楊增艷 趙湘培 柏春暉 韋金育 黃 鑫

1.廣西民族醫(yī)藥研究院 (廣西 南寧， 530001) 2.廣西維康醫(yī)藥研究所

黃根單體對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和抑制作用及誘導(dǎo)其凋亡的影響*

楊增艷1趙湘培1柏春暉1韋金育2黃 鑫1

1.廣西民族醫(yī)藥研究院 (廣西 南寧， 530001) 2.廣西維康醫(yī)藥研究所

目的：研究黃根單體(HG2、HG3、HG4)對大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)增殖的抑制作用以及誘導(dǎo)其凋亡的影響。方法采用四甲噻唑藍(MTT)法檢測黃根單體對HSC-T6的增殖的抑制作用，并運用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果單體HG3可誘導(dǎo)HSC-6發(fā)生凋亡，對其增殖具有抑制作用，且具有劑量依賴性；而單體HG2和單體HG4對大鼠HSC-6表現(xiàn)出較弱的抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)論黃根的蒽醌類成分能抑制HSC-T6細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

黃根；單體；肝星狀細(xì)胞；增殖；抑制;凋亡

黃根來源于茜草科植物南山花PrismatomerisconnataY. Z. Ruan.的根，又名狗骨木、南山花、三角瓣花，是廣西特色壯藥材之一[1]。具有利濕退黃、強筋壯骨、祛瘀生新、涼血止血等功效，可用于風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、白血病、矽肺、貧血、牙齦出血、尿路感染等病的治療[2]。現(xiàn)代文獻報道，黃根的化學(xué)成分主要有1-羥基-2-甲基蒽醌、2-羥基-3-甲氧基蒽醌、1,3-二羥基-2-甲氧基蒽醌、2-甲基蒽醌、甲基異茜草素、甲基異茜草素-1-甲醚、虎刺醛和B-谷甾醇,在其葉中還含有熊果酸、B-sitosteryl-3-D-B-D-glucopyranoside[3～5]。

本課題組前期已發(fā)現(xiàn)黃根乙酸乙酯部位在體外能抑制大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)的增殖[6]；乙酸乙酯部位可降低肝纖維化大鼠的肝臟系數(shù)和AST水平，具有保肝護肝作用[7]。課題組進而對乙酸乙酯部位浸膏經(jīng)反復(fù)的硅膠柱色譜及Sephadex LH-20柱色譜進行分離純化，分離并鑒定了7個化合物，分別為東莨菪內(nèi)酯(HG2)、豆甾-4-烯-3-酮、去甲虎刺醛、2-羥甲基-3-羥基-9,10-蒽醌、甲基異茜草素-1-甲醚(HG3) 、甲基異茜草素(HG4)、胡蘿卜苷[8]。為進一步明確黃根抗肝纖維化的有效成分，課題組開展HG2、HG3和HG4三個單體化合物對大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)的增殖的抑制作用以及誘導(dǎo)其凋亡的研究。

1 材料與方法

1.1 受試化合物與提取 黃根采自廣西壯族自治區(qū)防城市，經(jīng)廣西民族醫(yī)藥研究院蘭日春副主任藥師鑒定為南山花的干燥根。60 kg黃根的根部用95%乙醇回流提取3次，每次 3小時，濃縮后得到浸膏 1200 g，加入適量的水使之充分溶解，水溶液依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓濃縮得石油醚萃取浸膏58 g、乙酸乙酯萃取浸膏 112g 和正丁醇萃取浸膏 200 g。將乙酸乙酯浸膏112 g，經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜，以石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫,收集各流分。Fr.2-3 經(jīng)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離純化得化合物HG2 (60mg), Fr.7-9 經(jīng)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜分離純化得化合物HG4(22 mg)，F(xiàn)r.11經(jīng)硅膠柱色譜分離純化得化合物 HG3(35mg)。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定，HG2為東莨菪內(nèi)酯，HG3為甲基異茜草素-1-甲醚，HG4為甲基異茜草素[8]。HG2、HG3、HG4均溶于DMSO中，給藥終濃度時DMSO不超過0.1%。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)、0.25%Trypsin(Gibco公司)、MTT(sigma公司)、FITC-labeled Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。FlexStation 3 微孔板檢測系統(tǒng)(Molecular Devices，美國)、CDX41倒置顯微鏡(Olympus,日本)、CJ820標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(蘇潔凈化設(shè)備廠，中國)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Binder，德國)、流式細(xì)胞儀(BD，美國)。

1.3 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) HSC-T6由北京市藥檢所提供，為SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSC，其表型為活化的HSC。細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶內(nèi)單層傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.4 MTT法檢測HSC-T6細(xì)胞增殖的抑制 取對數(shù)生長期的大鼠HSC-T6，接種96孔板中(細(xì)胞密度4×104cell/ml)，每孔100 μl，各給藥組設(shè)6個復(fù)孔。即空白對照組(含0.1%DMSO)、秋水仙堿組(Colchicine ，3 μg/ml)、HG2組(12.5、25、50、100、200 μg/ml)、HG3組(1.25、2.5、5、10、20 μg/ml)和HG4組(1.25、2.5、5、10、20 μg/ml)，此外，設(shè)立本底孔。處理48 h后，每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，平面混合后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后棄去各孔中的上清液，再加入100 μl DMSO，平面震蕩混勻10 min，待其各孔中的藍紫色甲瓚沉淀完全溶解后，置于酶標(biāo)儀下測定各孔中的OD值(λ554 nm，全波長掃描結(jié)果顯示554nm處OD值最大，故選554nm處所得值)，給藥組樣品OD值均需減去本底孔樣品OD值。按下面公式計算細(xì)胞增殖抑制率IR：IR(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5 HSC-T6細(xì)胞凋亡的檢測 取對數(shù)生長期的大鼠HSC-T6，接種96孔板中(細(xì)胞密度4×104cell/ml)，每孔2 ml，設(shè)空白對照組(含0.1%DMSO)、秋水仙堿組(3 μg/ml)、HG2(200 μg/ml)、HG3(20 μg/ml)、HG4(20 μg/ml)，處理48h后，胰酶消化，收集細(xì)胞并按照FITC-labeled Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒使用說明書處理，所有處理過的細(xì)胞均用流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組藥物對HSC-T6細(xì)胞增殖的抑制情況 與空白組比較，HG2給藥組和HG4給藥組的最高劑量對HSC-T6細(xì)胞的增殖有微弱的抑制作用，而HG3對HSC-T6細(xì)胞顯示出一定的細(xì)胞毒性，并且隨著藥物濃度的增加，HSC-T6的增殖活力下降，抑制作用增強，呈現(xiàn)劑量的依賴性。見表1、 表2、表3。

表1 各組藥物對HSC-T6增殖抑制比較

與空白對照組比較，△△P<0.01；與秋水仙堿陽性組比較，**P<0.01

表2 各組藥物對HSC-T6增殖抑制比較

與空白對照組比較，?P<0.05，??P<0.01；與秋水仙堿陽性組比較，**P<0.01

表3 各組藥物對HSC-T6增殖抑制比較

與空白對照組比較，??P<0.01；與秋水仙堿陽性組比較，**P<0.01

2.2 各組藥物誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡情況 見圖1。 從圖1可以看出， HG2和HG4給藥組出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞比例分別是7%和11.7%， HG3給藥組發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例達到28.6%。細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果與細(xì)胞增殖抑制實驗結(jié)果較為吻合。

圖1 各組藥物誘導(dǎo)(流式細(xì)胞術(shù))HSC-T6凋亡檢測圖

3 討論

肝纖維化是由于炎癥或損傷引起肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)增生，并過度沉積所造成肝細(xì)胞及其功能發(fā)生異常改變的病理變化。在這個變化過程中HSC發(fā)揮重要作用。在正常情況下，HSC位于竇周間隙，有儲藏維生素A的功能。當(dāng)肝臟慢性損傷發(fā)生時，HSC將從“靜止?fàn)顟B(tài)”轉(zhuǎn)為“激活狀態(tài)”，激活后的HSC發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能性改變，不再儲存維生素A，表達α-平滑肌肌動蛋白，并引起細(xì)胞外基質(zhì)過度增生和沉積。激活后的HSC具有收縮、原始炎癥和高增殖等特性[9]。因此，HSC的活化被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。近年來國內(nèi)外對抗肝纖維化的研究主要圍繞抑制HSC的增殖，誘導(dǎo)HSC凋亡，促進細(xì)胞外基質(zhì)降解方面進行[10]。

細(xì)胞凋亡是指維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主地有序性死亡，是多細(xì)胞有機體在細(xì)胞分化發(fā)育中及在各種生理、病理條件下起重要作用的一種調(diào)節(jié)適應(yīng)過程。它是細(xì)胞死亡的一種形式，但與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等方面，是一種主動行為過程[11]?；罨蟮腍SC發(fā)生凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)生成減少，降解增加，有利于肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。因此，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡對抗肝纖維化具有積極意義。

本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，對黃根中的東莨菪內(nèi)酯、甲基異茜草素-1-甲醚和甲基異茜草素進行細(xì)胞實驗研究，發(fā)現(xiàn)：①黃根中的甲基異茜草素-1-甲醚(HG3)可抑制大鼠HSC的增殖，也能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其作用大小與劑量正呈相關(guān)性；②黃根中的東莨菪內(nèi)酯(HG2)、甲基異茜草素(HG4)無論是抑制HSC增殖還是誘導(dǎo)其凋亡均表現(xiàn)出較弱的作用。

綜上所述，黃根的蒽醌類成份抗肝纖維化作用機制應(yīng)與其能抑制HSC增殖并誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)。通過抑制作用和誘導(dǎo)其凋亡，進而減少細(xì)胞外基質(zhì)在肝組織內(nèi)沉積，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

[1] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1992:83.

[2] 梁啟成,鐘鳴.中國壯藥學(xué)[M].南寧:廣西民族醫(yī)藥出版社,2005：382-383.

[3] 姜建雙,馮子明,張培成. 黃根化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志,2005,30(22):1751-1753.

[4] 屠殿君,龐祖煥,閉寧基.黃根化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報,1981,16(8):631-634.

[5 ] Dey SK, Islam Sadequl, Mostafa M. Some secondarymetabolites from cytotoxic extract of Prismatomeris tetran-dra[J]. Journal of the Bangladesh Chemical Society ,2003,16(1):22～27.

[6] 楊增艷,趙湘培,韋金育.黃根提取物對肝星狀細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)的影響[J]．時珍國醫(yī)國藥,2014,25(3):519-521.

[7] 楊增艷,柏春輝,張青青.黃根抗肝纖維化作用有效部位篩選研究[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志, 2015, 25(5):284-286.

[8] 張穎,楊增艷,李嘉,等.黃根抗肝纖維化活性部位的化學(xué)成分研究[J].中國新藥雜志,2016;25(24):119-121.

[9] 牛建昭，賁長恩。器官纖維化基礎(chǔ)及中醫(yī)藥防治[M].北京，人民衛(wèi)生出版社，2008:1-207.

[10] 張緒富 , 呂志平 , 劉曉燕 . 以肝星狀細(xì)胞為靶標(biāo)的抗肝纖維化治療進展[J]. 中國藥理學(xué)通報 , 2003, 19(6)： 622-626.

[11] Negri C,Donzelli M,Bernardi R,etal.Multiparametric staining to identify apoptotic human cells[J]. Exp Cell Res,1997,234(1):174.

EffectofPrismatomerisconnataY.Z.Ruan.MonomersontheProliferationapoptosisinRatHepaticStellateCell

YANGZeng-yan1,ZHAOXiang-pei1,BAIChun-hui1,etal. 1.GuangxiNationalMedicalResearchInstitute(NanningGuangxi, 530001)China

Objective:To investigate the effects of Prismatomeris connata Y. Z. Ruan. Monomers on Rat Hepatic Stellate Cell (HSC-T6).MethodsMTT assay was used to evaluate the inhibitory effect of the drugs on HSC-T6 , flow cytometry were applied to measure the cell apoptosis.ResultsHG3 not only could inhibit proliferation of HSC-T6 cells in concentration manners,but also could induce apoptosis of HSC-T6 cells. HG2 and HG4 showed a slight effect on the Proliferation apoptosis in Rat Hepatic Stellate Cell.ConclusionThe Prismatomeris connata Y. Z. Ruan. Monomers can inhibit the proliferation of HSC-T6 cells and induce apoptosis, wihch show the therapeutical effects on hepatic fibrosis.

Prismatomeris connata Y. Z. Ruan.; Monomers ;hepatic stellate cells; Proliferation； inhibition; Apoptosis

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.012

國家自然科學(xué)基金課題(No.81260683)

2017-03-27 編輯：韋 怡)