任香蕓， 何志剛,*， 李維新， 林曉姿， 梁璋成

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所， 福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點實驗室， 福建 福州 350013)

直投式發(fā)酵劑制備工藝對乳酸菌存活率的影響

任香蕓1,2， 何志剛1,2,*， 李維新1,2， 林曉姿1,2， 梁璋成1,2

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所， 福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點實驗室， 福建 福州 350013)

為明確直投式發(fā)酵劑制備過程中菌體細胞存活率的變化，選擇植物乳桿菌R23為實驗菌，采用掃描電鏡、透射電鏡和正交試驗等手段對收集條件、預(yù)凍條件和凍干時間等進行研究。結(jié)果表明，植物乳桿菌R23優(yōu)化收集時間為15 h，此時菌量達到最大且活力較高；在優(yōu)化的離心條件下菌體細胞存活率達92.4%，其中離心力起關(guān)鍵作用；采用梯度預(yù)凍即-20，-40，-80 ℃各1，2，3 h，可使物料達到較優(yōu)凍結(jié)效果；發(fā)酵劑物料凍干至水質(zhì)量分數(shù)為1.20%時最有利于貯藏。研究在明確菌劑制備關(guān)鍵因素對菌體細胞干預(yù)機制的基礎(chǔ)上，還獲得了適宜的制備條件，對直投式發(fā)酵劑的規(guī)模化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

直投式發(fā)酵劑； 細胞存活率； 植物乳桿菌R23； 干預(yù)機制； 制備條件

菌種高密度培養(yǎng)、菌體濃縮收集和真空冷凍干燥等過程均是高活力直投式發(fā)酵劑(direct vat set,DVS)制備的重要環(huán)節(jié)[1]。前期研究確定了適宜植物乳桿菌R23高密度增殖的工藝參數(shù)，菌量達1.0×1010CFU/mL以上，為后期菌劑制備工藝奠定了良好基礎(chǔ)[2]。目前菌體濃縮主要有超濾法和離心法等[3]。超濾法對設(shè)備要求較高，條件不易控制，菌種容易被污染；離心雖然對菌體有所損傷，但此法簡便、快速、處理量大，菌種純度容易控制，適用于商業(yè)化生產(chǎn)[4]。離心濃縮中菌種活性、離心條件等均可影響菌株對冷凍及干燥的敏感度。目前已有乳酸菌離心分離條件的相關(guān)研究[5-6]，但各離心因素對細胞活力的具體影響機制尚無實際證據(jù)，因此有必要深入探討影響菌體細胞存活率的主要因子及其干預(yù)機制，提高菌體的離心濃縮效果。

真空冷凍干燥過程主要分為預(yù)凍、升華干燥和解析干燥3個步驟。預(yù)凍是將物料中游離態(tài)水凍結(jié)成冰的過程，預(yù)凍效果對于凍干物質(zhì)形態(tài)的維持非常關(guān)鍵，但相比于其他凍干過程，預(yù)凍參數(shù)的優(yōu)化在乳酸菌菌劑制備工藝研究中尤為欠缺。已有研究表明，預(yù)凍環(huán)節(jié)中降溫速度、凍結(jié)溫度和凍結(jié)時間都是重要的工藝參數(shù)，它們相互作用，共同影響著凍結(jié)物質(zhì)的結(jié)晶情況[7]。其中，降溫速度是目前研究的焦點，大部分研究認為快速凍結(jié)有利于菌體存活，也有研究認為快速凍結(jié)或慢速凍結(jié)皆有其利弊[8]；因此，在保證較高存活率的前提下，需顧及菌劑物理性狀和溶解性能等。有關(guān)凍結(jié)溫度和凍結(jié)時間的研究相對較少，但其合理選擇可保證物料的適度預(yù)凍，使干燥后的物料很好地保持原有性質(zhì)并縮短干燥時間[9]。

研究以植物乳桿菌R23為實驗菌，著重對離心濃縮條件及真空冷凍干燥過程的關(guān)鍵參數(shù)進行優(yōu)化，旨在提高凍干菌體細胞存活率，同時改善菌劑理化性狀和降低能耗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) R23，由福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點實驗室分離、鑒定并保存。

1.1.2培養(yǎng)基

LHR20參見文獻[2]。改良TJA培養(yǎng)基參見文獻[10]。

1.1.3保護劑配方

甘油2.8%，谷氨酸鈉2.1%，海藻糖1.4%，山梨醇0.7%，脫脂乳10%，均為質(zhì)量分數(shù)。

1.1.4主要試劑

脫脂乳粉(優(yōu)級純)，美國BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZQLY-180S型立式雙層恒溫振蕩器，上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GI54DW型高壓滅菌器，美國致微公司；TGL-18C型高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；LD PLUS型真空冷凍干燥機，德國Christ公司；HT7700型透射電鏡，日立公司；6380LV型掃描電鏡，日本電子公司。

1.3 實驗方法

1.3.1生長曲線測定

將活化的植物乳桿菌R23接種于LHR20液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，每隔3 h取樣測定菌量，繪制菌體生長量隨時間的變化趨勢圖。

1.3.2植物乳桿菌R23收集條件優(yōu)化

選擇離心力、離心溫度和離心時間為考察對象，以細胞存活率為指標(biāo)，作L9(34)正交試驗，各因素水平如表1。將所得數(shù)據(jù)用DPS軟件進行處理分析，并通過掃描電鏡和透射電鏡觀察菌體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，深入探討主體影響因素對菌體細胞存活率的作用機制。

1.3.3預(yù)凍條件對菌體存活率影響的測定

按照V保護劑∶V菌泥=4∶1將保護劑與植物乳桿菌R23菌泥混合、分裝，并作以下預(yù)凍處理： 1)單溫預(yù)凍ⅰ為-40 ℃，6 h；2)單溫預(yù)凍ⅱ為-80 ℃，6 h；3)梯度預(yù)凍ⅲ為-20，-40，-80 ℃各1，2，3 h；4)梯度預(yù)凍ⅳ為-20，-40，-80 ℃各2 h；5)梯度預(yù)凍ⅴ為-20，-40，-80 ℃各3，2，1 h。檢測處理前后的活菌量，分析確定適宜的預(yù)凍條件。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表

離心力603，2 414，9 659g分別代表的轉(zhuǎn)速為3 000，6 000，9 000 r/min。

1.3.4凍干時間對菌劑水質(zhì)量分數(shù)及菌體存活率影響的測定

在1.3.3基礎(chǔ)上，將預(yù)凍好的樣品放入真空冷凍干燥機，分別于0，5，10，15，24 h取出檢測菌量和水質(zhì)量分數(shù)，并以凍干前樣品為對照進行菌體存活率計算，分析凍干過程中菌量及水質(zhì)量分數(shù)變化規(guī)律。

1.4 計算方法

1.4.1菌量測定方法

采用平板菌落計數(shù)法，參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》進行。

1.4.2細胞存活率的計算

菌體細胞存活率的計算，參照文獻[11]進行，計算公式見式(1)：

細胞存活率=S2/S1×100%。

(1)

式(1)中：S1為處理前活菌總數(shù)，CFU/mL；S2為處理后殘留活菌數(shù)，CFU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種適宜收集時間分析

在優(yōu)化的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件下，植物乳桿菌R23的生長曲線如圖1。0～3 h為菌體生長延滯期，菌量略有下降；3 h后進入對數(shù)生長期，15 h后進入穩(wěn)定期。為獲得高菌量且高活力的菌種，宜選擇對數(shù)生長末期15 h作為R23的收集時間。

2.2 離心條件對菌體收集效果的影響及作用機制

菌體離心收集在保證高濃度菌量的同時，可避免代謝產(chǎn)物乳酸鹽等對菌體的毒害。各因素對菌體細胞存活率的影響主次順序為離心力>溫度>時間，其中離心力的影響達顯著水平(見表2、表3)。

圖1 植物乳桿菌R23的生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum R23

圖2 不同離心處理條件下的菌體超微形態(tài)Fig.2 Bacterial ultra-morphology of different treatments

表2 正交試驗結(jié)果與極差分析

表3 正交試驗方差分析

F0.01(2,2)=99,*** ;F0.05(2,2)=19,** ;F0.1(2,2)=9,*。

從實驗結(jié)果分析得出最佳離心條件為A2B1C3，即離心力2 414g，溫度4 ℃，時間15 min。由于溫度、時間對細胞存活率的影響均不顯著，因此從離心機的能耗角度考慮，宜選擇A2B3C1組合，即離心力2 414g，溫度16 ℃，時間5 min。

對理論最佳工藝與所選工藝的驗證結(jié)果表明，2種組合獲得的細胞存活率無顯著差異，且與正交試驗結(jié)果一致(見表4)。因此在優(yōu)化的離心力條件下，可以適當(dāng)縮短離心時間，提高離心溫度，進而降低菌體濃縮成本，簡化制備工序。

表4 理論最佳工藝與所選工藝驗證實驗

小寫字母表示差異顯著，顯著值p<0.05；大寫字母表示差異極顯著，顯著值p<0.01；下同。

為充分明確主要影響因子即離心力的作用機制，以2 414g為對照(CK)，觀察9 659g高速離心處理(H)后菌體的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2。與對照相比，高速處理后的植物乳桿菌R23細胞變化明顯。菌體細胞失去原有的飽滿程度，多數(shù)細胞表面發(fā)生皺縮、坍陷等現(xiàn)象(掃描電鏡，CK1與H1)；高速處理后，細胞外圍包被的一層透明狀胞外多糖類物質(zhì)被不同程度地離散為棉絮狀(透射電鏡，CK2與H2)；菌體表面粗糙度增加，細胞壁、細胞膜出現(xiàn)破裂(透射電鏡，CK3與H3)。由此可見，高離心力可導(dǎo)致菌體細胞形態(tài)及部分結(jié)構(gòu)的變化，從而影響到菌體的存活。

2.3 預(yù)凍條件對菌體存活率的影響

不同預(yù)凍處理對菌體細胞存活率的影響如表5。同等時間內(nèi)，梯度預(yù)凍的效果明顯優(yōu)于單溫預(yù)凍處理；而3種梯度處理中ⅲ的細胞存活率最高，且與其他處理間存在顯著差異，提示預(yù)凍溫度和時間的合理搭配，可在保證物料充分凍結(jié)前提下，最大程度減小菌體的機械損傷，預(yù)凍效果達到最佳狀態(tài)。

表5 不同預(yù)凍處理條件下菌體細胞存活率

2.4 凍干時間對菌體存活率的影響

菌劑殘余水分含量是影響其保藏穩(wěn)定性的因素之一，不同凍干時間下植物乳桿菌R23菌劑水質(zhì)量分數(shù)和細胞存活率如表6。初步凍干的5 h內(nèi)水質(zhì)量分數(shù)迅速下降，細胞存活率無顯著變化；之后水質(zhì)量分數(shù)基本維持在1.0%左右，細胞存活率極緩慢下降，但仍無顯著差異。為保證菌體表面親水基團受到持續(xù)性保護，避免與氧的結(jié)合而破壞DNA結(jié)構(gòu)，宜選擇10 h為適宜的凍干時間，即菌劑w(水)為1.20%。

表6 不同凍干時間下菌劑水質(zhì)量分數(shù)及細胞存活率

3 結(jié) 論

菌齡直接影響著菌種收集過程中菌體的生存能力，在對數(shù)生長末期或穩(wěn)定初期菌量達到頂峰，胞外多糖等物質(zhì)也開始大量分泌，菌體細胞顯示出較高活性[12-13]；而在穩(wěn)定期末期或衰亡期，細胞內(nèi)物質(zhì)外流或營養(yǎng)貧乏導(dǎo)致的細胞饑餓均會使菌體結(jié)構(gòu)發(fā)生塌陷甚至死亡[14]。研究選擇對數(shù)生長末期15 h作為植物乳桿菌R23的收集時間，將最大限度地保證菌體在離心濃縮中的活力。有研究認為，離心強度(離心力和時間)與離心效果成正比[4]；研究發(fā)現(xiàn)，在以細胞存活率為指標(biāo)的前提下，這一正比關(guān)系需在一定的范圍方可成立，離心力與時間過大或過小，均不能獲得理想的離心效果，這與吳滿剛等[15]對植物乳桿菌L2的研究結(jié)果類似。在排除細胞饑餓或內(nèi)容物外滲的狀況下，植物乳桿菌R23細胞存活率的降低，一方面可能是低離心強度下上清液中殘留的菌體過多；另一方面可能是高離心力增強了細胞的剪切作用，長時間離心增加了菌體在壓力沉降中彼此之間的相互壓力，加上不適宜的溫度影響，共同導(dǎo)致細胞皺縮、坍陷、胞外物質(zhì)離散、細胞壁和細胞膜破壞等現(xiàn)象。而細胞皺縮和坍陷皆是由于細胞內(nèi)外滲透壓的不同而出現(xiàn)內(nèi)容物外滲的結(jié)果。另外，有研究認為胞外多糖或莢膜多糖等成分具有耐干燥、黏附、抗氧化[16-17]等作用，此類物質(zhì)的離散會導(dǎo)致其部分功能喪失；這些均可降低細胞的活性導(dǎo)致菌體死亡率增加。

菌體收集條件的優(yōu)化及各參數(shù)對菌體細胞影響的深入探討，可為后期DVS菌劑的凍干過程提供高濃度、高活力的菌種，有效降低能耗，對于菌劑的規(guī)模化生產(chǎn)具有實際指導(dǎo)意義。在冷凍干燥過程中，物料預(yù)凍的最終溫度以其共晶點為依據(jù)，為保證物料完全凍結(jié)，預(yù)凍溫度要比物料的共晶點低5～10 ℃[18-19]。研究證實乳酸菌的共晶點在-20 ℃左右[20]，即-25～-30 ℃可滿足乳酸菌凍結(jié)的要求。研究中植物乳桿菌R23完全凍結(jié)的溫度為-40 ℃，提示該菌的共晶點在-20 ℃以下，具體溫度尚待實驗證實。而梯度預(yù)凍優(yōu)于單溫預(yù)凍的原因，可能是梯度凍干物質(zhì)形成的晶體結(jié)晶度較好，實現(xiàn)了真正意義上的最佳凍結(jié)濃縮狀態(tài)，菌體得到最大程度的保護。進一步得出，菌體預(yù)凍效果是受多因素共同作用的。李代禧等[8]在丙氨酰谷氨酰胺溶液預(yù)凍方式對凍干樣品影響的研究中，使用多次變溫退火預(yù)凍方式獲得了粒度均一的丙氨酰谷氨酰胺晶體，而梯度降溫預(yù)凍方式在乳酸菌上的應(yīng)用鮮有報道。另外，在最佳凍干時間10 h條件下，物料水質(zhì)量分數(shù)略低于常規(guī)的研究范圍，說明適宜水質(zhì)量分數(shù)大小還要考慮到保護劑組成及菌體特性。同時，在發(fā)酵劑的制備中，可通過測定樣品的水質(zhì)量分數(shù)來判斷凍干終點，簡化生產(chǎn)工藝。

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EffectsofDVSPreparationConditionsonCellViabilityofLactobacillus

REN Xiangyun1,2， HE Zhigang1,2,*， LI Weixin1,2， LIN Xiaozi1,2， LIANG Zhangcheng1,2

(1.InstituteofAgriculturalEngineeringTechnology，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou350003，China; 2.FujianKeyLaboratoryofAgriculturalProduct(Food)Processing，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou350013，China)

In this study,LactobacillusplantarumR23 was used as the tested bacteria, and the effects of collecting conditions, pre-freezing conditions and freeze-drying time on cell viability were studied by scanning electron microscope，transmission electron microscope，and the orthogonal test. The results showed that the amount of bacteria reached the maximum and higher activity at the 15th hour during the process of incubation, which might be considered as the suitable harvest time. The cell survival could reach 92.4% under optimum conditions, of which the centrifugal force played a key role. The optimum temperature and duration of gradient pre-freezing were -20, -40, -80 ℃ and 1, 2, 3 h, respectively. And the optimum moisture content ofLactobacillusplantarumR23 to be storaged was 1.20%. Based on this study, the interference mechanism of the key factors for DVS preparation on cells was explicited, and the suitable preparation conditions were obtained, which was a guidance to the large scale production of high efficient DVS.

DVS; cell viability;LactobacillusplantarumR23; intervention mechanism; preparation conditions

張逸群)

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.06.006

2095-6002(2017)06-0036-06

任香蕓，何志剛，李維新，等. 直投式發(fā)酵劑制備工藝對乳酸菌存活率的影響[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2017,35(6):36-41.

REN Xiangyun，HE Zhigang，LI Weixin, et al. Effects of DVS preparation conditions on cell viability ofLactobacillus[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(6):36-41.

TS201.3; TS201.1; Q939.1

A

2017-04-18

福建省自然科學(xué)基金資助項目(2015J01101)。

任香蕓，女，助理研究員，碩士，主要從事食品微生物選育及食品發(fā)酵方面的研究；*何志剛，男，研究員，主要從事食品發(fā)酵與釀造方面的研究，通信作者。