李金紅，霍 巖，付 莉，陶承光，史振聲

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧 沈陽(yáng) 110161； 2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)特種玉米研究所，遼寧 沈陽(yáng)110866； 3.錦州醫(yī)科大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

建立玉米幼胚高效再生體系的研究

李金紅1，2，霍 巖1，3，付 莉3，陶承光1，史振聲2

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧 沈陽(yáng) 110161； 2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)特種玉米研究所，遼寧 沈陽(yáng)110866； 3.錦州醫(yī)科大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

為建立高效的玉米再生體系，以玉米幼胚為材料，研究了不同濃度的L-Pro、AgNO3和2，4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，同時(shí)還分析了不同濃度的玉米素和IBA對(duì)分化和生根的影響，結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)率最佳的組合為基本培養(yǎng)基中添加 L-Pro 700 mg／L、AgNO30.1 mg／L和2、4-D 1.5 mg／L；在基本培養(yǎng)基中添加5 mg／L的玉米素可有效促進(jìn)愈傷組織分化，再生芽和再生植株分化率分別達(dá)到97.96%和97.67%，在生根培養(yǎng)基中添加0.1 mg／L的IBA生根效果較好。

玉米；幼胚；愈傷誘導(dǎo)率；再生；

玉米是世界上重要的糧飼作物，我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和市場(chǎng)穩(wěn)定具有舉足輕重的作用［1，2］。利用分子生物學(xué)手段培育耐鹽堿玉米，對(duì)種植玉米面積的擴(kuò)大和提高玉米產(chǎn)量具有重要意義［3～6］，而建立高效的再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化是否成功的的關(guān)鍵因子。因此玉米優(yōu)良基因型再生體系的建立一直是人們研究的熱點(diǎn)［7］。自1975年首次利用未成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織獲得再生植株以來(lái)，玉米的再生體系技術(shù)獲得不斷發(fā)展［8］，如幼胚、成熟胚、胚芽鞘節(jié)、叢生芽等，但以玉米幼胚作為外植體，其誘導(dǎo)愈傷組織率和再生率都非常高［9～12］，然而其組織培養(yǎng)的過(guò)程中，影響因素頗為復(fù)雜。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了9種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)玉米A188自交系的進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織，并添加不同濃度的2、4-D和IBA對(duì)分化和生根進(jìn)行誘導(dǎo)，并獲得再生植株，探索建立高效遺傳再生體系的條件，為建立高效的玉米轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為玉米自交系A(chǔ)188，2017年種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，8月進(jìn)行人工授粉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 幼胚的獲得

在開花授粉期人工套袋，授粉后9～12 d，當(dāng)幼胚長(zhǎng)到1.0～1.2 mm大小時(shí)，取雌穗剝?nèi)グ~，每剝?nèi)ヒ粚影~噴灑75%的酒精，進(jìn)行表面消毒，用刀片在超凈工作臺(tái)下挑去幼胚，盾片向上，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

誘導(dǎo)培養(yǎng)基是基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的2，4-D、硝酸銀（AgNO3）、脯氨酸（L-Pro），試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，每個(gè)處理接種100個(gè)幼胚，3次重復(fù)。7 d后及時(shí)切除胚根和胚芽，14 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，確定最適宜配比濃度。

愈傷組織誘導(dǎo)率＝誘導(dǎo)出愈傷組織的幼胚數(shù)／接種總幼胚數(shù)×100%

1.2.3 玉米素的對(duì)幼苗分化的影響

將產(chǎn)生的顆粒狀、乳白色或淺黃色的生長(zhǎng)較快的胚性愈傷組織接種到不同濃度玉米素的分化培養(yǎng)基上，分化培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基分別添加3 mg／L、5 mg／L、7 mg／L的玉米素，每個(gè)培養(yǎng)皿放置25個(gè)胚性愈傷組織，3次重復(fù)。25℃持續(xù)光照，光強(qiáng)5 000 lx，21 d后統(tǒng)計(jì)幼苗分化率。

表 1 L9（33）試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 L9（33）Orthogonal test designs table

幼苗分化率 ＝分化出的組織培養(yǎng)苗數(shù)／愈傷組織數(shù) ×100%

1.2.4 生根培養(yǎng)基中IBA濃度的確定

當(dāng)待分化苗植株長(zhǎng)到到2～3 cm后，將分化出的玉米幼苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中分別添加 0.1 mg／L、0.2 mg／L、0.3 mg／L、0.4 mg／L的 IBA，將待生根的幼苗置于25℃、3 000 lx進(jìn)行光照培養(yǎng)，光周期為16 h／8 h。每次處理25株植株，3次重復(fù)。待再生植株高達(dá)5 cm左右，且具有3～5個(gè)新生根時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 煉苗與移栽

待幼苗長(zhǎng)出3～5個(gè)主根時(shí)，打開瓶口進(jìn)行煉苗，煉苗時(shí)培養(yǎng)基中倒入無(wú)菌水1～2 d后，用無(wú)菌水清洗幼苗根部殘留的培養(yǎng)基，再水培2～3 d后移栽至基質(zhì)中，移栽21 d以后調(diào)查成活，培養(yǎng)條件同生根培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化

愈傷組織誘導(dǎo)率（表2）和顯著性分析（表3）結(jié)果表明，L-Pro的濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)極顯著差異，當(dāng)L-Pro的濃度為700 mg／L時(shí)，其愈傷誘導(dǎo)率為 83.77%，顯著高于 500 mg／L和600 mg／L時(shí)愈傷誘導(dǎo)率。2，4-D和 AgNO3的含量對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)顯著性差異。2、4-D的濃度為1.5 mg／L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率為73.27%，明顯高于濃度為1 mg／L和2 mg／L的愈傷誘導(dǎo)率；當(dāng)AgNO3的為0.1 mol／L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率為71.4%；明顯高于 0.08 mol／L和0.12 mol／L處理。誘導(dǎo)愈傷組織的最佳組合處理為L(zhǎng)-Pro 700 mg／L、2、4-D 1.5 mg／L和 AgNO30.1 mol／L，誘導(dǎo)率達(dá)到98.60%。

2.2 玉米素的對(duì)幼苗分化的影響

將胚性愈傷組織接種到在含有 3 mg／L、5 mg／L、7 mg／L的玉米素的分化培養(yǎng)基上，3～5 d胚性愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠，7～10 d開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)（圖1A），進(jìn)而分化成幼苗（圖1B、圖1C）。玉米素可以促進(jìn)胚性愈傷組織分化，本試驗(yàn)研究表明培養(yǎng)基中添加5 mg／L玉米素時(shí)，其再生芽和再生植株分化率分別為97.96%和97.67%，明顯優(yōu)于培養(yǎng)基中添加3 mg／L和7 mg／L的玉米素時(shí)的分化率（表4）。

2.3 生根培養(yǎng)基中IBA濃度的確定

研究結(jié)果表明，當(dāng)生根培養(yǎng)基中添加0.1 mg／L的 IBA時(shí)，根的長(zhǎng)度大部分過(guò)于細(xì)長(zhǎng)（圖2A），不利于再生植株的生長(zhǎng)；當(dāng)生根培養(yǎng)基中添加IBA的濃度大于0.3mg／L時(shí)，根生長(zhǎng)緩慢且須根較少（圖2C、2D），不適合再生植株的生長(zhǎng)，當(dāng)生根培養(yǎng)基中添加0.2 mg／L的IBA時(shí)，根粗壯、須根較多并且生長(zhǎng)迅速（圖2B），適合再生植株的生長(zhǎng)，因此生根培養(yǎng)基中添加0.2 mg／L的IBA為適宜濃度。

2.4 煉苗與移栽

一般生根培養(yǎng)10 d左右，幼苗長(zhǎng)到3～4片葉，將三角瓶移入人工氣候溫室中，打開瓶口并倒入無(wú)菌水，1～2 d后將根部殘留的培養(yǎng)基洗凈，再進(jìn)行水培煉苗（圖2E），2～3 d后將幼苗轉(zhuǎn)移，移栽于經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理的優(yōu)質(zhì)土壤中。移栽時(shí)，將幼苗葉片剪去少許，外面扣膜，以保持濕度。每2 d噴水1次，待有新葉長(zhǎng)出時(shí)，逐漸通風(fēng)去掉薄膜，此時(shí)小苗即可正常生長(zhǎng)發(fā)育（圖2F）。21 d后成活率達(dá)到90%，獲得了較為理想的再生植株。

表2 三因素三水平正交試驗(yàn)Table 2 Three factors and three levels orthogonal table

表3 顯著性分析Table 3 Significance analysis

表4 不同濃度玉米素對(duì)愈傷組織分化的影響Table 4 Effect of different ZT hormones on shootfornation ofmaize callus

圖1 胚性愈傷組織分化Figure 1 Embryonic callus differentiaton

表5 不同濃度IBA對(duì)無(wú)菌苗生根的影響Table 5 Effect of different IBA hormones on plantlet rooting

圖2 不同濃度的IBA生根的影響及煉苗移栽Figure 2：Effect of different IBA hormones on plantlet rooting注：A：IBA的濃度為0.1 mg／L；B：IBA的濃度為0.2 mg／L；C：IBA的濃度為0.3 mg／L；D：IBA的濃度為0.4 mg／L；E：煉苗；F：移栽Note：A：0.1 mg／L IBA concentration；B：0.2 mg／LIBA concentration；C：0.3 mg／LIBA concentration；D：0.4 mg／L IBAconcentration；E：Hardening-seedling；F：Transplanting

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以授粉后7～12 d，1.0～1.2 mm大小的幼胚為受體材料，接種到9中不同的培養(yǎng)基，結(jié)果表明不同濃度的L-Pro、2、4-D和硝酸銀均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但最佳誘導(dǎo)愈傷組織的組合濃度為 L-Pro 700 mg／L、2、4-D 1.5 mg／L和 AgNO30.1 mol／L。說(shuō)明當(dāng)選用幼胚作為受體材料時(shí)，普遍可以誘導(dǎo)出愈傷，但其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素濃度對(duì)誘導(dǎo)愈傷的效率有很大的干預(yù)作用。

在分化階段，激素能夠誘發(fā)細(xì)胞分裂活性，引起細(xì)胞脫分化和無(wú)序增殖，產(chǎn)生愈傷組織［13］，在本試驗(yàn)中，基本培養(yǎng)基中添加5 mg／L的玉米素可有效促進(jìn)愈傷組織分化，再生芽和再生植株分化率分別達(dá)到97.96%和97.67%。

玉米組織的生根是再生體系的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只有根系發(fā)達(dá)才能長(zhǎng)成健壯的幼苗，培養(yǎng)基中IBA的添加可以促進(jìn)根的生成。本試驗(yàn)研究表明，在基本培養(yǎng)基中添加0.2 mg／L IBA，5 d左右后即可看到0.5～1.0 cm的粗壯的幼根，10 d以后即可煉苗移栽，如果環(huán)境條件適宜，移栽成話率也較高，能夠獲得比較理想的再生植株。

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Study on the Establishment of High Efficiency Regeneration System of Maize

LIJin-hong1，2，HUO Yan1，3，F(xiàn)U Li3，TAO Cheng-guang1，SHIZhen-sheng2（1．Innovation Center，Liaoning Academy of Agricultrual Science，Shenyang，Liaoning 110161； 2．Special Corn Institute of Shenyang Agriculture University，Shenyang，Liaoning 110866； 3 Institute of Food，Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121000）

To establish high-frequency regenration technique system for gene tranformation inmaize，We studyed on callus induction rate in L-Pro、AgNO3and 2，4-D when immature embryo is used as amaterial；we also analyzed the effects of different concentrations of ZT and IBA hormone on differentiation and rooting，The results showed that the best callus induction rate is added to L-Pro 700 mg／L、AgNO30.1 mg／L and 2、4-D1.5 mg／L in bascimedium；regeneration buds rate and regeneration plants rate reached 97.96%and 97.67%respectively if the basicemediuim was added to 5 mg／L zeatin；The result of rooting was the best when basice meidum was added 0.1 mg／L IBA as the exogenous hormone.

Maize；Immature embryo；Callus-induced rate；Regeneration

S513.035.3

A

1002-1728（2017）06-0001-05

10.3969／j.issn.1002-1728.2017.06.001

2017-10-12

遼寧省企業(yè)博士后項(xiàng)目（137301）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06-01-06）；科技部其他項(xiàng)目（2016YFD0101803）

李金紅（1979-），女，博士 助理研究員，主要從事作物分子育種研究。E-mail：lijinhong＿0315＠163.com通訊作者：陶承光（1955-），男，博士，研究員，主要從事作物分子育種的研究。E-mail：laast＠vip.sina.com史振聲（1954-），男，博士，教授，從事玉米育種與栽培生理研究。E-mail：Shi.zhensheng＠163.com