鄧朝陽，張森旺，王慧賓，胡居吾，熊偉

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

超濾膜提取金銀花多糖及其抗氧化活性的影響

鄧朝陽，張森旺，王慧賓，胡居吾，熊偉

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

目的：以金銀花為研究對象，利用微濾-超濾-納濾技術(shù)分離提純金銀花提取液中的多糖。方法：根據(jù)金銀花多糖與其他成分分子量差異，先采用微濾膜對金銀花浸提液進行除雜，然后采用超濾和納濾膜分離金銀花粗多糖。并考察金銀花不同分離段多糖還原能力以及對DPPH自由基的清除效果。結(jié)果：純化后的金銀花多糖主要存在于超濾的截留液中，而納濾膜的截留液中金銀花多糖抗氧化能力最強。結(jié)論：微濾超濾膜聯(lián)用可以達到純化金銀花多糖的目的。

金銀花；多糖；提?。荒し蛛x技術(shù)；抗氧化活性

多糖廣泛存在于自然界，是來自高等植物、動物細(xì)胞膜、微生物細(xì)胞壁中的天然大分子物質(zhì)，為構(gòu)成生命活動的四大基本物質(zhì)之一，并與維持生命所需的多種生理功能密切相關(guān)[1]。近幾年，大量文獻報道[2-6]多糖具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、增強免疫力、抗病毒以及抗衰老等活性，中藥金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科（Caprifoliaceae）、忍冬屬（Lonicera Linn.）植物的干燥花蕾，是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效[7]。多糖作為金銀花成分之一，據(jù)目前的了解，對其研究較少。

與傳統(tǒng)的多糖分離技術(shù)相比，膜分離技術(shù)比微濾、超濾、納濾、反滲透具有一定的優(yōu)勢，其可以在室溫下單獨操作，不需要相變，可以節(jié)省時間適合大規(guī)模生產(chǎn)。更重要的是，膜分離技術(shù)對于生物活性和熱敏性物質(zhì)更加適用。近年來，超濾和納濾技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分離多糖和多酚類物質(zhì)[8]。

先前的研究主要集中在金銀花中綠原酸等小分子化合物的研究上，而對其多糖類成分研究較少。本研究以金銀花為原料，利用微濾-超濾-納濾分離技術(shù)對金銀花提取液進行分離，收集各段成分，并對其抗氧化活性進行初步評價，進一步闡釋中藥金銀花的藥效成分，合理設(shè)計金銀花多糖膜分離提取工藝。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

金銀花，產(chǎn)地河南新鄉(xiāng)，置于60℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，恒溫烘干后，置于密封袋中密封，保存于4℃的冰箱中待用。

二苯基苦味?；诫拢―PPH）購于Sigma公司；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、氯化鐵、鐵氰化鉀、無水乙醇、Vc、BHT、硫酸亞鐵、水楊酸、氯仿、丙酮、正丁醇、過氧化氫，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、紫外-可見分光光度計（北京譜析通用公司）、Direct-Q3CHAO超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）、Q-250B3高速多功能粉碎機（上海冰都電器有限公司）、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海榮生生化儀器廠）、BONA-GM-18微濾-超濾-納濾膜分離實驗機（配有不同規(guī)格的卷式膜組件，濟南博納生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 金銀花多糖提取液的制備

取上述金銀花用粉碎機粉碎，采用水浸提法，以液料比20∶1、浸提溫度90℃、浸提時間2h為提取工藝參數(shù)，提取金銀花多糖。冷卻后離心，合并濾液，將提取液用膜分離技術(shù)進行純化精制。

1.3.2 膜分離試驗

在室溫條件下，樣品液經(jīng)輸液泵輸入膜分離組件，以錯流過濾的方式通過膜組件，經(jīng)膜分離后透過液從膜組件外側(cè)出口端流出，截留液返回進料罐中再次循環(huán)膜過濾[9]，集中收集相應(yīng)的截留液、透過液，得到相應(yīng)截留分子量的多糖溶液。實驗工藝流程如圖1所示。

圖1 實驗工藝流程圖

1.4 分析方法

1.4.1 苯酚硫酸法測定多糖含量

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品20mg，用蒸餾水定容至20mL，得到濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0、10、20、30、40、50、60μL和70μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于小試管中并以此加蒸餾水至200μL。各加5%苯酚溶液0.4mL，混合均勻，滴加2mL的濃硫酸，搖勻放在沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫后，在490nm處用酶標(biāo)儀測定其吸光值。以葡萄糖濃度C1（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為A=0.003 1C1+0.018 2，相關(guān)系數(shù)r2=0.996 8。

（2）多糖含量測定。取各分離段提取液1.0mL，加5%的苯酚溶液0.4mL，搖勻滴加濃硫酸2mL，混合均勻，在沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫后，用酶標(biāo)儀在490nm下測定吸光值。根據(jù)回歸方程計算各分離段多糖含量。

式①中：Y1為多糖含量，%；C1為代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；V為待測樣液的體積，mL；m為稱取金銀花的質(zhì)量，mg。

A、B、C和D組分多糖得率

式②中：Y2分別為A、B、C和D組分的得率，%；m1分別為A、B、C和D組分質(zhì)量(干基計)，mg。

A、B、C和D組分多糖純度

式③中：P為粗多糖或粗低聚糖純度，%。

1.4.2 DPPH自由基清除能力測定

按照Hu[10]方法，取不同濃度A、B、C和D溶液100μL加到96孔透明板中，分別加入100μL 0.2mmol/L的DPPH溶液。依照相同的操作方法，將不同濃度的樣品液分別與80%甲醇混勻作為空白組，采用酶標(biāo)儀在波長517nm處測其吸光值，重復(fù)3次實驗，每次3組平行，取平均值。

式④中，Asample為DPPH溶液與樣品液的吸光度之和；Ablank為樣品與提取溶劑的吸光度之和；Acontrol為DPPH溶液與提取溶劑的吸光度之和。

2 結(jié)果與討論

2.1 金銀花各分離段得率及其多糖含量

選用一定規(guī)格的微濾-超濾膜，在實驗用膜分離裝置上對金銀花中各組分糖進行分段，實驗過程中分別收集截留液和透過液，減壓濃縮，冷凍干燥得到A、B、C和D 4段樣品，分別稱其質(zhì)量，并測定其得率及純度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 金銀花各提取液樣品得率及純度

從圖2可以看出，金銀花多糖提取液經(jīng)過一系列膜分離后分為3部分，其中得率最高的為超濾膜截留液B部分，得率為6.85%；納濾膜截留液C和納濾膜透析液D的得率相對較低，其得率分別為1.03%和2.89%。在本次實驗中，所得到B、C和D組分多糖都不純，B中的糖純度為48.68%，與金銀花多糖提取液純度基本一致。提取液中含有大量的沉淀等雜質(zhì)，導(dǎo)致其純度降低，而B部分多糖純度較低是因為金銀花中除了分子量大的多糖外，還含有較多的蛋白質(zhì)。C樣品中，糖純度為68.32%，這部分主要是由低聚糖組成，往往含有很多分子量相近的色素或小分子化合物的聚合體在里面，所以其純度也不高。D樣品中，純度為86.37%，說明所測糖含量為其單糖含量，并不是多糖的含量，往往里面還含有一些水溶性的多酚或者黃酮等小分子化合物。

2.2 不同分離段金銀花多糖DPPH自由基清除能力變化

清除DPPH自由基是一種用途最為廣泛的抗氧化模型，由于其快捷、高效、穩(wěn)定的特點常被用來檢測各種樣品的清除自由基的能力。金銀花多糖過膜后不同分離段的清除DPPH自由基能力如圖3所示。由圖可知，所有樣品的清除能力都隨著加入樣品的濃度增加而增強，當(dāng)樣品濃度為120mg/mL時，A、B、C和D的清除率分別為86.39%、60.12%、95.32%和88.38%，說明各分離段都具有清除DPPH自由基能力。相同濃度下，其清除DPPH自由基能力的大小順序為C＞D＞A＞B，各多糖部位表現(xiàn)出清除DPPH自由基的能力不同，這可能與其含有的化學(xué)成分不同有關(guān)，除了多糖本身具有清除DPPH自由基能力，與含有的或者化學(xué)鍵鏈接的小分子化合物有關(guān)[11-12]，C段中清除自由基能力最強，說明其多糖本身可能連接小分子化合物，如黃酮多酚等抗氧化活性較強的物質(zhì)。以上數(shù)據(jù)說明表金銀花多糖清除DPPH自由基的活性段主要是C段-低聚糖分離段。

圖3 金銀花不同分離段對DPPH自由基的清除率

2.3 不同分離段金銀花多糖還原能力變化

Fe3+還原能力是酚類物質(zhì)抗氧作用的重要機制，其表現(xiàn)形式通過電子轉(zhuǎn)移，化合物還原能力主要通過氫質(zhì)子的傳遞破壞自由基鏈來發(fā)揮其抗氧化作用[13]。金銀花多糖過膜后的不同分離段的Fe3+還原能力由圖4可知，橫坐標(biāo)代表樣品的濃度，縱坐標(biāo)代表其吸光度，吸光度越大，說明樣品還原能力越強，相同濃度下的不同樣品中，其強弱關(guān)系分別為C＞D＞A＞B，與清除DPPH自由基的能力一致。隨著樣品濃度的增加，其樣品吸光度逐漸增大，還原能力逐漸增強，線性關(guān)系良好。以上數(shù)據(jù)充分說明金銀花多糖過膜后的不同分離段還原能力最強活性段為C段。

之前國內(nèi)文獻[7]報道金銀花多糖抗氧化的研究，發(fā)現(xiàn)金銀花多糖對·DPPH自由基和·OH自由均有較強的清除能力，其EC50分別為0.016mg/mL和0.21mg/mL。本實驗研究金銀花多糖清除能力效果更好，原因是其提取金銀花的方式不同，文獻采用酸性提取金銀花多糖，造成其他多糖未提取完全，提取過程中也可能導(dǎo)致多糖與抗氧化能力較強的小分子化和化學(xué)鍵的斷裂。

圖4 金銀花不同分離段Fe3+還原能力

3 結(jié)論

采用微濾-超濾-納濾膜分離技術(shù)對金銀花多糖提取液進行了提取分離，并對各分離段的得率和純度進行計算，探討了各分離段的抗氧化活性，結(jié)果表明：金銀花多糖主要集中在超濾截留液B中，但是抗氧化活性最強段為納濾截留液C?？梢?，微濾-超濾-納濾技術(shù)對于分離金銀花中的多糖成分是一種有效的分離方法，是金銀花多糖提取走向?qū)嵱没?、工業(yè)化的有效途徑。

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Extraction and Isolation of Polysaccharide from Lonicera japonica by Membrane Separation Technology and Evaluation of its Antioxidant Activity

Deng Chao-yang,Zhang Sen-wang,Wang Hui-bin,Hu Ju-wu,Xiong Wei
(Institute of Applied Chemistry,Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330096)

Objectives:To extract and purify the polysaccharide from Lonicera japonica by microfiltration (MF),ultrafiltration (UF) and nanofiltration (NF) and evaluate its anti-oxidant activity.Methods:According to the molecular weight difference of Lonicera japonica polysaccharide and other components,using microfiltration membrane to leach impurity extract of Lonicera japonica,then determine the purity of using an integrated sedimentation and ultrafiltration process to treat the penetrating fluid of ultrafiltration and evaluate the ability of DPPH free radical scavenging activity and reducing power.Results:Much of the polysaccharide were detected in the retention fluid from the membrane with ultrafiltration.The best anti-oxidant activity ability of polysaccharide was mainly concentrated in the retention fluid from the membrane with nanofiltration.Conclusions:the preferred aperture of microfiltration and ultrafiltration membrane can purified Lonicera japonica.

Lonicera japonica;Polysaccharide;Extraction and purification;Membrane separation technology;Antioxidant activity

R284.2；S567 文獻標(biāo)志碼：A

2096-0387（2017）06-0038-04

國家自然科學(xué)基金項目（31260400）；江西省科技計劃項目（20151BBF60024）；江西省科學(xué)院國家級預(yù)研項目（2014YGY09）。

鄧朝陽（1967－），女，江西南昌人，本科,副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。