張建偉 龐幗敏 麥國(guó)榮 黃 健 鄭文紅 霍燕嫻

(廣東省佛山市中醫(yī)院制劑中心,佛山,528216)

黃芪白術(shù)配伍前后黃芪化學(xué)成分分析研究

張建偉 龐幗敏 麥國(guó)榮 黃 健 鄭文紅 霍燕嫻

(廣東省佛山市中醫(yī)院制劑中心,佛山,528216)

目的:基于HPLC分析黃芪白術(shù)配伍前后黃芪化學(xué)成分分析研究,闡釋中藥合理配伍的科學(xué)內(nèi)涵。方法:采用高效液相(HPLC)指紋圖譜分析進(jìn)行線性關(guān)系分析以及加樣回收率試驗(yàn)考察HPLC的嚴(yán)謹(jǐn)性。HPLC指紋圖譜:取黃芪甲苷對(duì)照品溶液、缺黃芪陰性對(duì)照溶液、黃芪供試品溶液和黃芪白術(shù)配伍供試品溶液進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析,同時(shí)取3個(gè)產(chǎn)地黃芪白術(shù)分析黃芪化學(xué)成分含量。結(jié)果:1)在線性關(guān)系考察在1.024～10.24 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2)加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果中平均回收率為99.60%,RSD為2.0%,顯示加樣回收率試驗(yàn)良好,HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性高。3)HPLC指紋圖譜分析顯示,對(duì)照品溶液、黃芪供試品溶液、黃芪白術(shù)供試品溶液和缺黃芪陰性對(duì)照溶液中,缺黃芪陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾,而黃芪甲苷與其他成分的基線分離良好。4)3個(gè)產(chǎn)地均顯示黃芪白術(shù)配伍后黃芪的化學(xué)成分黃芪甲苷的含量有所增加,其中以內(nèi)蒙古產(chǎn)地的黃芪白術(shù)配伍中黃芪甲苷的含量最高。結(jié)論:黃芪白術(shù)配伍前后黃芪的主要化學(xué)成分為黃芪甲苷,其中以內(nèi)蒙古提供的藥材含量最高。

HPLC;黃芪;白術(shù);配伍;化學(xué)成分

復(fù)方配伍是根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論的一種中醫(yī)藥用藥特色,而藥對(duì)配伍是臨床上常用的相對(duì)固定的兩味藥或三味藥的配伍形式。藥對(duì)配伍組成多具有一定規(guī)律,研究藥對(duì)配伍有助于揭示中醫(yī)學(xué)流傳下來(lái)的方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵,幫助臨床醫(yī)生和藥師從具有引導(dǎo)價(jià)值和點(diǎn)面結(jié)合的科學(xué)的角度意義[1-4]。黃芪為豆科植物蒙古黃芪的干燥根,具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效,其主要有效成分為皂苷、甲苷和黃酮類化合物[5-6]。白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖,具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎功效。白術(shù)藥用部分為是菊科蒼術(shù)屬植物的根莖入藥,其根莖中主要含揮發(fā)油、倍半萜內(nèi)酯化合物等[7-8]。臨床常用黃芪白術(shù)配伍,經(jīng)典的方劑有白術(shù)黃芪湯、防己黃芪湯和玉屏風(fēng)散等復(fù)方,均有黃芪白術(shù)配伍共奏補(bǔ)氣健脾、固表止汗、利水消腫的藥理作用,合用則可達(dá)到有汗能止,無(wú)汗能發(fā)的功效,臨床常用于治療自汗、盜汗、婦女術(shù)后大汗等癥狀[9-10]。現(xiàn)代藥理研究表明,黃芪白術(shù)配伍對(duì)類固醇性骨質(zhì)疏松具有防治作用具有顯著臨床療效[11],同時(shí)能夠促進(jìn)再生障礙性貧血骨髓紅系造血祖細(xì)胞的增殖作用[12]。本實(shí)驗(yàn)以黃芪白術(shù)配伍比例(黃芪∶白術(shù)=5∶3)配伍,采用HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪甲苷含有量,探討其變化規(guī)律,并考察黃芪白術(shù)配伍對(duì)黃芪甲苷的影響,為該方在臨床上的合理應(yīng)用及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent高效液相色譜儀(型號(hào):1100型,廠家:AGILENT安捷倫科技有限公司)。

1.2 試劑 由Fisher scientific公司提供的甲醇(批號(hào)LOT:111280)和乙腈(批號(hào)LOT:096328);中國(guó)食品藥品檢定研究院提供的超純水、黃芪甲苷對(duì)照品(21136-1364110)。

1.3 分析樣品 黃芪藥用部位為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根,白術(shù)藥用部分為是菊科蒼術(shù)屬植物的根莖入藥。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 精密量取10 μL的樣品進(jìn)樣量或?qū)φ掌啡芤?采用250 mm×4.6 mm,4 μm的色譜柱(Synergi Hydro-RP C18柱),在乙腈和0.1%磷酸的流動(dòng)相中,流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃,根據(jù)高效液相(HPLC)指紋圖譜的梯度洗脫程序進(jìn)行試驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 HPLC指紋圖譜梯度洗脫程序(檢測(cè)波長(zhǎng)未320 nm)

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品2.5 mg,置于5 mL量瓶中,甲醇溶解,制成0.5 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 1)黃芪白術(shù)采用5∶3配伍,采用回流法煎煮,于敞口藥盆中稱取5 g黃芪和3 g白術(shù)加200 mL水,浸泡30 min,煮沸后文火45 min,取100 mL藥液,在60攝氏度下減壓濃縮,定容至50 mL,折合柴胡黃芩藥物水煎液濃度未0.2 g/mL。取5 mL柴胡黃芩濃縮液用100%甲醇定容10 mL,混合均勻,取2 mL離心取上清液在0.45 μm超微膜濾過(guò)即可制備黃芪白術(shù)配伍供試品溶液。2)單純精密稱取5 g黃芪,方法同1)制備單純黃芪供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 根據(jù)2.3制備的2種供試品溶液分別取同一供試品溶液，采用薄層層析的方法對(duì)黃芪、白術(shù)進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示如圖1,黃芪、白術(shù)各自的專屬性均良好。

2.5 線性范圍試驗(yàn) 根據(jù)2.3制備的對(duì)照品溶液,精密取0、2、6、8、16、20 μL,分別編號(hào)1-6并連續(xù)進(jìn)樣,以峰面積為Y軸,5 μL進(jìn)樣濃度為X軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)咯對(duì)照品的回歸方程計(jì)算各有效成分在各自濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系；在線性關(guān)系考察中以黃芪甲苷進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(lgX)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(lnY)進(jìn)行回歸,得回歸方程lnY=1.5082l gX+13.918(r=0.999 7)，因此在1.024～10.24 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)注偏差RSD是0.84%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、16、24、48 h后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示48 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定，RSD是0.95%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測(cè)5次，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.86%,重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 取6份同一供試品溶液,每份約2.5 g黃芪,根據(jù)2.3制備的供試品溶液,編號(hào)A-F并分別加入2 mL對(duì)照品溶液,計(jì)算供試品在HPLC中的加樣回收率。由表2得,加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果中平均回收率為99.60%,RSD為2.0%,顯示加樣回收率試驗(yàn)良好,HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性高。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.1 黃芪白術(shù)配伍前后指紋圖譜 有圖1～4可得,在對(duì)照品溶液、黃芪供試品溶液、黃芪白術(shù)供試品溶液和缺黃芪陰性對(duì)照溶液中,缺黃芪陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾,而黃芪甲苷與其他成分的基線分離良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

圖1 黃芪陰性對(duì)照溶液指紋圖譜

圖2 黃芪甲苷對(duì)照品溶液指紋圖譜

圖3 黃芪供試品溶液指紋圖譜

圖4 黃芪白術(shù)供試品溶液指紋圖譜

表2 黃芪含量測(cè)定結(jié)果

2.10.2 黃芪白術(shù)配伍前后黃芪化學(xué)成分分析 3個(gè)產(chǎn)地均顯示黃芪白術(shù)配伍后黃芪的化學(xué)成分黃芪甲苷的含量有所增加,其中以內(nèi)蒙古產(chǎn)地的黃芪白術(shù)配伍中黃芪甲苷的含量最高。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 本研究前期工作中通過(guò)對(duì)甲醇-水、四氫呋喃-水、乙腈-水的HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性進(jìn)行考察,篩選出了乙腈-水系統(tǒng)流動(dòng)相的分離效果較好,但在以乙腈-水不同的比例條件下等度洗脫的摸索中,發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷仍未能與基線分離,由于黃芪皂苷相對(duì)黃芪甲苷的分離更容易一些,因此本研究選取黃芪甲苷作為化學(xué)成分分析指標(biāo),根據(jù)查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)采用梯度洗脫后,發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷Ⅱ,黃芪甲苷均可以與基線分離,再篩選梯度洗脫條件,結(jié)果以乙腈-水梯度洗脫,在75 min內(nèi)將2種皂苷完全分離,但是將洗脫時(shí)間控制在59 min內(nèi),同時(shí)在水相中加入了少量甲酸后,黃芪甲苷峰形相對(duì)較好,基線噪聲較低;為了進(jìn)一步降低基線噪聲,獲得最好的黃芪甲苷峰形,本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)甲酸的濃度進(jìn)行了考察,分別用0.1%、0.2%、0.3%的甲酸水溶液進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相的分離效果最好,能夠分離出最低基線噪聲且峰形最好的黃芪甲苷。

3.2 HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性考察意義 線性考查在某一個(gè)濃度或峰高(面積)情況下進(jìn)行樣品分析是否是準(zhǔn)確的,而準(zhǔn)確的概念就是要成線性,換句話說(shuō),在這個(gè)范圍內(nèi),待測(cè)樣品面積要與濃度成正比,即符合紫外檢測(cè)器的朗伯比爾定律因?yàn)橹挥羞@樣,在這個(gè)范圍內(nèi)濃度與面積成正比,分析結(jié)果才是準(zhǔn)確的[13]。而加樣回收率包括絕對(duì)回收率和相對(duì)回收率,本研究涉及的是相對(duì)回收率。相對(duì)回收率嚴(yán)格來(lái)說(shuō)有2種,一種是回收試驗(yàn)法,一種是加樣回收試驗(yàn)法。而本研究的目的主要是為了考察HPLC的嚴(yán)謹(jǐn)性,因此選用加樣回收試驗(yàn)法,也就是是在已知濃度樣品中加入藥物,來(lái)和標(biāo)準(zhǔn)曲線比,標(biāo)準(zhǔn)曲線也是在基質(zhì)中加藥物。

3.3 黃芪白術(shù)配伍研究意義 常見(jiàn)的測(cè)定黃芪甲苷含有量的方法有薄層掃描法(TLCS)、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD);由于黃芪甲苷成分呈紫外末端吸收,HPLCUV法檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相溶劑干擾嚴(yán)重,基線較不穩(wěn)定;ELSD是一種通用型檢測(cè)器,尤其適用于沒(méi)有紫外吸收或末端吸收的成分,測(cè)定時(shí)不受流動(dòng)相溶劑干擾,基線平穩(wěn),方法準(zhǔn)確靈敏、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便[14-16]。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪白術(shù)配伍前后黃芪中黃芪甲苷含有量,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,適合黃芪及其制劑中黃芪甲苷含有量的測(cè)定。黃芪甲苷成分在含水正丁醇中溶解度較大,故本實(shí)驗(yàn)參照《中華人民共和國(guó)藥典》,應(yīng)用該溶劑從水煎液中萃取黃芪甲苷類成分,效果較好。另外,還將《中華人民共和國(guó)藥典》中大孔吸附樹(shù)脂分離純化黃芪皂苷改為氧化鋁,可減少前者反復(fù)洗滌純化的不便,也取得了理想的效果,并為其他相關(guān)研究提供借鑒。本研究結(jié)果顯示,黃芪白術(shù)配伍前后黃芪甲苷與其他成分的基線分離良好,且內(nèi)蒙古產(chǎn)地的黃芪白術(shù)配伍中黃芪甲苷的含量最高。

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StudyonChemicalConstituentsofRadixAstragaliseuHedysariBeforeandAfterCompatibilityofRadixAstragaliseuHedysariandRhizomaAtractylodisMacrocephalae

Zhang Jianwei, Pang Guomin, Mai Guorong, Huang Jian, Zheng Wenhong, Huo Yanxian

(CenterforPreparations,FoshanHospitalofTCM,Foshan528216,China)

Objective:To analyze and study the chemical constituents of Radix Astragali seu Hedysari before and after compatibility of Radix Astragali seu Hedysari and Rhizoma Atractylodis Macrocephalae based on HPLC, and to explain the scientific connotation of the rational compatibility of Chinese herbal medicine.MethodsThe linear relationship analysis was conducted by HPLC and the sample recovery test was used to investigate the preciseness of HPLC. HPLC fingerprint:astragaloside reference solution, negative reference solution lack of Radix Astragali seu Hedysari, Radix Astragali seu Hedysari test solution and the compatibility of Radix Astragali seu Hedysari and Rhizoma Atractylodis Macrocephalae test solution for HPLC fingerprint analysis, and chemical constituents of Radix Astragali seu Hedysari and Rhizoma Atractylodis Macrocephalae from 3 areas were analyzed.Results1) The linear relationship was good in the range of 1.024 ～ 10.24 μg, and with 2.2 sample recovery test results. 2) The average recovery rate was 99.60%, andRSDwas 2%, which showed that the sample recovery rate was good, and the preciseness of HPLC was high. 3) HPLC fingerprint analysis showed that in reference solution, negative reference solution lack of Radix Astragali seu Hedysari, Radix Astragali seu Hedysari test solution and the compatibility of Radix Astragali seu Hedysari and Rhizoma Atractylodis Macrocephalae test solution, no interference in negative reference solution lack of Radix Astragali seu Hedysari and the baseline separation of astragaloside and other components were good. 4) Analysis in 3 ares showed that the content of astragaloside increased with the compatibility of Radix Astragali seu Hedysari and Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, among which that content was the highest from Inner Mongolia.ConclusionThe main chemical constituents of Radix Astragali seu Hedysari after the compatibility of Radix Astragali seu Hedysari and Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, among which the content in Inner Mongolia is the highest.

HPLC, Radix Astragali seu Hedysari, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Compatibility, Chemical constituents

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.073

佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014AB00330)——玉龍散中烏頭堿的經(jīng)皮給藥安全性及藥代動(dòng)力學(xué)研究

張建偉(1960.04—),男,大專,主管中藥師,研究方向:中藥鑒定保管,E-mail:1328597812@qq.com

龐幗敏(1972.03—),女,本科,副主任中藥師,研究方向:中藥鑒定驗(yàn)收,E-mail:Pgm13827771251@163.com

(2017-07-06收稿 責(zé)任編輯：王明)