彭 濤 ，汪曉飛 ，古金元 ，胡東方，陳同煜 ，王玉超 ，劉思當(dāng)*

（1．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000；2．山東省畜牧業(yè)貿(mào)易服務(wù)中心，山東 濟(jì)南 250300）

豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和沙門氏菌混合感染病例的診斷

彭 濤1，汪曉飛2，古金元1，胡東方1，陳同煜1，王玉超1，劉思當(dāng)1*

（1．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000；2．山東省畜牧業(yè)貿(mào)易服務(wù)中心，山東 濟(jì)南 250300）

近年來(lái)，隨著豬場(chǎng)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，加上豬群頻繁的調(diào)入轉(zhuǎn)出，豬群發(fā)病的動(dòng)態(tài)也越來(lái)越復(fù)雜。豬群發(fā)病是由多種致病因素作用的結(jié)果，往往由兩種或兩種以上的病原混合感染所造成。常常是多種病毒和細(xì)菌混合感染或者是繼發(fā)感染，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率急劇升高，危害加大，使疾病的預(yù)防和控制難度增大，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文對(duì)某發(fā)病豬場(chǎng)病死仔豬進(jìn)行了剖檢診斷、病理組織學(xué)觀察及實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)，確診其為豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和沙門氏菌混合感染。

豬偽狂犬病毒；豬圓環(huán)病毒2型；沙門氏菌；混合感染

豬偽狂犬病毒（PRV）和豬圓環(huán)病毒（PCV）均是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成危害最為嚴(yán)重的病毒之一，豬偽狂犬病毒主要引起公豬不育；妊娠母豬流產(chǎn)、死胎；新生仔豬大量死亡；育肥豬呼吸困難、生長(zhǎng)停滯等，并且嚴(yán)重侵害腦部神經(jīng)，造成豬群共濟(jì)失調(diào)，四肢抽搐等神經(jīng)癥狀。豬圓環(huán)病毒國(guó)內(nèi)有兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2，現(xiàn)如今國(guó)外有報(bào)道稱已發(fā)現(xiàn)PCV3，但在國(guó)內(nèi)還尚未發(fā)現(xiàn)。其中PCV1為非致病性病毒，PCV2為豬群主要致病性病毒，導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）和皮炎與腎病綜合征（PNDS）等多種病癥。豬圓環(huán)病毒2型主要引起豬只皮膚蒼白、被毛蓬亂；呼吸困難；體表淺淋巴結(jié)腫大，特別是腹股溝淺淋巴結(jié)腫大；豬群漸進(jìn)性消瘦或生長(zhǎng)遲緩；體表皮膚發(fā)生充血出血斑。豬沙門氏菌臨床常見(jiàn)慢性型感染，沙門氏菌感染病豬主要表現(xiàn)為體溫升高，精神沉郁；咳嗽；寒顫；眼結(jié)膜有黏性和膿性分泌物；先便秘后腹瀉，糞便惡臭，呈淡黃色或灰綠色，混有血液、纖維碎片或者壞死組織。

1 發(fā)病背景

2017年3月，山東省泰安地區(qū)某豬場(chǎng)300多頭保育仔豬中，50%的仔豬發(fā)病，其中發(fā)病致死率為70%左右。仔豬為外地購(gòu)買，畜主未知其之前免疫程序，購(gòu)買后豬場(chǎng)僅免疫豬瘟疫苗。

2 臨床癥狀和剖檢變化

2.1 臨床癥狀

病豬主要表現(xiàn)為體溫升高，精神沉郁；被毛粗亂，消瘦，脊柱突出；怕冷，卷曲成團(tuán)；皮膚見(jiàn)痂狀濕疹；眼角有膿性分泌物，肛門粘有黃色稀糞。

2.2 剖檢病變

病豬心包積液；肺臟暗紅色硬實(shí)；胃底及幽門部位出血、潰瘍；肝臟表面有黃白色針尖大壞死灶；脾臟暗紅色腫脹，堅(jiān)硬如橡皮，表面有纖維素性滲出物；盲腸彌漫性出血（見(jiàn)圖1）。

圖1 病豬剖檢病理變化

3 組織病理學(xué)觀察

剖檢時(shí)取肝、肺、脾、腸等器官病料10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟切片、HE染色法，光鏡下觀察組織病理變化（見(jiàn)圖2）。

圖2 組織病理切片

肝臟見(jiàn)許多壞死灶，為典型副傷寒結(jié)節(jié)病變，結(jié)節(jié)內(nèi)肝細(xì)胞變性、壞死，許多巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增生；肺泡壁增厚，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增生，毛細(xì)血管充血、出血，肺泡腔內(nèi)充滿炎性滲出物；脾臟彌漫性出血，白髓消失；腸絨毛上皮細(xì)胞壞死脫落，黏膜下層充血、出血。

4 病原學(xué)檢查

4.1 DNA/RNA提取

將凍存的淋巴結(jié)、脾、肺、腎、腸道等組織，各取豆粒大置于滅菌的勻漿器中，加入1 mL冰浴的滅菌PBS，研磨至組織液黏稠無(wú)明顯顆粒時(shí)，將勻漿物轉(zhuǎn)移至滅菌1.5 mL離心管中。而后置于-20℃冰箱中進(jìn)行反復(fù)冷凍3次后，將勻漿液9 000 r/min離心3 min后將上清吸入新的滅菌離心管內(nèi)備用。

病料中病毒DNA或RNA的提取采用北京全式金 Easy Pure Viral DNA/RNA Extraction kit，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

4.2 RT-PCR檢測(cè)

用提取的DNA/RNA，分別對(duì)豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒進(jìn)行RT-PCR/PCR擴(kuò)增檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該病料中含有豬偽狂犬病毒和2型豬圓環(huán)病毒，其他病毒未檢出（見(jiàn)圖3）。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖

5 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定

5.1 病料觸片染色鏡檢

無(wú)菌取病豬病變明顯的淋巴結(jié)、肺臟、脾臟，用載玻片制成組織觸片，進(jìn)行革蘭氏染色，然后顯微鏡下觀察。鏡檢（見(jiàn)圖4）見(jiàn)大量革蘭氏陰性、兩端鈍圓、中等大小的桿菌。

圖4 粉紅色兩端鈍圓中等大小的直桿菌

5.2 細(xì)菌分離和培養(yǎng)

用接種環(huán)無(wú)菌取病變明顯的淋巴結(jié)、肺臟、脾臟，分別劃線接種于SS 瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 16～24 h，觀察結(jié)果(見(jiàn)圖 5）。

圖5 SS瓊脂鑒別培養(yǎng)基

得到的菌落在 SS 瓊脂平板上呈黑色菌落，因?yàn)樯抽T氏菌能產(chǎn)生H2S，與SS培養(yǎng)基成分中檸檬酸鐵反應(yīng)生成黑色物質(zhì)。挑取SS培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落進(jìn)行染色鏡檢，鏡檢結(jié)果與病料組織觸片觀察相一致。

5.3 PCR/PT-PCR鑒定

根據(jù)GenBank公布的序列設(shè)計(jì)豬副傷寒沙門氏菌的特異性引物（見(jiàn)表1），用PCR/PT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳成像（見(jiàn)圖6）。

表1 引物序列

圖6 瓊脂糖凝膠電泳圖

5.4 生化鑒定

從培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，置37 ℃、250 r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)12 h后，分別接種于葡萄糖、甘露醇、核糖、尿素、ONPC、枸櫞酸鹽、氧化酶，37 ℃培養(yǎng)48～72 h；同時(shí)接種VP管、MR和吲哚生化管，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，然后按VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)方法分別加入相應(yīng)試劑，觀察試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）。

表2 生化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)分離菌形態(tài)，培養(yǎng)特性、菌液PCR/PT-PCR診斷和生化鑒定結(jié)果，判定該分離菌為豬副傷寒沙門氏菌。

5.6 藥物敏感試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)按常規(guī)方法取0.5 mL的菌液涂布于伊紅美蘭平板，然后分別將慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、恩諾沙星和頭孢噻呋藥敏片置于該平板上，貼放后用鑷子輕壓。37 ℃培養(yǎng)16～24 h，觀察結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)恩諾沙星、頭孢噻呋高度敏感，對(duì)鏈霉素低度敏感。

6 結(jié)論

據(jù)臨床癥狀、剖檢病變、病理組織學(xué)觀察及實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)，該病例被確診為豬偽狂犬病毒、2型豬圓環(huán)病毒和沙門氏菌混合感染。

7 綜合防治措施

7.1 病豬隔離

發(fā)現(xiàn)病豬后立即進(jìn)行隔離，避免交互感染，對(duì)發(fā)病嚴(yán)重并且沒(méi)有治療價(jià)值的豬只進(jìn)行淘汰撲殺，尸體無(wú)害化處理。

7.2 豬場(chǎng)衛(wèi)生消毒

對(duì)發(fā)病豬舍進(jìn)行徹底地消毒處理，特別是豬舍內(nèi)殘留的飼料、飲水及時(shí)清理，對(duì)料槽和飲水器等器具加強(qiáng)消毒，豬舍內(nèi)空氣進(jìn)行噴灑消毒。

7.3 細(xì)菌性疾病防治

豬副傷寒沙門氏菌主要發(fā)生于密集飼養(yǎng)的豬群，感染原因一方面是由于病豬及帶菌豬污染了飼料、飲水及土壤等，健康豬接觸后感染。另一方面是健康豬體內(nèi)本身存在沙門氏菌，但由于抵抗力強(qiáng)，未表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，由于飼養(yǎng)管理不當(dāng)、氣候突變、有其他傳染病尤其是免疫抑制性病毒病等誘因，導(dǎo)致豬只體質(zhì)減弱，抵抗力下降，病原菌隨即大量繁殖，毒力增強(qiáng)而致病?？捎冒欢髦Z沙星拌料飼喂發(fā)病豬群，病豬頭孢噻呋鈉注射進(jìn)行治療。并且要注意平時(shí)的藥物保健，采用合理藥物保健程序，即可預(yù)防多種細(xì)菌性疾病的感染。

7.4 病毒性疾病防治

病毒性疾病關(guān)鍵在于預(yù)防，大部分病毒性疾病一旦發(fā)生，無(wú)特效治療藥物。預(yù)防病毒性疾病的重要手段就是進(jìn)行疫苗免疫。首先要選取高效疫苗，其次要制定科學(xué)合理的免疫程序，并加強(qiáng)常見(jiàn)病毒病的免疫監(jiān)測(cè)。

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“豬重要疫病免疫防控新技術(shù)研究”子課題“規(guī)模化豬場(chǎng)科學(xué)合理的免疫程序的研究（2017YFD0500605）”支持。

彭濤（1995-），男，山東淄博人，碩士，主要從事動(dòng)物臨床病理學(xué)研究 .E-mail：244764302@qq.com

*通訊作者簡(jiǎn)介：劉思當(dāng)，山東省農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師.E-mail：liusidang@126.com

2017-06-01）