顧亞萍，喬方，方長發(fā)，胡祥娜，王瑞，林慧純，張士瑞，禹紹周，張曉強(qiáng)

1(深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，廣東 深圳，518040) 2(深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院， 廣東 深圳， 518055)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定白菜中的甲醛含量

顧亞萍1，喬方2*，方長發(fā)2，胡祥娜1，王瑞1，林慧純1，張士瑞1，禹紹周1，張曉強(qiáng)1

1(深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，廣東 深圳，518040) 2(深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院， 廣東 深圳， 518055)

文中使用2,4-二硝基苯肼衍生法使白菜中甲醛生成甲醛-2,4-二硝基苯腙，再使用乙腈提取富集甲醛-2,4-二硝基苯腙(衍生物)，后經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對其濃度進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，該法中甲醛的檢出限為3.06 μg/kg，當(dāng)白菜中甲醛添加含量在1～18 mg/kg時，甲醛線性良好(r2=0.994)。對白菜中3種濃度(0.5、1、5 mg/kg)甲醛添加進(jìn)行6次平行回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，3種濃度平行添加回收率在102%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3%～8%，回收穩(wěn)定，精密度良好。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；白菜；甲醛；2,4-二硝基苯肼

自2012年有媒體報(bào)道甲醛浸泡白菜或噴灑白菜以延長保存期以來，消費(fèi)者對白菜的食用擔(dān)憂很大。但作為非法添加的甲醛濃度測量，相關(guān)檢測方法卻缺失。一般都是參考其他的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測[1-5]。

甲醛的測定按使用儀器分類，主要有分光光度法、液相色譜法、氣質(zhì)法等。其中，分光光度法測定的是醛類的總和，因而結(jié)果會比實(shí)際添加值高[6]；液相色譜法，雖然可以使用液相色譜柱分開各種醛類，但白菜基質(zhì)復(fù)雜，紫外下干擾物質(zhì)較多 ,影響檢測基線和和低濃度時甲醛的定量[7-10]。氣質(zhì)法干擾少，應(yīng)用前景廣，但前處理時間長，步驟繁瑣[11-12]。

此外，樣品處理過程也是影響甲醛測定的一個重要因素。現(xiàn)有的研究中衍生法最為簡單，即Nash試劑(乙酰丙酮)法[4,13]、苯肼法[3,5,14-15]和五氟芐基羥基胺鹽法[16-17]。其中，Nash法的的反應(yīng)物和產(chǎn)物易溶于水，更加適合于啤酒等液體類樣品的測定。五氟芐基羥基胺鹽法中反應(yīng)物價(jià)格昂貴，主要用于氣體中恒量甲醛的測定。而苯肼法是食品中甲醛測定的最佳衍生物，其反應(yīng)物2,4-二硝基苯肼和產(chǎn)物苯腙溶于乙腈，衍生時間短，可通過氮吹方式置換試劑，使其同時適合氣質(zhì)、液質(zhì)的檢測。

本文在原苯肼法的基礎(chǔ)上，用乙腈提取衍生化產(chǎn)物甲醛-2,4-二硝基苯腙，再結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀對甲醛-2,4-二硝基苯腙含量進(jìn)行測定，前處理方法簡單，與液相色譜法相比，由于使用母離子和二級離子的2次篩選，因而干擾物更少。方法回收穩(wěn)定，精密度好。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，XEVO TQ-S(WATERS公司，美國)，軟件為Masslynx；Millipore純水機(jī)，Elix5(Millipore公司，美國)；旋渦混合器，XH-B(江蘇省姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司，中國)；臺式高速離心機(jī)，TG16G(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司，中國)；超聲波清洗器，AS30600BDT(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；恒溫水浴搖床，WNE10(MEMMERT，美國)；電子天平，BS200S-WE1(Sartorius，德國)；營養(yǎng)調(diào)理機(jī)，CBS2061E(艾美特有限公司，中國)。

2,4-二硝基苯肼和甲醛-2,4-二硝基苯腙均為分析純，購自Sigma公司；甲醛標(biāo)準(zhǔn)品購自廣州奧譜析有限公司；乙腈為色譜純，購自德國默克公司；NaCl為分析純，購自西隴化工股份有限公司。甲酸和乙酸銨為優(yōu)級純，購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；乙酸鈉和冰乙酸均為分析純，購自Sigma上海安譜科學(xué)儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

實(shí)驗(yàn)用白菜購自市場。

樣品提取液上機(jī)前經(jīng)0.22 μm的PTFE濾膜過濾至2 mL HP小瓶中，濾膜和HP小瓶均購自安捷倫科技有限公司。

1.2 溶液的配置

2,4-二硝基苯肼溶液：稱取2,4-二硝基苯肼300 mg，用乙腈溶解定容至500 mL，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

緩沖溶液(pH 5)：稱取2.64 g乙酸鈉，以適量水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL,安培瓶封裝，置于10 ℃以下保存。使用前與室溫平衡，搖動均勻，打開后轉(zhuǎn)移至棕色瓶密封0～5 ℃保存。

甲醛工作液：將甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至10 μg/mL后轉(zhuǎn)移至棕色瓶密封0～5 ℃保存。

甲醛質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別為0.671和0.809mg/mL，安培瓶封裝，置于10 ℃以下保存。使用前與室溫平衡，搖動均勻，準(zhǔn)確量取1 mL轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中用水定容，混勻后置于棕色瓶密封0～5 ℃保存。

甲醛-2,4-二硝基苯腙標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL,安培瓶封裝，置于10 ℃以下保存。

甲醛-2,4-二硝基苯腙工作溶液：200 μg/mL。甲醛-2,4-二硝基苯腙標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫平衡，搖動均勻，打開后準(zhǔn)確量取1 mL轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，混勻后置于棕色瓶密封0～5 ℃保存。

1.3 樣品處理

使用營養(yǎng)調(diào)理機(jī)將白菜充分?jǐn)囁椴⒒靹颍瑯悠分糜谒芰蠘悠吠胫欣鋬霰４嬉怨y定。

測定時，準(zhǔn)確稱取樣品2 g(精確至0.000 g)至25 mL塑料離心管中，加入10 mL 2,4-二硝基苯肼溶液和10 mL緩沖溶液(pH 5)，加蓋振蕩器上搖勻1 min。將其置于60 ℃水浴中振搖1 h。每隔20 min，取出振蕩器上搖勻1 min。取出將其使用流水降至室溫，加入3～5 g NaCl，劇烈振搖1 min后震蕩器上振蕩15 min。高速離心機(jī)中在10 000 r/min下離心5 min。取上層乙腈液2 mL經(jīng)0.22 um濾膜過濾后上機(jī)。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 液相條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C181.7 μm，2.1 mm×50 mm，流動相:A甲醇，B水溶液(乙酸銨5 mmol/L，甲酸0.05%)。流速:0.25mL/min，進(jìn)樣量:1 μL，柱溫:40 ℃，流動相梯度如表1所示。流動相梯度如下：0～1 min 10%A；2～3 min 30%A；5 min 45%A；7 min 50%A；7.5 min 60%A；8.5 min 75%A；9 min 80%A；10.5 min 90%A；11～13 min 10%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

取甲醛-2,4-二硝基苯腙工作液，稀釋至1 mg/mL，過膜后置于質(zhì)譜蠕動泵進(jìn)樣器上，設(shè)置蠕動泵以10 μL/min的速度進(jìn)樣，在正負(fù)2種模式下掃描，最后得到其最佳質(zhì)譜條件。

電離模式:ESI-；毛細(xì)管電壓:3 kV；干燥氣溫度:450 ℃；干燥氣速:900 L/h；錐孔氣流速:150 L/h；霧化壓力:0.7 MPa；碰撞氣流速:0.15 mL/min。

甲醛-2,4-二硝基苯腙檢測條件：

母離子208.94(M-)，定量離子162.9，錐孔電壓26V、碎裂電壓8 V；定性離子46.0，錐孔電壓26 V、碎裂電壓12 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醛-2,4-二硝基苯腙和白菜樣品質(zhì)譜圖

甲醛-2,4-二硝基苯腙多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖如圖1所示，白菜樣品的掃描圖如圖2所示。

圖1 甲醛-2,4-二硝基苯腙多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖Fig.1 MRM chromatogram of formaldehyde- 2,4-dinitrobenzhydrazone

圖2 白菜樣品多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖Fig.2 MRM chromatogram of Chinese cabbage

2.2 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

分別取甲醛工作液0.1、0.3、0.6、0.9、1.8 mL至25 mL塑料離心管中，補(bǔ)加緩沖液至10 mL，再加入10 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，混勻后同1.3處理。

甲醛添加量為1～18 μg時，以峰面積為橫軸，以甲醛添加量為縱坐標(biāo)作圖，線性回歸方程y=0.000 19x+2.451 26，相關(guān)系數(shù)為0.994。

當(dāng)甲醛添加量為1 μg時，經(jīng)衍生化后上機(jī)，在出峰時間旁選擇一段0.1 min的相對平穩(wěn)的基線為噪音，計(jì)算此時信噪比為，以信噪比為3時的甲醛添加量為方法檢出限，信噪比為10時的甲醛添加量為方法定量限，則該方法的檢出限為3.06 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

2.3 質(zhì)控回收與白菜中添加回收率與精密度

2.3.1 兩種濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)控回收

分別添加2種甲醛質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，即甲醛質(zhì)控添加量分別為6.71、8.09 μg，按照1.3分別進(jìn)行各6次平行測定，使用6 μg甲醛工作液進(jìn)行定量，結(jié)果如表1所示。

表1 兩種濃度的甲醛加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations of two spiked formaldehyde (n=6)

2.3.2 白菜中添加回收率與精密度

準(zhǔn)確稱取空白樣品2 g(精確至0.001g)至25 mL塑料離心管中，分3組6次平行分別加入甲醛工作溶液0.1、0.2、1 mL，補(bǔ)加緩沖液至10 mL，再加入10 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，混勻后同1.3處理。參照農(nóng)殘的定量的方法，以白菜基質(zhì)標(biāo)樣(將吹至近干的空白基質(zhì)中加入某濃度的標(biāo)準(zhǔn)品定容，則為該濃度的基質(zhì)標(biāo)樣)為標(biāo)準(zhǔn)測定回收率。

3種濃度的添加回收率結(jié)果見表2，由表2結(jié)果可知，當(dāng)甲醛添加量為0.5～5 mg/kg時，3種濃度6次平行添加回收率在102%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3%～8%，回收穩(wěn)定，精密度良好，符合GB 27404—2008 “檢測方法確認(rèn)的技術(shù)要求”中的規(guī)定[18]。

表2 白菜中3種濃度的甲醛加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations of three spiked formaldehyde in chinese Cabbage(n=6)

3 結(jié)論

本文使用2,4-二硝基苯肼衍生法對白菜中甲醛進(jìn)行衍生化反應(yīng)，再使用乙腈提取衍生物后經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對其濃度進(jìn)行檢測。該方法甲醛的檢出限為3.06 μg/kg，當(dāng)甲醛含量為1～18 mg/kg，方法線性良好(r2=0.994)。白菜中3種濃度(0.5、1、5 mg/kg)甲醛添加進(jìn)行6次平行回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種濃度添加回收率為102%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3%～8%，回收穩(wěn)定，精密度良好，符合方法要求。

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DeterminationofformaldehydeinChinesecabbagebyhighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry

GU Ya-ping1,QIAO Fang2*,FANG Chang-fa2,HU Xiang-na1,WANG Rui1,LIN Hui-chun1,ZHANG Shi-rui1,YU Shao-zhou1,ZHANG Xiao-qiang1

1(Shenzhen Centre of Inspection and Testing for Agricultural Products,Shenzhen 518040,China) 2(School of Applied Chemistry and Biological Technology,Shenzhen Polytechnic,Shenzhen 518055,China)

In this paper,formaldehyde-2,4-dinitrophenylhydrazone in Chinese cabbage was produced by formaldehyde through 2,4-dinitrophenylhydrazine derivatives methods.Liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis results showed that the detection limit of formaldehyde in this method was 3.06 μg/kg.When the spiking amount in Chinese cabbage was 1-18mg/Kg,the formaldehyde amount was linearly correlated to peak area (r2=0.994).When the amount of formaldehyde was 0.5,1,5 mg/kg,recoveries were between 102% to 105%,and the relative standard deviations were between 3% and 8% with good stability and precision.

high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MSMS); Chinese cabbage; formaldehyde; 2,4-dinitrophenylhydrazine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014659

碩士，工程師(喬方為通訊作者，E-mail：szqiaofang@126.com)。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CARS-33-20)

2017-05-02，改回日期：2017-06-05