王友升， 王勝杰， 馬國(guó)為

(北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心, 北京 100048)

第二信使環(huán)腺苷酸和環(huán)鳥(niǎo)苷酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王友升， 王勝杰， 馬國(guó)為

(北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心, 北京 100048)

3′,5′-環(huán)腺苷酸(cAMP)和3′,5′-環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)是真核細(xì)胞內(nèi)常見(jiàn)的調(diào)節(jié)眾多功能的第二信使，最近以cAMP/cGMP信號(hào)通路為靶點(diǎn)研發(fā)的功能食品也越來(lái)越多，因此檢測(cè)cAMP/cGMP的含量至關(guān)重要。介紹了放射性同位素法、均相非放射性同位素法、非均相非同位素法等近年來(lái)廣泛使用的cAMP/cGMP檢測(cè)方法的原理及其實(shí)際應(yīng)用情況，分析了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)及靈敏度。其中，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、極化熒光檢測(cè)技術(shù)等均相非放射性同位素法因其操作便捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高而適用于cAMP/cGMP的高通量檢測(cè)。

cAMP； cGMP； 檢測(cè)方法； 靈敏度

3′,5′-環(huán)腺苷酸(cAMP)和3′,5′-環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)是細(xì)胞內(nèi)常見(jiàn)的調(diào)節(jié)眾多功能的第二信使，通過(guò)開(kāi)放離子通道來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)眾多機(jī)體生理功能[1]。據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇[2]、茶多酚[3-4]、皂苷、花青素等許多食品功能因子通過(guò)直接或間接影響cAMP/cGMP信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其功效。研究對(duì)cAMP/cGMP信號(hào)通路的影響首先需要檢測(cè)cAMP/cGMP，因其水平變化對(duì)解析相關(guān)食品功能因子的作用機(jī)理有一定的實(shí)際意義，尤其是需要借助高通篩選技術(shù)來(lái)篩選相關(guān)的食品功能因子。

目前檢測(cè)cAMP和cGMP最常用的是免疫學(xué)檢測(cè)，有時(shí)需要乙?；襟E和放射性標(biāo)記來(lái)提高其靈敏度[5-7]。這些檢測(cè)方法較靈敏，其檢測(cè)下限在100 pmol/L以下，但是只能檢測(cè)給定樣品中一種環(huán)核苷酸。有些方法使用放射性物質(zhì)，從安全方面考慮，建議選擇可替換的方法檢測(cè)。有一些基于HPLC的分析方法，通過(guò)耦合熒光或光電二極管陣列檢測(cè)，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，但是高樣品量和低靈敏度限制了其適用范圍。相比而言，其他如臨近閃爍分析法、均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、極化熒光技術(shù)、ATP生物發(fā)光技術(shù)等更加適用于相關(guān)食品功能因子的高通量篩選，其主要載體為微孔板，檢測(cè)速度快，實(shí)際消耗量低。因此，在了解不同cAMP/cGMP檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍的基礎(chǔ)上，根據(jù)研究目的尋找一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)和可重復(fù)的定量檢測(cè)cAMP/cGMP含量的方法至關(guān)重要。

1 放射性同位素法

放射性同位素法主要包括放射免疫技術(shù)和臨近閃爍分析法。由于放射性同位素法檢測(cè)結(jié)果非常準(zhǔn)確、靈敏度比較高，所以放射性同位素檢測(cè)被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”。

1.1 放射免疫法

放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)的基本原理是標(biāo)記放射性核素的抗原或抗體與待測(cè)的抗原和抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物的放射性來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣品。冉秋等[8]研究了不同中藥成分對(duì)帕金森大鼠cAMP和cGMP的影響，結(jié)論是不同中藥成分能明顯使cAMP和cGMP水平恢復(fù)正常。隋峰等[9]研究了不同炮制品的大黃對(duì)發(fā)熱大鼠的解熱作用，發(fā)現(xiàn)大黃的解熱作用可能與其能抑制cAMP含量升高有關(guān)。

RIA法的優(yōu)點(diǎn)在于既有放射性同位素的靈敏性，又兼具抗原和抗體反應(yīng)的特異性，缺點(diǎn)是存在放射性污染。

1.2 臨近閃爍分析法

臨近閃爍分析法(scintillation proximity assay，SPA)來(lái)源于RIA，其測(cè)量體系同時(shí)存在授予體、接收體、固定授予體- 接收體復(fù)合物的含有閃爍劑的載體。當(dāng)載體表面同時(shí)固定授予體和接收體，弱β粒子所發(fā)射的射線(xiàn)能夠到達(dá)載體內(nèi)的閃爍劑進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，激發(fā)閃爍劑發(fā)射光子并被檢測(cè)器記錄[10]?；赟PA原理設(shè)計(jì)的cAMP/cGMP檢測(cè)技術(shù)有cAMP/cGMP-[125I]Direct Biotrak Assay/SPA，隨后又開(kāi)發(fā)了適用于高通量、均相放射性實(shí)驗(yàn)的FlashPlate微孔板。Mancinelli等[11]用氨基丁酸處理小鼠膽管細(xì)胞，結(jié)果氨基丁酸能顯著提高小鼠膽管細(xì)胞中的cAMP水平。

SPA法的優(yōu)點(diǎn)是分析過(guò)程簡(jiǎn)單、靈敏度高，可微量化、可自動(dòng)化檢測(cè)，被認(rèn)為是 “金標(biāo)準(zhǔn)”。但SPA法有一些缺點(diǎn)：1)產(chǎn)生大量對(duì)人體有害的放射性垃圾；2)放射性同位素的半衰期較短，只有60 d(125I)；3)存在明顯的交叉干擾現(xiàn)象，主要因?yàn)榉派湫酝凰氐哪芰糠浅８摺?/p>

2 均相非放射性同位素法

2.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)的基本原理是激發(fā)態(tài)的供體熒光團(tuán)通過(guò)非輻射的方式把能量轉(zhuǎn)移給受體，造成受體的熒光發(fā)射增加[12]?；贔RET原理開(kāi)發(fā)的cAMP/cGMP檢測(cè)技術(shù)為AlphaScreen技術(shù)，該技術(shù)中的供體微珠含有光敏劑分子，光敏劑分子能活化其周?chē)难醴肿?，能量轉(zhuǎn)換引起受體微珠在520～620 nm產(chǎn)生熒光信號(hào)[13]。AlphaLISA是在Alpha Screen的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的更適合高通量篩選的技術(shù)。Sheng等[14]用佛司可林和胰島素樣肽5處理CHO- RXFP4細(xì)胞，佛司可林能促進(jìn)cAMP含量升高， 胰島素樣肽5可抑制由佛司可林刺激產(chǎn)生的cAMP含量升高，用該方法檢測(cè)的cAMP含量呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)。

AlphaScreen技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是具有非放射性、均相的特點(diǎn)，檢測(cè)快速、穩(wěn)定，靈敏度更高。缺點(diǎn)是反應(yīng)體系不能處于強(qiáng)光或是長(zhǎng)時(shí)間的室內(nèi)光環(huán)境中；其次，某些化合物結(jié)合單體氧分子會(huì)影響光信號(hào)。同其他技術(shù)相比，該技術(shù)對(duì)檢測(cè)儀器平臺(tái)有要求。

2.2 均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移

均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(time-resolved fluorescence resonance energy transfer，TR-FRET)的供體是鑭系元素，受體是有機(jī)染料，二者聯(lián)合使用[15]。鑭系染料與傳統(tǒng)的FRET染料比較而言，不完全標(biāo)記的供體和受體樣品在檢測(cè)時(shí)不敏感，因此其準(zhǔn)確性較高，信噪比較大?；赥R-FRET原理開(kāi)發(fā)的cAMP/cGMP檢測(cè)技術(shù)有LANCEUltracAMP assay，通過(guò)升級(jí)TR-FRET技術(shù)為homogeneous time resolved fluorescence(HTRF)開(kāi)發(fā)了檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP/cGMP的方法。

以L(fǎng)ANCEUltracAMP assay為例，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase,AC)促進(jìn)cAMP水平升高。Eu(europium)標(biāo)記的cAMP示蹤物和游離的cAMP競(jìng)爭(zhēng)性與標(biāo)記ULightTM染料的cAMP特異性單克隆抗體位點(diǎn)結(jié)合。當(dāng)Eu-cAMP示蹤物與單克隆抗體結(jié)合，320 nm或者340 nm條件下的激發(fā)光能使Eu-cAMP示蹤物處于激發(fā)態(tài)。接著能量通過(guò)FRET從Eu-cAMP示蹤物轉(zhuǎn)移到單克隆抗體上的ULightTM，在665 nm處能檢測(cè)到發(fā)光。Eu-cAMP示蹤物上的剩余能量在615 nm處能檢測(cè)到發(fā)光。在沒(méi)有游離cAMP存在的條件下，TR-FRET信號(hào)最大；當(dāng)存在游離cAMP 時(shí)，Eu(europium)標(biāo)記的cAMP示蹤物和游離的cAMP競(jìng)爭(zhēng)性與標(biāo)記ULightTM染料的cAMP特異性單克隆抗體位點(diǎn)結(jié)合，TR-FRET信號(hào)下降。Pascale等[16]采用TR-FRET方法檢測(cè)cAMP的S/B比值為44.6，IC50大約在1 nmol/L。Raveh等[17]采用TR-FRET方法檢測(cè)cAMP水平來(lái)反映RGS2蛋白對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)的影響，檢測(cè)結(jié)果呈明顯濃度效應(yīng)。

均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏和穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、信噪比高，適用于高通量檢測(cè)。缺點(diǎn)是特異性單克隆抗體較昂貴。

2.3 極化熒光檢測(cè)

極化熒光檢測(cè)(fluorescence polarization, FP)是在適當(dāng)?shù)奈恢迷O(shè)置起偏器和檢偏器，當(dāng)用熒光物質(zhì)標(biāo)記待測(cè)樣品時(shí)，其熒光信號(hào)通過(guò)該光路時(shí)會(huì)由弱變強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)偏振熒光強(qiáng)度來(lái)定量待測(cè)物質(zhì)[18]。cAMP/cGMP fluorescence polarization(FP) biotrak immunoassay system就是基于FP原理開(kāi)發(fā)的cAMP/cGMP檢測(cè)技術(shù)。

FP的優(yōu)點(diǎn)是靈敏性較高、穩(wěn)定性強(qiáng)。缺點(diǎn)是熒光素的熒光壽命太短，會(huì)限制其在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。

2.4 均相酶免疫分析

均相酶免疫分析法(homogeneous enzyme immunoassay，HEIA)主要包括酶標(biāo)記的半抗原和非標(biāo)記的半抗原，它們與限量抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，如果抗體與酶標(biāo)記的半抗原結(jié)合，那么會(huì)形成空間位阻，酶的催化能力下降，通過(guò)檢測(cè)體系中底物的吸光度來(lái)反映樣品中半抗原的含量[19]。基于HEIA開(kāi)發(fā)的cAMP/cGMP檢測(cè)技術(shù)有HitHunter?cAMP。HitHunter?cAMP原理為，β-半乳糖苷酶片段酶供體(ED)與cAMP形成共軛機(jī)構(gòu)，胞內(nèi)cAMP與ED-cAMP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合anti-cAMP抗體(Ab)上的結(jié)合位點(diǎn)，由于胞內(nèi)cAMP含量較低，大部分ED-cAMP與cAMP Ab結(jié)合，ED-cAMP不能與酶受體(EA)集合。胞內(nèi)cAMP含量較高時(shí)，anti-cAMP抗體結(jié)合位點(diǎn)飽和，ED-cAMP補(bǔ)足EA，形成活化酶，活化酶水解其基質(zhì)形成化學(xué)發(fā)光。

HEIA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是體系均相、特異性強(qiáng)、靈敏度高，便于自動(dòng)化檢測(cè)，既有抗原和抗體系統(tǒng)的特點(diǎn)，又兼具酶和底物系統(tǒng)的特點(diǎn)；缺點(diǎn)是試劑大多依靠進(jìn)口，依賴(lài)專(zhuān)用儀器、檢測(cè)成本高。

2.5 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移

某些海洋動(dòng)物體內(nèi)有共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，其能量供體和受體之間存在非放射性的能量轉(zhuǎn)移，生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)技術(shù)就是基于該原理設(shè)計(jì)的[20]。Prinz等[21]引進(jìn)了第一個(gè)基于蛋白激酶 A(PKA)的cAMP傳感器。他們把海腎螢光素酶(Rluc)和兩個(gè)調(diào)控亞基(RI和RII)分別融合在一起，制成兩個(gè)不同的適合BRET體系的供體蛋白，RI-Rluc和RII-Rluc。受體蛋白由催化亞基和GFP融合而成(GFP-C)。COS7細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染RI-Rluc和GFP-C，或RII-Rluc和GFP-C來(lái)檢測(cè)活細(xì)胞中PKA亞基的相互作用，比較實(shí)時(shí)條件下PKA-I和PKA-II信號(hào)的差異。由于PKA的調(diào)控亞基和催化亞基分離依賴(lài)于cAMP結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)cAMP含量升高，BRET信號(hào)以劑量依賴(lài)的方式下降。

BRET技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是其背景極低，靈敏度高，而且不需外源光激發(fā)，分別對(duì)能量供體和受體進(jìn)行定量。缺點(diǎn)是熒光素酶Rluc量子產(chǎn)率較低，限制了高效靈敏BRET技術(shù)的開(kāi)發(fā)。

2.6 ATP生物發(fā)光法

ATP生物發(fā)光法主要包括 ATP 發(fā)光試劑、樣品預(yù)處理和發(fā)光檢測(cè)儀三大部分，螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase, FL)和熒光素反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生的光，通過(guò)檢測(cè)光來(lái)定量待測(cè)物質(zhì)含量[22]?；贏TP生物發(fā)光技術(shù)的cAMP檢測(cè)技術(shù)有cAMP-GloTMAssay。cAMP-GloTMAssay是一種均質(zhì)的高通量方法，其檢測(cè)胞內(nèi)cAMP水平的原理為cAMP通過(guò)激活PKA的活性，降低 ATP的含量，其偶聯(lián)的螢光素酶(luciferase)發(fā)光信號(hào)降低，用一種測(cè)試化合物在一段合適的時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞；誘導(dǎo)后的裂解細(xì)胞，釋放cAMP，接著加入含有PKA 的 cAMP 檢測(cè)溶液，然后加入 Kinase-Glo?Reagent 終止 PKA 反應(yīng)，并用螢光素酶反應(yīng)檢測(cè)殘余ATP。 該技術(shù)的cAMP檢測(cè)靈敏度為每孔30±5 fmol，重復(fù)性較好，Z′ >0.8。

ATP生物發(fā)光法簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度，但檢測(cè)費(fèi)用較高。

2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

熒光素酶(luciferase，Luc)報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)中順式元件活性的變化通過(guò)基因活性的變化來(lái)反映，一般會(huì)把報(bào)告基因和特定的順式反應(yīng)元件串聯(lián)表達(dá)[23]。目前基于該技術(shù)開(kāi)發(fā)的cAMP/cGMP檢測(cè)有GloSensorTMcAMP/cGMP Assay。GloSensorTM技術(shù)將螢火蟲(chóng)螢光素酶經(jīng)過(guò)遺傳改造，插入了一個(gè)結(jié)合cAMP 的蛋白組分。當(dāng)結(jié)合上cAMP 后，螢光素酶構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致光輸出的增加。馬曉蕓等[24]成功構(gòu)建了cAMP反應(yīng)元件螢光素酶報(bào)告基因載體，用于G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 活性的檢測(cè)，也為基于GPCR活性的藥物高通量篩選提供依據(jù)。楊雯[25]構(gòu)建的新型檢測(cè)系統(tǒng)CRE-rLuc/NFAT-fLuc能同時(shí)檢測(cè)胞內(nèi)cAMP和Ca2+水平，通過(guò)該檢測(cè)系統(tǒng)得到的相應(yīng)已知激動(dòng)劑的EC50值與報(bào)道的文獻(xiàn)一致，證明了該方法具有一定靈敏性和可行性。

該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是具有較高的靈敏度、檢測(cè)方便，主要優(yōu)勢(shì)在于能對(duì)細(xì)胞的生理化學(xué)物質(zhì)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)；缺點(diǎn)是會(huì)出現(xiàn)背景蛋白表達(dá)的不穩(wěn)定，如果報(bào)告蛋白半衰期比較長(zhǎng)，會(huì)直接影響對(duì)目的基因表達(dá)的檢測(cè)。

3 非均相非同位素法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)，其基本原理為特定固相載體的表面結(jié)合了抗原或抗體，抗原或抗體和某種酶結(jié)合，稱(chēng)為酶標(biāo)記的抗原或抗體，該酶標(biāo)抗原或抗體同時(shí)兼具酶的活性和抗原或抗體的免疫活性[26]。Henkin等[27]采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)了人腮腺唾液中的cAMP/cGMP含量，通過(guò)比較其在不同性別和年齡的味覺(jué)和嗅覺(jué)障礙病人之間的含量，來(lái)闡述其內(nèi)在關(guān)系。

ELISA的優(yōu)點(diǎn)主要是靈敏、特異，對(duì)儀器要求較低，易于推廣，對(duì)環(huán)境友好，反映效果能最大化顯示；缺點(diǎn)是操作繁瑣，對(duì)某些結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的分析檢測(cè)仍會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，影響檢測(cè)結(jié)果。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)的原理是當(dāng)樣品在流動(dòng)相的推動(dòng)作用下通過(guò)固定相時(shí)，由于樣品中的物質(zhì)在兩相存在不同的分配系數(shù)，所以當(dāng)樣品多次分配后就能達(dá)到分離。Damme等[28]采用反相高效液相色譜法分析了人體血漿和動(dòng)物組織中cAMP/cGMP含量。王向紅等[29]采用HPLC技術(shù)檢測(cè)了棗果中的cAMP/cGMP含量。

HPLC技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為分離效率高，選擇性好，操作自動(dòng)化，應(yīng)用范圍廣； 缺點(diǎn)是分析成本高，液相色譜儀價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用貴。HPLC往往作為分離手段，常與質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行定量研究。

3.3 液質(zhì)聯(lián)用法

液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)結(jié)合了液相色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能，能準(zhǔn)確定量和鑒定復(fù)雜體系中的組分[30]。Oeckl等[31]建立的LC-MS/MS方法能同時(shí)檢測(cè)cAMP和cGMP，該方法快速、靈敏且具有廣泛的適用性。LC-MS/MS法檢測(cè)極限是50 pmol/L，cAMP和cGMP在0.5～500 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，組內(nèi)和組間的精密度和準(zhǔn)確度較高，分析時(shí)間為3.5 min。為了驗(yàn)證該方法的適用性，用咯哩普蘭和扎普司特處理小鼠，咯哩普蘭和扎普司特分別是PDE4和PDE5的抑制劑，結(jié)果表明，咯哩普蘭和托普司特能明顯提高cAMP和cGMP的濃度。楊云菲等[32]采用LC-MS/MS方法檢測(cè)大鼠血漿中的cAMP和cGMP，該方法專(zhuān)一性強(qiáng)，可用于藥物代謝機(jī)制研究。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜提供結(jié)構(gòu)信息的功能，具有高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是成本較高。

3.4 高效毛細(xì)管電泳法

高效毛細(xì)管電泳法(high performance capillary electrophoresis,HPCE)采用的分離管道為毛細(xì)管道，是根據(jù)待檢測(cè)樣品在分配方式上存在的差異，以高壓電場(chǎng)作為驅(qū)動(dòng)力的分離技術(shù)。

張雅利等[33]采用高效毛細(xì)管電泳法分析紅棗中cAMP和cGMP的含量，cAMP和cGMP含量分別在2～650 mg·L-1，2～600 mg·L-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r>0.998)；平均回收率為 95.8%，96.2%；RSD分別為2.12%，2.43%，因此高效毛細(xì)管電泳法可用于檢測(cè)紅棗中cAMP和cGMP的含量。

高效毛細(xì)管電泳法的主要優(yōu)點(diǎn)是分離效率高且經(jīng)濟(jì)環(huán)保、時(shí)間短、重現(xiàn)性好，最主要的是成本較低；缺點(diǎn)是進(jìn)樣量少，檢測(cè)窗口小，靈敏度比液相色譜低。

4 結(jié) 語(yǔ)

某些食品功能因子的抗氧化、抗腫瘤、降血糖等功效與cAMP/cGMP信號(hào)通路密切相關(guān)，相關(guān)食品功能因子能直接或間接引起cAMP/cGMP信號(hào)通路上游或下游信號(hào)分子的含量變化，繼而調(diào)節(jié)相關(guān)代謝。因此想要解析相關(guān)食品功能因子的作用機(jī)理，必須首先檢測(cè)cAMP/cGMP的含量變化。由于基于各種原理開(kāi)發(fā)出的技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)各有不同，在實(shí)際操作中，必須對(duì)每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和靈敏度充分了解后才能選擇合適的方法，表1總結(jié)了cAMP/ cGMP常用檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及其檢測(cè)靈敏度。

表1 cAMP/cGMP常用檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)及靈敏度比較

為了保證檢測(cè)效果，必須將兩種以上的方法組合進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的評(píng)判。不同的檢測(cè)方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性相差較大，靈敏性也是選擇檢測(cè)方法的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于高通量篩選，應(yīng)選擇信號(hào)窗口較大、速度快、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜的方法，為保證檢測(cè)效果，應(yīng)使用放射性同位素法進(jìn)行驗(yàn)證。

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TechniquesforDetectionofSecondMessengerscAMPandcGMP

WANG Yousheng， WANG Shengjie， MA Guowei

(BeijingAdvancedInnovationCenterforFoodNutritionandHumanHealth/BeijingLaboratoryforFoodQualityandSafety/BeijingEngineeringandTechnologyResearchCenterofFoodAdditives,BeijingTechnologyandBusinessUniversity,Beijing100048,China)

cAMP(cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate) and cGMP(cyclic guanosine 3′,5′-monophosphate) are ubiquitous second messengers which regulate myriads of functions in eukaryotic cells, and their signaling pathways are regarded as the popular target in functional food bioactives screening. In this review, we discuss the advantages and disadvantages of techniques such as radioisotope, homogeneous non-radioactive isotope and heterogeneous non-isotopic methods, which are used to measure cAMP and cGMP and describe how these techniques can be applied. The homogeneous non-radioactive isotope methods, including fluorescence resonance energy transfer technology (FRET), homogeneous time-resolved fluorescence resonance energy transfer technology (TR-FRET), polarization fluorescence detection technology (FP), are suitable for cAMP/cGMP high-throughput screening of bioactives for functional food based on its advantages of easy operation, high specificity and sensitivity.

cAMP； cGMP； detection techniques； sensitivity

葉紅波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.06.008

2095-6002(2017)06-0048-07

王友升，王勝杰，馬國(guó)為.第二信使環(huán)腺苷酸和環(huán)鳥(niǎo)苷酸檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(6):48-54.

WANG Yousheng，WANG Shengjie，MA Guowei. Techniques for detection of second messengers cAMP and cGMP[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(6):48-54.

TS201.4; TS207.3; Q524

A

2016-12-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471626； 32171944)。

王友升，男，教授，博士，主要從事系統(tǒng)生物技術(shù)方面的研究。