賀東生，俞 麗，蘇丹萍，梁偉放，李錦輝

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

豬群感染圓環(huán)病毒3型病例的診斷和病毒鑒定

賀東生，俞 麗，蘇丹萍，梁偉放，李錦輝

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

2017年8月，華南某豬場保育豬出現(xiàn)慢性消瘦和呼吸道綜合征的病豬。經(jīng)實驗室PCR診斷，排除豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）后顯示為豬圓環(huán)病毒3型（PCV3） 陽性。采用特異性CAP 段基因引物擴增該片段，使用DNAMAN7．0 和MEGA6．06 軟件進行同源性分析。結(jié)果，成功克隆了該病毒的CAP段基因，序列長度為 671 bp，并進行基因測序和遺傳進化分析。序列同源性分析表明該毒株為PCV3，命名為PCV3/CN/Guangzhou/2017。

豬；PCR鑒定；PCV3；CAP段基因；序列分析

PCV是目前報道的動物病毒中最小的無囊膜DNA病毒。成熟的病毒粒子由60個核衣殼蛋白質(zhì)（capsid protein，Cap）亞基組裝成為一個直徑為17～20 nm 的正二十面體的球形顆粒，病毒的基因組包裹于其中，由1 767～1 768 堿基組成的單鏈環(huán)形DNA［1-2］，編碼兩個主要的開放閱讀框（open reading frames，ORFs）：CAP 和 REP（ 病 毒 復制相關的酶）［3］。CAP是 PCV 唯一的結(jié)構蛋白質(zhì)和主要抗原，由 232～234個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為27 ku［4-5］。2016年 10月，美國 Kansas 州立大學的 R.Palinski 等和加州大學San Francisco 分校 T.G.Phan等幾乎在同一時間報道一個新的PCV 基因型，又稱為 PCV3［6-7］。該病毒從出現(xiàn)病癥的母豬或仔豬中分離得到，同時PCV2檢測為陰性?；蚪M序列分析發(fā)現(xiàn)，PCV3基因組包含2 000堿基，具有與 PCV1和PVC2相似的基因組結(jié)構，主要編碼CAP和REP兩個基因。在CAP 和REP 基因5′端包含有一個由 9個堿基(TAGTATTAC) 組成的stem loop結(jié)構，其堿基組成與 PCV1 的stem loop序列完全一致。PCV3 CAP基因編碼 214個氨基酸殘基，較PCV2 CAP少19～20個，此外，與 PCV2和鴨圓環(huán)病毒相比，其CAP 基因相似性僅為 36%～37%。PCV3 REP 基因編碼 297氨基酸殘基，與 GenBank數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn)，該 REP蛋白質(zhì)氨基酸與先前在美國報道的一株 PCV 毒株（GenBank accession 登錄號：ADU77001）展現(xiàn)出較高的相似性（69.4%）；與從我國分離到的蝙蝠圓環(huán)病毒的 REP 相似性為54%。此外，PCV3在其他國家和地區(qū)尚未見報道[8]。

1 材料與方法

1.1 病料

本研究檢測的26份豬病料（心、脾、肺、肝和淋巴結(jié)）于2017年采自華南地區(qū)多個規(guī)模豬場的發(fā)病豬，病豬臨床表現(xiàn)為慢性消瘦、多器官衰竭、食欲減退、精神不振，疑似為PCV2感染。將病料按1：3加入PBS緩沖液進行稀釋研磨，6 000 g，4 ℃離心5 min，取上清，于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCV3及PCV2引物序列

圖1 PCV3 CAP基因PCR擴增結(jié)果

1.2 主要試劑

DNA Marker、dNTP、Taq酶等購自寶生物工程（大連）有限公司，pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細胞、DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自Omega公司，DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自TaKaRa公司，溴化乙錠、氨芐青霉素、IPTG 為 Sigma公司產(chǎn)品；其余的化學試劑均是進口或者國產(chǎn)分析純。引物合成、DNA測序由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

1.3 引物設計與合成

本實驗室根據(jù)GenBank 所發(fā)布的序列號，選擇全基因序列，運用Primer Premier5.0針對cap設計1對PCV3引物。其中，PCV2引物為本實驗室他人所設計。由睿博興科生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

1.4 病毒核酸的提取

將病料離心后取出上清，按DNA試劑盒說明書提取病毒核酸，然后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒的PCR 檢測

以病毒DNA為模板進行PCR 擴增，反應體系為：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP2.0μL， 上 下 游 引 物 各1.0μL，DNA 模 板 2μL，rTaq DNA 聚 合 酶 0.5μL，Rnase Free DH2O 16μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性4 min ；94 ℃變性 30 s；55.4 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 30 s；30個循環(huán) ；72 ℃延伸 10 min ；4 ℃保存。取5μL PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，CLINX凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.7 克隆測序

將陽性PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與PMD-18T 載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后挑單個菌落進行PCR 鑒定，鑒定成功的重組質(zhì)粒送往睿博興科生物技術有限公司進行測序。

1.8 序列分析

將PCR 擴增獲得的基因片段進行克隆、測序，利用DNAMAN7.0和MEGA6.06軟件處理，與GenBank上已公布的PCV3毒株的基因序列進行同源性比對分析，并繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料PCR 檢測結(jié)果

以提取的DNA為模板，用PCV2和PCV3引物分別對樣品進行檢測。結(jié)果如圖1所示，PCV2檢測結(jié)果為陰性，PCV3 在671 bp左右有明顯條帶，檢測結(jié)果為陽性。

由此說明該病毒為PCV3而非PCV2。將PCV3 CAP基因PCR產(chǎn)物純化后構建至pMD-19T質(zhì)粒并進行測序。

2.2 PCV3 CAP基因同源性分析

將測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST，結(jié)果顯示其與GeneBank中已發(fā)表序列同源性高達99.1%，由此進一步確定其為PCV3，將其命名為PCV3/CN/Guangzhou/2017。以GeneBank中已發(fā)表的13株PCV3毒株為參考（表2），進行PCV3 CAP基因同源性分析（圖3）。結(jié)果顯示， PCV3/CN/Guangzhou/2017 CAP基因核苷酸序列同源性為97.4%～99.1%：其中與中國已公布毒株相比核苷酸同源性為97.4%～98.9%；與意大利毒株相比核苷酸同源性為98.9%～99.1%；與美國毒株核苷酸同源性為97.7%～98.8%.該毒株與意大利毒株同源性最高，為99.1%，與中國安徽毒株同源性較低，為97.4%。

表2 Genebank已登錄的pcv3參考毒株

圖3 基于PCV3/CN/Guangzhou/2017 CAP基因的序列同源性分析

圖4 基于PCV3/CN/Guangzhou/2017 CAP基因的遺傳進化樹

2.3 基于PCV3 CAP基因的遺傳進化分析

以表2中13株毒株為參考，運用MEGA6.06軟件采用Neighbor-Joining聚類分析方法構建基于CAP基因序列的進化樹。如圖4所示，PCV3/CN/Guangzhou/2017 CAP與意大利毒株親緣關系較近，而與美國毒株較遠。本次鑒定毒株與國內(nèi)其他毒株雖然親緣關系較近，但單獨形成一個分支，說明該病毒是PCV3新成員。

3 討論

本次鑒定出的PCV3/CN/Guangzhou/2017與其他毒株不在一個分支，表明在進化過程中極不保守，這種變異對疾病的防治和疫苗的研究增加了難度。該病毒PK-15細胞上進行增殖，但病變并不明顯，需要借助間接免疫熒光等試驗才能證明該病變在細胞中的增殖。因該病是豬場新病，對其認知比較有限，且發(fā)病率較高、傳播快、豬場損失大，對豬場短期及長期的影響難以預估，需要進一步研究其傳入源頭、防控方法，做好防控方案。

致謝：本實驗是在華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院、人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室、農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室和廣東省獸用生物制品技術研究與應用企業(yè)重點實驗室完成。感謝廣東省生豬產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團隊基金的資助。

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2017-10-10）