魏之瑤，姚廷彥, 陳德鑫 綜述 嚴(yán) 俊 審校

多光子效應(yīng)是指一個(gè)熒光分子同時(shí)吸收多個(gè)頻率相同的非線性光子，到達(dá)高能激發(fā)態(tài)后弛豫到基態(tài)，發(fā)射出波長較短的光子的現(xiàn)象[1]。利用成像目標(biāo)的自體熒光和二次諧波，多光子成像技術(shù)可原位實(shí)時(shí)獲取細(xì)胞形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)等診斷信息。該技術(shù)穿透力強(qiáng)、分辨率高、光毒性小且無需對(duì)組織固定或染色[2]，是一種有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值的光學(xué)活檢技術(shù)。而如何將多光子成像設(shè)備在保證穩(wěn)定性和成像質(zhì)量的前提下進(jìn)行小型化以適應(yīng)臨床應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)。不論哪一種形式的多光子在體內(nèi)窺鏡均需要傳輸光纖、掃描器和聚焦物鏡這三種結(jié)構(gòu)。該文主要從這三個(gè)方面對(duì)多光子內(nèi)窺鏡的研發(fā)進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)不同類型在體設(shè)備的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望進(jìn)行闡述。

1 光纖

光纖柔軟而纖細(xì)，常被用于各類通訊及圖像傳輸系統(tǒng)。光纖可實(shí)現(xiàn)激發(fā)光的遠(yuǎn)距離傳遞和多光子信號(hào)的搜集，借此可將笨重的激光器與內(nèi)窺鏡本身分開，使內(nèi)窺鏡的小型化和便攜化成為可能。

光子晶體光纖(photonic crystal fiber, PCF)由纖芯和內(nèi)含有序排列的氣柱的包層組成，已被證實(shí)可傳遞100 fs的脈沖并給予多光子顯微鏡或內(nèi)窺鏡超出成像所需的激發(fā)功率[3]。PCF分為有效折射率型光子晶體光纖和帶隙波導(dǎo)型光子晶體光纖(photonic bandgap fiber, PBF)。PBF利用包層內(nèi)氣柱的周期性結(jié)構(gòu)構(gòu)建出光子帶隙結(jié)構(gòu)，而纖芯的存在破壞了結(jié)構(gòu)的周期性，從而在光子晶體中引入一個(gè)窄頻缺陷態(tài)。頻率位于缺陷態(tài)的光子一旦離開缺陷位置就會(huì)導(dǎo)致光的迅速衰減，以此實(shí)現(xiàn)光的高效傳遞。不同于正色散的傳統(tǒng)光纖，PCF有反常色散的特性。故在傳遞特定波長的光時(shí)PCF可與正色散與之相對(duì)應(yīng)的傳統(tǒng)光纖相耦合以實(shí)現(xiàn)零色散傳輸。Wu et al[4]運(yùn)用此原理，在PCF末端安裝了長為300 μm、纖徑和數(shù)值孔徑(numerical aperture，NA)與PCF內(nèi)包層相同的多模光纖，實(shí)現(xiàn)了激發(fā)光的零色散傳遞。

PCF的結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比普通光纖復(fù)雜，結(jié)構(gòu)可為雙包層、三包層甚至多包層。在眾多多光子內(nèi)窺鏡設(shè)計(jì)中，雙包層光子晶體光纖(double-clad photonic crystal fiber，DCPCF)最為常用。DCPCF本質(zhì)上包含了兩種光纖，可在傳遞激發(fā)光的同時(shí)搜集多光子信號(hào)。大直徑的纖芯適用于近紅外激發(fā)光的單模傳輸，但較小的NA限制了纖芯的多光子信號(hào)搜集能力。當(dāng)纖芯與內(nèi)包層一起充當(dāng)了芯徑大、NA大的多模熒光搜集光纖的纖芯時(shí)，高效的多光子信號(hào)收集得以實(shí)現(xiàn)。多光子信號(hào)在內(nèi)包層區(qū)域的全反射傳遞使之可被放大兩個(gè)數(shù)量級(jí)，大大增加了系統(tǒng)的信號(hào)探測效率。不過DCPCF需要配有預(yù)啁啾單元以補(bǔ)償色散，一般使用的是光柵對(duì)、透鏡或是二者的結(jié)合。

Rivera et al[5]將三個(gè)軸向偏置的DCPCF平行放置，報(bào)道了第一個(gè)有軸向平行成像能力的空間多路復(fù)用多光子內(nèi)窺鏡。DCPCF的長度為1 m，芯-芯間距為125 μm。雙光子圖像的橫向和軸向分辨率分別為0.8 μm和10 μm。可同時(shí)從軸向相隔≥4.8 μm的三個(gè)不同深度的平面獲得多光子圖像，為多光子三維成像提供了新思路。

2 掃描器

光纖可以將激發(fā)光從遠(yuǎn)處傳輸?shù)皆O(shè)定好的焦點(diǎn)，然而二維乃至三維成像的實(shí)現(xiàn)需依靠掃描器。內(nèi)窺鏡的小型化要求掃描器在小尺寸的前提下盡可能實(shí)現(xiàn)高速掃描。

2.1光纖掃描器光纖掃描器一般位于光纖末端。其中一種設(shè)計(jì)是利用壓電或電磁執(zhí)行器直接驅(qū)動(dòng)光纖末端進(jìn)行機(jī)械共振，但離軸像差會(huì)限制圖像分辨率。Helmchen et al[6]設(shè)計(jì)的掃描器利用壓電馬達(dá)偏轉(zhuǎn)光纖末端，以實(shí)現(xiàn)李薩如(lissajous)模式的二維掃描。該馬達(dá)被兩種共振頻率的電壓信號(hào)所控制，且需要引入斜撐以實(shí)現(xiàn)李薩如掃描所需必須的空間各向異性。一些團(tuán)隊(duì)引入與光纖和透鏡相連接的共振懸臂以進(jìn)行改良，但引入新元件會(huì)增加探頭體積且需要裝配功率更大的馬達(dá)。懸臂光纖掃描器最常用的驅(qū)動(dòng)是管狀壓電執(zhí)行器 ，掃描模式多為螺旋或光柵。Myaing et al[7]設(shè)計(jì)了一個(gè)可實(shí)時(shí)成像的雙光子激光掃描光纖內(nèi)窺鏡。掃描器包括共振懸臂和管狀壓電執(zhí)行器。壓電管的被分成了四個(gè)象限，形成了兩對(duì)驅(qū)動(dòng)電極(±x和±y)。通過轉(zhuǎn)換三角或正弦波形可調(diào)制驅(qū)動(dòng)電壓，以此實(shí)現(xiàn)螺旋掃描模式。不同于李薩如模式的光纖掃描器，螺旋掃描器不需要為了打破空間對(duì)稱性而在光纖上添加額外元件。該探頭掃描直徑約為120～220 μm。更佳的空間掃描模式和均勻的像素駐留時(shí)間使光柵掃描優(yōu)于旋轉(zhuǎn)掃描模式和李薩如掃描模式。Rivera et al[8]在多光子成像設(shè)計(jì)中使用了小型化的諧振/非諧振懸臂光纖光柵掃描器，二維成像的視野為110 μm×110 μm，速度為4.1 fps(512×512像素)。這個(gè)掃描器的尺寸非常小(寬度/厚度≤1 mm，總長度≈2.6 cm)，可實(shí)現(xiàn)≥650 μm的光纖末端撓度。

2.2微機(jī)電系統(tǒng)掃描器微機(jī)電系統(tǒng)(microelectromechanical systems, MEMS)掃描器尺寸小，速度快，功耗低且微光束處理能力強(qiáng)，是小型多光子內(nèi)窺鏡的首選掃描器之一。但其生產(chǎn)工藝復(fù)雜，造價(jià)高昂，難以量產(chǎn)。雖然MEMS掃描器的自身尺寸很小，但需要的執(zhí)行器尺寸較大。壓電馬達(dá)或電磁馬達(dá)只能提供前向旋轉(zhuǎn)掃描模式或李薩如掃描模式。而對(duì)于胃腸道等臨床應(yīng)用目標(biāo)，側(cè)向圓周掃描模式顯然更為實(shí)用。Liu et al[9]設(shè)計(jì)了一個(gè)旋轉(zhuǎn)的多光子顯微鏡探頭，所采用的MEMS掃描鏡可以提供側(cè)向的雙軸掃描。DCPCF傳輸來的激發(fā)光通過梯度折射率(gradient index，GRIN)透鏡后被直角微棱鏡反射。MEMS馬達(dá)直徑為2.2 mm，支持360°全景旋轉(zhuǎn)掃描。該旋轉(zhuǎn)馬達(dá)的馬達(dá)控制器被外裝，以實(shí)現(xiàn)探頭的小型化。在帶動(dòng)著微棱鏡的情況下，馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)速度可以達(dá)到300 r/min，足以實(shí)現(xiàn)腔道內(nèi)成像。

3 物鏡

除了光纖和掃描器，多光子內(nèi)窺鏡還需要利用物鏡來將激發(fā)光聚焦在目標(biāo)平面上。傳統(tǒng)顯微鏡物鏡可提供高分辨率成像，但過大的體積使之不適用于力求小型化的多光子在體內(nèi)窺鏡。內(nèi)窺鏡需要的是可保證一定成像能力的微型物鏡。GRIN透鏡易加工且耦合效率高，亞毫米級(jí)別的尺寸和低廉的造價(jià)使之成為多光子內(nèi)窺鏡最常用的物鏡之一。

3.1GRIN透鏡GRIN透鏡的介質(zhì)是非均質(zhì)的，可通過調(diào)整玻璃摻雜劑的濃度實(shí)現(xiàn)特定的折射率分布[10]：

[n(r)]2=[n(0)]2[1-(ar)2]

n(0)是中心處的折射率，a為折射率梯度分布常量，r是到中心軸的距離。不同于利用曲面來折射光線的傳統(tǒng)透鏡，GRIN透鏡的光束傳播路徑是曲線的。與其他微透鏡相比，GRIN透鏡可以提供更好的成像質(zhì)量，且糾正像差后成像質(zhì)量仍有較大的提升空間[4]，但在體應(yīng)用時(shí)運(yùn)動(dòng)偽影仍是需待解決的問題。

Barretto et al[11]利用了高NA(數(shù)值孔徑，前文已加上中英文名稱)平-凸物鏡報(bào)道了一種GRIN透鏡的像差糾正成像設(shè)計(jì)，可使信號(hào)收集能力提至普通GRIN透鏡的兩倍。該平-凸物鏡由小型商用球形透鏡切割而成，平-凸物鏡在光軸上引入的球面像差可被折射率分布與之相匹配的GRIN透鏡消除。這種物鏡系統(tǒng)的分辨率(橫向1.0±0.2 μm，軸向4.4±0.2 μm)可以與商用水浸物鏡相媲美。與上述設(shè)計(jì)相比，Murray et al[12]設(shè)計(jì)的方案體積更小且易于組裝。該方案由GRIN透鏡、蓋玻片和物鏡矯正環(huán)組成。蓋玻片可補(bǔ)償GRIN透鏡的像差，物鏡的矯正環(huán)則用于再平衡蓋玻片可能造成的過補(bǔ)償。該系統(tǒng)的橫向分辨率(1 μm)和軸向分辨率(15 μm)分別是普通復(fù)合GRIN透鏡的2倍和3倍，視場(150 μm)的提高超過了3倍。

3.2復(fù)合透鏡復(fù)合透鏡的系統(tǒng)設(shè)計(jì)則包括了用于平行化光線的準(zhǔn)直鏡和用于聚焦的物鏡。將光束平行化可防止入射光被分散，也予以透鏡間距一定的可調(diào)性，可根據(jù)掃描系統(tǒng)和標(biāo)本位置進(jìn)行優(yōu)化。

Zhao et al[13]設(shè)計(jì)的物鏡系統(tǒng)由3個(gè)直徑均為2 mm的消色差透鏡組成。準(zhǔn)直透鏡焦距為6 mm，物鏡由一對(duì)水平面相貼、焦距均為3 mm的GRIN透鏡構(gòu)成。光纖尖端和準(zhǔn)直透鏡之間的距離固定為6 mm，準(zhǔn)直透鏡與GRIN透鏡對(duì)之間的距離可調(diào)。與單獨(dú)使用GRIN透鏡相比，該方案可以使熒光信號(hào)級(jí)提高6～20倍。在另一個(gè)原理相同的透鏡設(shè)計(jì)中[14]，GRIN透鏡被用作準(zhǔn)直透鏡，物鏡則是一個(gè)非曲面透鏡。探頭的外直徑為1 cm，長度為14 cm，分辨率為2 μm，視場可達(dá)200 μm。

Liu et al[15]設(shè)計(jì)的探頭除了準(zhǔn)直透鏡和聚焦透鏡，還添加了用于擴(kuò)束的中繼透鏡。該準(zhǔn)直透鏡的焦距為18 mm，準(zhǔn)直后的平行光束直徑約為1.8 mm。中繼透鏡包括一個(gè)焦距為30 mm的掃描透鏡和焦距為50 mm的管狀透鏡。這兩個(gè)透鏡排列形成的擴(kuò)束器放大倍數(shù)為1.67。封裝后的整個(gè)透鏡系統(tǒng)直徑為16 mm。

4 現(xiàn)狀與展望

目前已有多個(gè)團(tuán)隊(duì)在進(jìn)行多光子臨床應(yīng)用的研究。有些已進(jìn)行了動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)，有些已利用患者離體標(biāo)本構(gòu)建了診斷模型。多光子的臨床應(yīng)用形式主要集中在硬式針狀微內(nèi)窺鏡、軟式內(nèi)窺鏡、硬式探頭和腹腔鏡式內(nèi)窺鏡上。其中，硬式針狀微內(nèi)窺鏡已在皮膚學(xué)癌癥診斷領(lǐng)域中實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，并在臨床被例行應(yīng)用[16]。硬式針狀微內(nèi)窺鏡以微創(chuàng)方式對(duì)近體表組織進(jìn)行成像，只留下針孔大小的傷口。Dimitrow et al[17]對(duì)83個(gè)黑色素瘤患者的皮膚病變組織分別進(jìn)行了在體和離體的雙光子成像，并根據(jù)黑色素瘤的組織學(xué)特點(diǎn)建立了用于區(qū)分良性痣和黑色素瘤的診斷模型。該模型在體診斷的敏感性為75%，特異性為80%。

軟式內(nèi)窺鏡是多光子成像技術(shù)與傳統(tǒng)消化道內(nèi)窺鏡的結(jié)合，可對(duì)消化道黏膜面進(jìn)行成像?？梢刹∽兛芍苯釉趦?nèi)鏡下得到原位實(shí)時(shí)的組織學(xué)確診，有望用于原位癌的診斷和腫瘤分期。目前尚無多光子軟式內(nèi)窺鏡實(shí)現(xiàn)動(dòng)物或患者在體應(yīng)用的報(bào)道，但已有團(tuán)隊(duì)利用多光子顯微鏡對(duì)患者的結(jié)直腸黏液腺癌離體新鮮標(biāo)本的黏膜面進(jìn)行了成像[18]，證明了多光子內(nèi)窺鏡代替?zhèn)鹘y(tǒng)病理活檢用于診斷消化道疾病的可行性。

硬式探頭形式的多光子內(nèi)窺鏡可用于器官組織表面的原位實(shí)時(shí)成像且已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。Huland et al[19]利用長度為8 cm的復(fù)合GRIN透鏡系統(tǒng)和可快速移動(dòng)的機(jī)械臂制造了一個(gè)可對(duì)深處組織進(jìn)行多光子在體成像的便攜硬式內(nèi)鏡系統(tǒng)，并用其對(duì)活鼠的肝、腎和結(jié)腸內(nèi)面(黏膜面)進(jìn)行了成像。硬式探頭還可在術(shù)中對(duì)手術(shù)切緣進(jìn)行成像。Yan et al[20]對(duì)新鮮的低位直腸癌手術(shù)切緣進(jìn)行了全層多光子成像，并與HE染色的病理結(jié)果進(jìn)行了分析對(duì)比，展現(xiàn)了多光子成像用于術(shù)中原位實(shí)時(shí)判斷手術(shù)切緣殘留與否的前景。

腹腔鏡式內(nèi)窺鏡是多光子顯微鏡和傳統(tǒng)腹腔鏡的結(jié)合，可用于胃腸道漿膜面和腹膜等腹腔內(nèi)組織器官的成像，可實(shí)時(shí)判斷腫瘤有無侵犯漿膜面及腹膜，對(duì)腫瘤精確的術(shù)前分期、預(yù)后判斷和術(shù)式選擇有著重要意義。已有團(tuán)隊(duì)利用患者突破及未突破漿膜層的胃癌離體新鮮標(biāo)本的漿膜面進(jìn)行了多光子成像且構(gòu)建出了診斷模型[21]。他們利用多光子成像對(duì)腫瘤進(jìn)行了T分期，識(shí)別T4期胃癌的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別可達(dá)90%、96.67%和93.33%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基于超聲內(nèi)鏡的術(shù)前T分期。也有團(tuán)隊(duì)利用腹腔鏡式多光子內(nèi)窺鏡對(duì)小鼠的癌變卵巢和纖維化腎臟進(jìn)行了在體成像[22-23]。

除上文提及的成果外，目前亦有團(tuán)隊(duì)對(duì)患者的膀胱癌、前列腺癌的離體新鮮標(biāo)本進(jìn)行了多光子成像[24-24]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的口腔、乳腺也實(shí)現(xiàn)了在體成像[26-27]，但直接對(duì)患者進(jìn)行的在體成像極少。目前為止，絕大多數(shù)的臨床前研究集中在雙光子上。Horton et al[28]對(duì)小鼠大腦進(jìn)行了三光子在體原位成像，成像深度可達(dá)1 mm，展現(xiàn)了三光子成像的誘人前景。上述團(tuán)隊(duì)的研究均已證明了多光子內(nèi)窺鏡是一種高效安全的原位實(shí)時(shí)光學(xué)活檢技術(shù)，有望在不遠(yuǎn)的將來全面走上臨床，在早癌診斷、術(shù)中切緣檢驗(yàn)和腫瘤分期等方面發(fā)揮巨大作用?，F(xiàn)該領(lǐng)域急待臨床及臨床前研究的繼續(xù)推進(jìn)以最終實(shí)現(xiàn)全方面的應(yīng)用。各類成熟的微型化內(nèi)窺鏡進(jìn)一步的調(diào)試研發(fā)勢必會(huì)加速這一進(jìn)程。

5 總結(jié)

多光子成像技術(shù)是最具潛能的光學(xué)活檢技術(shù)之一。上述元件的設(shè)計(jì)與應(yīng)用使多光子內(nèi)窺鏡系統(tǒng)體積更小、成像質(zhì)量更高且穩(wěn)定性更好，為多光子成像的臨床應(yīng)用予以了重要保證。隨著微型元器件設(shè)計(jì)和制造工藝的不斷發(fā)展，未來更為成熟的小型多光子內(nèi)窺鏡必定會(huì)出現(xiàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及利用患者離體標(biāo)本構(gòu)建診斷模型的進(jìn)程也在不斷被推進(jìn)。綜上，多光子內(nèi)窺鏡有望在不遠(yuǎn)的將來全面走上臨床，在早癌診斷、術(shù)中切緣檢驗(yàn)和腫瘤分期等方面發(fā)揮巨大作用。