王寶枝 汪軍 彭和平 丁榆 胡旭中

cFLIP基因沉默對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠的治療作用及其機(jī)制

王寶枝 汪軍 彭和平 丁榆 胡旭中

目的通過尾靜脈注射cFLIP-siRNA治療急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察療效，探討其相關(guān)機(jī)制。方法設(shè)計(jì)并合成3對(duì)靶向cFLIP 基因的siRNA(cFLIP-siRNA)及陰性對(duì)照siRNA(siRNA-NC)，篩選抑制cFLIP 基因表達(dá)能力最強(qiáng)的siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。30只SD大鼠采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c鹽溶液方法建立ANP模型，按數(shù)字表法隨機(jī)分為ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA組，每組10只，分別于尾靜脈注射等容積生理鹽水、siRNA-NC、cFLIP-siRNA。24 h后處死大鼠，取血檢測(cè)血清淀粉酶、內(nèi)毒素水平，取胰腺組織，常規(guī)行病理學(xué)檢查，采用免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺組織cFLIP-S、caspase-8蛋白表達(dá)。結(jié)果ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA 組大鼠血清淀粉酶水平分別為(1 286±209)、(1 297±305)、(552±256)U/L，內(nèi)毒素為(136±32)、(128±56)、(46±23)ng/L，胰腺病理評(píng)分為(4.97±1.16)、(4.92±2.03)、(1.67±1.98)分，cFLIP-S蛋白表達(dá)量為8.56±2.72、9.12±2.45、3.82±1.46，cFLIP-siRNA 組顯著低于ANP組及siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。3組caspase-8蛋白表達(dá)量分別為2.25±1.24、2.41±1.14、5.56±1.79，cFLIP-siRNA組顯著高于ANP組及siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。而ANP組與siRNA-NC組間各項(xiàng)指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論抑制cFLIP基因表達(dá)可減輕ANP大鼠胰腺的損傷，其機(jī)制可能是通過上調(diào)caspase-8表達(dá)抑制胰腺細(xì)胞壞死，促進(jìn)細(xì)胞凋亡所致。

胰腺炎，急性壞死性； RNA，小分子干擾； 細(xì)胞凋亡； cFLIP基因

重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病中有兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，即胰腺組織壞死引起胰腺消化酶釋放和全身炎性反應(yīng)綜合征，如果能夠有效抑制這兩個(gè)環(huán)節(jié)的進(jìn)展，將會(huì)非常有效地控制SAP進(jìn)展至終末期的各器官損傷[1-3]。cFLIP也稱細(xì)胞型含死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(cellular Fas associated protein with death domain-like interleukin-1β converting enzyme inhibitor protein, cFLIP)，是天然存在的胱冬蛋白酶(caspase)抑制蛋白。cFLIP有cFLIP-L與cFLIP-S兩種單體亞型，均在炎癥中參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、壞死[1-2]。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織cFLIP-S mRNA表達(dá)，觀察其對(duì)ANP胰腺損傷的影響，初步探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、靶向cFLIP siRNA的構(gòu)建及篩選

參照GeneBank cFLIP mRNA的序列及siRNA的設(shè)計(jì)原理，由Ambion公司設(shè)計(jì)并合成3條靶向cFLIP基因不同位點(diǎn)的siRNA(cFLIP-siRNA)及無同源性的陰性對(duì)照siRNA(siRNA-NC)。設(shè)計(jì)原則：siRNA分子的長度為21～23 bp；序列在起始密碼子ATG 70～100 bp之后，GC含量低，避開mRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。siRNA1正義序列5′-GGCUGAUUCUGGAAGUUCUtt-3′，反義序列5′- AGAACUUCCAGAAUCAGCCtg-3′；siRNA2正義序列5′- CCAGUACCCUGAUGCUACAtt-3′，反義序列5′-UGUAGCAUCAGGGUACUGGat-3′；siRNA3正義序列5′-GCAUCUUCUGAGCAAUUACtt-3′，反義序列5′- AAUUGACCUCAGAGAUGCGtg-3′；siRNA-NC正義序列5′-CACUGAUCGUUCAUAGCCAtt-3′，反義序列5′-GGUCAAGAUGCGACAUUUGat-3′。取9只雄性清潔級(jí)健康SD大鼠(廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為3組，每組3只，分別經(jīng)尾靜脈注射1對(duì)cFLIP-siRNA，注射后72 h處死大鼠，取胰腺組織，采用RT-PCR方法檢測(cè)cFLIP mRNA表達(dá)。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性清潔級(jí)健康SD大鼠30只，體重250～300 g，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。按數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為ANP組、siRNA-NC 組、cFLIP-siRNA組。采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c鹽(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備ANP模型。siRNA-NC組、cFLIP-siRNA組分別經(jīng)尾靜脈注射1 nmol/μl siRNA-NC或cFLIP-siRNA 100 μl(5 mg/kg體重)。術(shù)后于背部皮下分點(diǎn)注射無菌生理鹽水(2 ml/100 g體重)以補(bǔ)充術(shù)中丟失的體液。術(shù)后禁食，不禁水。術(shù)后48 h于心臟采血5 ml，離心留取血清，置-80℃保存。取胰腺組織部分置4%甲醛固定，部分置液氮冷凍。

三、觀察指標(biāo)

1．血清淀粉酶、內(nèi)毒素水平檢測(cè)：采用碘比色法檢測(cè)血清淀粉酶活性，基質(zhì)偶氮顯色鱟法檢測(cè)內(nèi)毒素水平。

2．胰腺組織病理學(xué)檢查：取甲醛固定的胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色觀察組織病理學(xué)改變，雙盲法按Gukovshaya等[6]的標(biāo)準(zhǔn)從水腫、壞死、出血、鈣化4方面進(jìn)行病理評(píng)分。水腫評(píng)分：無水腫，0分；葉間局灶性水腫，0.5分；葉間彌漫性水腫，1分。脂肪壞死評(píng)分：無脂肪壞死，0分；胰腺周圍或葉間局灶性脂肪壞死，0.5分；彌漫性脂肪壞死，1分。胰腺腺泡壞死評(píng)分：無腺胞壞死，0分；小葉邊緣或葉間10%腺胞壞死，0.5分；小葉外緣10%～30%腺胞壞死，1分；小葉融合壞死<30%， 1.5分；融合壞死30%～50%，2分；融合壞死>50%，2.5分；微小膿腫形成，3分。出血評(píng)分：無出血，0分；充血及葉間或葉內(nèi)局灶性出血，1分；多點(diǎn)彌漫性出血，1.5分；血管纖維素樣壞死或血栓形成，2分。鈣化評(píng)分：無鈣化，0分；局灶存在于脂肪或腺泡壞死區(qū)域，0.5分；彌漫性存在于脂肪或腺泡壞死區(qū)域，1分。4項(xiàng)評(píng)分相加為最后評(píng)分。

3．胰腺組織cFLIP-S及caspase-8蛋白表達(dá)檢測(cè)：取胰腺組織切片，采用免疫組織化學(xué)染色觀察胰腺組織cFLIP-S及caspase-8的表達(dá)。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野(×40)，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像處理分析軟件掃描，以積分吸光值(IOD)表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

取液氮保存的胰腺組織，用裂解液制備組織勻漿，應(yīng)用Pierce BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)及紫外分光光度法定量蛋白后，采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺組織cFLIP-S及caspase-8表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參?？筩FLIP單抗購自美國Santa Cruz公司，抗caspase-8多抗購自美國Biowold公司。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影，圖像分析軟件掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示相對(duì)表達(dá)量。

4．胰腺組織cFLIP mRNA表達(dá)檢測(cè)：取凍存胰腺組織，用Trizol試劑盒提取胰腺組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。按照RT-PCR試劑盒取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后以Sybr Green作為熒光標(biāo)記物，在ABI 7500 Real Time PCR System中進(jìn)行PCR反應(yīng)，cFLIP上游引物為5′-GGCGGCCATTCTCATCTTCTCGG-3′，下游引物為5′-ACCTCGGCAGACACAGGGCT-3′；GAPDH作為內(nèi)參，上游引物為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物為5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、cFLIP-siRNA篩選

注射cFLIP-siRNA1的3只大鼠胰腺組織cFLIP mRNA表達(dá)抑制率分別為0.28、0.25、0.42，注射cFLIP-siRNA2的表達(dá)抑制率為0.36、0.66、0.56，注射cFLIP-siRNA3的表達(dá)抑制率為0.31、0.29、0.38，故選擇cFLIP-siRNA2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

二、血清淀粉酶、內(nèi)毒素水平變化

ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA 組大鼠血清淀粉酶水平分別為(1 286±209)、(1 297±305)、(552±256)U/L，內(nèi)毒素水平為(136±32)、(128±56)、(46±23)ng/L，cFLIP-siRNA組較ANP組及siRNA-NC組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.687，P=0.001，t=5.401，P=0.009；t=4.618，P=0.016，t=5.591，P=0.006)，而ANP組與siRNA-NC組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.197，P=0.279；t=0.637，P=0.198)。

三、胰腺組織病理改變

ANP組大鼠腹腔內(nèi)出血，胰腺充血水腫，表面出血、壞死，可見明顯皂化斑。鏡下見大鼠胰腺腺泡變性、灶狀或片狀壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤，胰周脂肪組織壞死、胰腺間質(zhì)血管擴(kuò)張充血或出血。siRNA-NC組大鼠的變化與ANP組基本相似。cFLIP-siRNA組大鼠胰腺病理損傷程度較ANP組及siRNA-NC組明顯減輕(圖1)。ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA組胰腺病理評(píng)分分別為(4.97±1.16)、(4.92±2.03)、(1.67±1.98)分，cFLIP-siRNA 組顯著低于ANP組及siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.687，P=0.016；t=3.156，P=0.021)，而ANP組與siRNA-NC組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.125，P=0.248)。

四、胰腺組織cFLIP-S、caspase-8蛋白表達(dá)變化

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)，ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA 組cFLIP-S蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為8.56±2.72、9.12±2.45、3.82±1.46，cFLIP-siRNA組的表達(dá)量較ANP組及siRNA-NC組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.021，P=0.002；t=3.783，P=0.019)。caspase-8蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.25±1.24、2.41±1.14、5.56±1.79，cFLIP-siRNA組較ANP組及siRNA-NC組顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.687，P=0.011；t=-5.487，P=0.006)。而ANP組與siRNA-N組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.017，P=0.139；t=1.126，P=0.038)(圖2)。

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)，ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA組cFLIP-S蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為524.56±56.72、539.12±28.45、221.82±89.46，cFLIP-siRNA組的表達(dá)量較ANP組及siRNA-NC組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.126，P=0.019；t=6.106，P=0.015)；caspase-8蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為216.25±56.24、209.41±52.14、 489.56±38.79，cFLIP-siRNA組較ANP組及siRNA-NC組顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.636，P=0.013；t=6.021，P=0.008)。而ANP組與siRNA-NC組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.106，P=0.084；t=0.982，P=0.079)(圖3)。

圖1 ANP組(1A)、siRNA-NC組(1B)、cFLIP-siRNA組(1C)胰腺組織病理改變(HE ×200)

圖2 ANP組(2A)、siRNA-NC組(2B)、cFLIP-siRNA 組(2C)大鼠胰腺cFLIP-S(上)、caspase-8(下)蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×400)

討 論

胰腺腺泡細(xì)胞死亡包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死兩種方式。細(xì)胞壞死與凋亡并非完全對(duì)立，而是在一定條件下相互轉(zhuǎn)化。細(xì)胞死亡是決定急性胰腺炎(AP)病程及預(yù)后的重要因素，AP患者的病情嚴(yán)重程度與腺泡細(xì)胞凋亡程度呈負(fù)相關(guān)，與腺泡細(xì)胞壞死程度呈正相關(guān)[2]。研究表明，腺泡細(xì)胞凋亡可能是AP發(fā)生后對(duì)機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，cFLIP-siRNA組大鼠的腹腔內(nèi)出血量減少，胰腺出血壞死較輕，組織病理評(píng)分明顯降低，表明抑制cFLIP表達(dá)可減輕ANP大鼠的胰腺細(xì)胞壞死程度。cFLIP-siRNA組大鼠血清淀粉酶及內(nèi)毒素水平下降也支持抑制cFLIP表達(dá)對(duì)ANP的進(jìn)展有保護(hù)作用。

圖3 ANP組(1)、siRNA-NC組(2)、cFLIP-siRNA 組(3)胰腺組織cFLIP-S及caspase-8蛋白表達(dá)

Caspase-8是一種凋亡相關(guān)蛋白，其活化狀態(tài)可誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞發(fā)生凋亡。正常情況下死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中cFLIP與caspase-8前體形成異源二聚體，進(jìn)而阻止caspase-8前體活化，抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞存活狀態(tài)[1，3]。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，通過TNF-α受體介異的細(xì)胞壞死信號(hào)通路，cFLIP-S與caspase-8前體FADD形成復(fù)合體，激活RIPK1形成RIPK1-RIPK3-MLKL復(fù)合體，抑制caspase-8活化，促發(fā)細(xì)胞壞死的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1，4]。Gunther等[5]報(bào)道，正?；啬c上皮細(xì)胞不發(fā)生壞死，但TNF-α可致caspase-8 缺乏的回腸上皮細(xì)胞發(fā)生壞死，而這種壞死可被特異性TNF-α壞死通路抑制劑Nec-1 所抑制。Gukovskaya等[6]報(bào)道，大劑量的膽囊收縮素可致大鼠發(fā)生水腫型胰腺炎，并觀察到caspase-8的激活，當(dāng)特異性抑制caspase-8活化時(shí)，大鼠胰腺中壞死的腺泡細(xì)胞明顯增多，凋亡細(xì)胞明顯減少，提示AP時(shí)caspase-8減少可能與腺泡細(xì)胞壞死相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，抑制cFLIP 基因表達(dá)后胰腺組織caspase8表達(dá)明顯增強(qiáng)，并主要以活性形式存在，推測(cè)cFLIP-siRNA可能通過上調(diào)caspase-8的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)AP時(shí)胰腺細(xì)胞從壞死轉(zhuǎn)向凋亡，從而減輕AP病變程度。

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TherapeuticeffectsofcFLIPgenesilencingonacutenecrotizingpancreatitisratsanditsmechanism

WangBaozhi,WangJun,PengHeping,DingYu,HuXuzhong.

DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511447,China

WangBaozhi,Email: 565263945@qq.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of cFLIP-siRNA tail venous injection on acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats, and explore the related mechanism.MethodsThree pairs of cFLIP siRNAs (cFLIP-siRNA) and negative control(siRNA-NC) were designed and synthesized. The most effective siRNA to inhibit the expression of cFLIP gene was selected for the experiment. Thirty SD rats were treated with retrograde pancreaticobiliary duct injection of 5% taurocholic acid sodium salt solution to establish ANP rat model. They were randomly divided into ANP group, siRNA-NC group and cFLIP-siRNA group with 10 rats in each group using random number method. The same volume of normal saline, siRNA-NC and cFLIP-siRNA were injected into tail vein, respectively. The rats were sacrificed after 24 h and the blood samples were colelcted. The levels of serum amylase and endotoxin were measured. The pancreatic tissues were collected and routine pathological examination was performed. The expressions of cFLIP-S and caspase-8 protein in pancreatic tissues were detected by immunohistochemistry and Western blotting.ResultsThe levels of serum amylase in ANP group, siRNA-NC group and cFLIP-siRNA group were (1 286±209), (1 297±305) and (552±256)U/L, the level of serum endotoxin were (136±32), (128±56) and (46±23)ng/L,respectively. The pancreatic pathological scores were (4.97±1.16), (4.92±2.03) and (1.67±1.98). The expression level of cFLIP-S protein were (8.56±2.72), (9.12±2.45) and (3.82±1.46), respectively, which were significantly lower in cFLIP-siRNA group than in ANP group and siRNA-NC group (P<0.05), and the difference was statistically significant (P<0.05). The expression level of caspase-8 protein in the three groups were (2.25±1.24), (2.41±1.14) and (5.56±1.79), respectively, which were significantly higher in cFLIP-siRNA group than in ANP group and siRNA-NC group, and the difference was statistically significant (P<0.05). However, there was no significant difference between ANP group and siRNA-NC group.ConclusionsInhibition of cFLIP gene expression can reduce pancreatic injury in ANP rats. The possible mechanism was that the up-regulation of caspase-8 can inhibit pancreatic cell necrosis and promote apoptosis.

Pancreatitis, acute necrotizing; RNA, small interfering; Apoptosis; cFLIP genes

FundprogramProject Supported by Program of Guangzhou Medical Research(20151A011098)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.005

511447 廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科

王寶枝，Email: 565263945@qq.com

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目(20151A011098)

2017-05-15)

呂芳萍)