本實驗通過觀察不同組SD大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能評分，同時測定各組缺血半影區(qū)星形膠質細胞、Caspase-3陽性細胞及梗死皮質區(qū)域神經(jīng)元存活數(shù)量，研究瑞替加濱對SD大鼠急性局灶性腦梗死缺血再灌注損傷的影響，并為臨床治療缺血性腦卒中提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1．1實驗動物與分組雄性(Sprague Dawley SD)大鼠，清潔級，體質量240～260 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究動物實驗中心提供，大鼠在實驗室適應性喂養(yǎng)1～2周。用正常飼料喂養(yǎng)大鼠，自由飲水。實驗前采用抽簽法隨機分為：(1)假手術組(Sham組)10只；(2)模型對照組(MCAO組)20只；(3)治療組(RTG組)80只。按照給藥時間的不同RTG組再分為RTG0h組、RTG1h組、RTG3h組、RTG6h組，每組20只大鼠。

1．2制作動物模型大鼠術前禁食5 h，10%水合氯醛(3.5 mg/kg)腹腔注射麻醉。參照 Longa 法[3]，使用尼龍線栓(型號：2634-A4，北京西濃科技有限公司，中國)堵塞大鼠右側大腦中動脈。在缺血120 min后，取出線栓，并恢復頸總動脈血供。使用動物體溫維持儀確保大鼠的核心體溫在36 ℃～37 ℃。假手術組動物的處理除不插入線栓外，其余操作過程與模型制作過程一致。

1．3給藥時間和劑量模型建立成功后，RTG組通過大鼠尾靜脈分別在恢復灌注的0 h、1 h、3 h、6 h給予瑞替加濱(10.5 mg/kg)[4]，假手術組和模型對照組給予等量生理鹽水。

1．4檢測指標及方法

1．4．1 腦梗死體積：每組10只大鼠用于TTC染色，給藥24 h后給予大鼠注射致死劑量的水合氯醛，斷頭、取腦、去除嗅球、小腦及低位腦干，將腦置于-20 ℃冰凍15 min。自前極(anterior pole)向后連續(xù)切取2 mm厚度腦冠狀切片，置37 ℃的2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)(上海精析化工)生理鹽水溶液中，37 ℃避光孵育 30 min，之后在4%甲醛溶液中4 ℃固定過夜。拍攝照片，Image-pro plus 6.0 圖像分析軟件進行圖像分析(美國 Media Cybemetics公司)，計算并統(tǒng)計腦梗死體積。

1．4．2 Zea-Longa 評分標準[5]：0分：無明顯神經(jīng)缺損癥狀；1分：提尾垂直時不能伸展左側前肢；2分：行走時向左側繞圈；3分：行走時身體向左側傾倒；4分：不能自行行走，意識喪失。

1．4．3 免疫組化法檢測缺血半影區(qū)星形膠質細胞、Caspase-3蛋白及梗死皮質區(qū)域神經(jīng)元：腦缺血灌注24 h后，斷頸處死SD大鼠，斷頭取腦，制備石蠟切片，切片常規(guī)脫蠟至水，過氧化物酶溶液阻斷，5%山羊血清封閉，微波爐抗原修復，PBS 漂洗后依次滴加兔抗Caspase-3抗體(1：100，Affinity)，兔抗GFAP抗體(1：800，Millipore)，兔抗NeuN 抗體(1：200，Millipore)，4 ℃過夜，使用0.01 PBS漂洗3次，每次5 min，滴加二抗：羊抗兔抗體(1：100，北京中杉金橋生物技術公司)，37 ℃ 1 h，PBS 漂洗后DAB顯色。平均每張切片取5個視野，算出每個視野的Caspase-3陽性細胞、星形膠質細胞及皮質神經(jīng)元的數(shù)量，并計算其平均數(shù)。

2 結果

2．1腦梗死體積及神經(jīng)行為評分測定Sham組未見梗死灶形成；MCAO組及RTG組可見不同程度梗死灶形成；與MCAO組相比，RTG0h、RTG1h、RTG3h及RTG6h組腦梗死體積明顯減小(P<0.05)。RTG組大鼠神經(jīng)功能評分均好于MCAO組(P<0.05)，RTG6h組較0 h、1 h、3 h給藥組SD大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能評分明顯增加(P<0.05，表1)。

2．2各組大鼠缺血半影區(qū)星形膠質細胞的表達情況免疫組化結果顯示，Sham組星形膠質細胞形態(tài)正常，細胞突起細長，胞體小，數(shù)量少。MCAO組與RTG治療組缺血半影區(qū)均出現(xiàn)大量的星形膠質細胞，胞體變大，突起增粗。但是RTG治療組星形膠質細胞的數(shù)量低于MCAO組(P<0.05)，且RTG0h、RTG1h及RTG3h組更為明顯(圖1)。

表1 各組大鼠腦梗死體積、 Longa 評分比較

注：與Sham組相比，△P<0.05；與MCAO組相比，*P<0.05；與RTG6h組相比，#P<0.05

注：與Sham組相比，#P<0.05；與MCAO組相比，*P<0.05圖1 各組SD大鼠缺血半影區(qū)星形膠質細胞表達 A：Sham組；B：MCAO組；C：RTG0h組；D：RTG1h組；E：RTG3h組；F：RTG6h組

2．3各組大鼠缺血半影區(qū)Caspase-3的表達情況免疫組化結果顯示，生理情況下，Caspase-3陽性細胞少見，在MCAO組和RTG組梗死周圍區(qū)均可見大量Caspase-3陽性表達細胞。與MCAO組(79.07±12.3)相比，RTG各時間點治療組Caspase-3 表達(RTG0h：32.1±7.7；RTG1h：33.4±5.1；RTG3h：36.1±6.7；RTG6h：53.7±10.8)均較MCAO組明顯減少(P<0.05)，但6 h給藥組較其他時間點給藥組Caspase-3陽性細胞表達增多(圖2)。

圖2 各組SD大鼠缺血半影區(qū) Caspase-3陽性細胞表達(免疫組化×400)比較 A：Sham組；B：MCAO組；C：RTG0h組；D：RTG1h組；E：RTG3h組；F：RTG6h組

2．4各組大鼠梗死皮質區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量情況免疫組化結果顯示，生理情況下，腦組織皮質含有大量神經(jīng)元，細胞排列緊密MCAO組，梗死皮質區(qū)所含神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，而RTG各時間點治療組存活神經(jīng)元較MCAO組明顯增多(P<0.05)，其中0 h、1 h、3 h給藥組最為明顯(圖3)。

3 討論

瑞替加濱因具有穩(wěn)定神經(jīng)元膜電位，抑制興奮性等特點，目前已作為部分癲癇發(fā)作治療藥物[5]。瑞替加濱的作用靶點是M型鉀離子通道，神經(jīng)元上的M型鉀離子通道是一種電壓依賴性通道，在能夠引起動作電位的閾電壓時開放，具有較慢的通道動力學特征[6]。M通道由 KCNQ(Kv7)家族構成，這些同源性或異源性的亞基構成的M通道在穩(wěn)定神經(jīng)元膜電位以及調節(jié)神經(jīng)沖動的發(fā)放上具有重要作用[7]。瑞替加濱能夠通過增強KCNQ2/3亞型鉀通道功能，促使膜電位回到靜息態(tài)而降低神經(jīng)細胞的興奮性，減少興奮性神經(jīng)遞質谷氨酸的釋放[8-9]。

興奮性神經(jīng)毒性最早由Olney[10]研究發(fā)現(xiàn)，其病理生理機制：腦缺血后細胞膜電位丟失，隨著能量耗竭，Na+-K+-ATP酶失活，神經(jīng)元和膠質細胞去極化，神經(jīng)元的興奮性增高，大量的興奮性神經(jīng)遞質谷氨酸釋放并蓄積，釋放到細胞外隙，激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)型谷氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)，從而引起神經(jīng)元的損傷[11-13]。因RTG能使細胞內(nèi)大量鉀離子外流降低神經(jīng)元的過度興奮性，所以，我們猜想RTG能夠有效減少谷氨酸的釋放，從而抑制神經(jīng)細胞的損傷。本實驗顯示，RTG能夠減輕SD大鼠神經(jīng)功能損傷，縮小腦梗死面積，抑制缺血半影區(qū)炎癥反應及細胞凋亡，減少梗死皮質區(qū)域神經(jīng)細胞死亡，從不同角度證實RTG對腦缺血后大鼠具有神經(jīng)保護作用。在缺血再灌后6 h前給藥這種保護作用最為明顯。另外，我們之前的實驗研究發(fā)現(xiàn)[14]，給予小鼠M型鉀離子通道阻滯劑XE991后，小鼠的腦缺血損傷加重。亦有研究表明，腦缺血后為了對抗谷氨酸的大量釋放，GABA 的含量明顯增多以拮抗缺血引起的谷氨酸興奮毒性，保護神經(jīng)元的損傷[15]。故這些研究成果成為M型鉀離子通道開放劑可以抑制缺血再灌注后興奮性毒性的有力證據(jù)。

注：與Sham組相比，*P<0.05；與MCAO組相比，#P<0.05圖3 各組SD大鼠腦梗死區(qū)域神經(jīng)元的存活數(shù)量(免疫組化×200) A：假手術組；B：MCAO組；C：RTG0h組；D：RTG1h組；E：RTG3h組；F：RTG6h組

研究顯示，因興奮性毒性加重的炎癥反應在缺血性腦卒中的病理進程中發(fā)揮重要作用[16]。腦缺血數(shù)小時內(nèi)即可啟動炎癥反應過程，腦內(nèi)的星形膠質細胞及小膠質細胞被激活并伴隨外周中性粒細胞及淋巴細胞等的浸潤，并釋放大量的炎癥因子，如TNF-α或IL-1β等促進神經(jīng)元的凋亡[17]。目前有許多文獻報道，在腦缺血再灌注損傷中，星形膠質細胞的活化與增殖是一把雙刃劍，一方面，活化的星形膠質細胞釋放大量的炎癥因子，加重缺血再灌注損傷[18]；另一方面，星形膠質細胞的大量增殖又能夠在梗死區(qū)域與周邊區(qū)之間形成一道屏障，阻止梗死區(qū)域釋放的大量具有毒性物質向周邊區(qū)域擴散，從而達到控制梗死范圍的作用[19]。那么，M型鉀離子通道開放劑對缺血性再灌注損傷中的保護作到底是有利還是有害的？實驗顯示，RTG組活化的星形膠質細胞減少，同時大鼠神經(jīng)功能損害明顯改善，凋亡蛋白Caspase-3表達減少及梗死區(qū)存活的神經(jīng)元明顯增多，因此我們推測，RTG應該能夠通過抑制星形膠質細胞興奮性，減少其增殖及活化，并抑制其釋放炎癥因子，達到保護神經(jīng)元的作用，而更加確切的結論還需要我們深入研究。RTG對腦缺血再灌注損傷的保護作用在再灌注后6 h給藥效果減弱，提示RTG的治療作用具有時間依賴性，這可能與興奮性毒性主要存在于缺血再灌注損傷的早期有關。

綜上所述，M型鉀離子通道開放劑瑞替加濱可以通過抑制腦缺血后神經(jīng)元的過度興奮，減輕興奮性神經(jīng)毒性對神經(jīng)元的損傷。而具體機制可能是通過抑制腦梗死區(qū)炎癥反應及細胞凋亡達到保護神經(jīng)元的作用。而瑞替加濱的這種治療作用具有一定的時間依賴性，即超過一定的時間窗，治療作用會減弱。獲取M型鉀離子通道開放劑瑞替加濱能夠減少興奮性神經(jīng)遞質——谷氨酸釋放的直接證據(jù)將是我們下一步研究的重點。

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Theprotectiveeffectsandmechanismsofretigabineforthereperfusioninjuryofcerebralinfarction

SUNYuan，SHIQiuyan，WANGDelong，ZHANGChunyang，LIHong，YANGBin，LIYanling

DepartmentofNeurology，NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital，Tangshan063000，China

ObjectiveTo studies impacts of retigabin，a M-type potassium channel opener，on focal cerebral ischemia/reperfusion induced neural injury．MethodsTotally 110 SD rats were randomly divided six groups：sham group (n=10)，MCAO group (n=20) and RTG-treatment group．RTG-treatment group was also divided into RTG0h group (n=20)，RTG1h group (n=20)，RTG3h group (n=20) and RTG6h group (n=20)．The temporary middle cerebral artery occlusion reperfusion model was made by the suture method，reperfusion 2 hours after cerebral ischemia．In RTG-treatment groups，a single dose of 10.5 mg/kg RTG was injected at the designated varying time points (at 0 hour，1 hour，3 hours and 6 hours after the reperfusion)．The sham-operated group and MCAO group

the same volume of saline．Infarct size was measured；the neurological function was scored．The number of astrocytes and Caspase-3(+) cells in the ischemic penumbra，and neurons in the infarct area were detected．ResultsIn the sham group，no infarction was observed，hippocampal neurons had no obvious change，astrocytes and caspase-3(+) cells were hardly to be found，a large number of neurons can be found．MCAO group and RTG group showed cerebral artery infarction and the damage of neurological function，but the infarction volume and neurological outcome scores of the RTG-treatment group were lower than those of the MCAO group (P<0.05)．Compared with RTG0h，RTG1h and RTG3h group，the cerebral infarction volume and neurological outcome scores of RTG6h group were significantly increased (P<0.05)．A lot of astrocytes and caspase-3(+) cells were found in the MCAO group，however，only very few neurons were found in the infarct zone．Compared with the MCAO group，the expressions of astrocytes and caspase-3(+) cells decreased significantly and the number of surviving neurons was significantly increased in the RTG-treatment group (P<0.05)，especially at 0 hour，1 hour and 3 hours group，when compared with RTG6h group．ConclusionRTG has protective time-dependent effect in cerebral ischemic reperfusion injury．

Retigabine；Stroke；Cerebral infarction；Potassium channel；Ischemic reperfusion injury；Nervous excitability toxicity；Brain protection；Rats

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.21.001

河北省衛(wèi)生廳課題(編號：20150082)

孫原(1974-)，男，碩士，副主任醫(yī)師。研究方向：腦血管病。Email：sunyuandoctor@163．com

R-332

A

1673-5110(2017)21-0001-06

(收稿2017-09-27)

夏保軍