劉悅玫，侯利平，楊 梅，孟曉光，魏開華,*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 研究生院，安徽 合肥 230032；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，北京正旦國際科技有限責(zé)任公司，北京 102206)

MALDI-TOF質(zhì)譜準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法及其用于rhTPO復(fù)雜糖一致性研究

劉悅玫1,2，侯利平3，楊 梅3，孟曉光3，魏開華1,2,3*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 研究生院，安徽 合肥 230032；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，北京正旦國際科技有限責(zé)任公司，北京 102206)

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確測定重組人血小板生成素(rhTPO)仿制藥和原研藥中4類糖修飾的相對含量，并進行樣本間和批間一致性比較。結(jié)合多種切糖酶逐步切除rhTPO的N-糖、唾液酸和O-糖；以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，與樣本非混合點靶；采用MALDI-TOF質(zhì)譜準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法檢測，分別獲得各樣本完整含糖分子量及不同層次切糖后分子量；通過分子量差值計算4類糖修飾的相對含量；最后比較仿制藥與原研藥樣本間和批間一致性。以BSA多電荷峰對rhTPO切糖前后的MALDI-TOF質(zhì)譜測定值進行準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法校正，BSA多電荷峰之間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均≤0.075%，批間RSD為0.001%～0.004%，方法誤差均<0.01%。rhTPO仿制藥N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相對含量分別約為24.6%、2.9%、9.0%和5.1%，批間一致性良好，且總糖含量與文獻值一致；rhTPO原研藥N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相對含量分別約為25.6%、2.9%、7.9%和3.5%，總糖含量較文獻值偏低。與rhTPO原研藥相比，仿制藥糖基化糖相對含量基本一致，糖化糖含量有差異。rhTPO糖化糖研究未見文獻報道，其差異是不同廠家rhTPO之間差異的重要因素，主要由發(fā)酵工藝差異導(dǎo)致。

重組人血小板生成素(rhTPO)；基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)；準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法；糖含量；糖化

重組人血小板生成素(rhTPO)是利用基因重組技術(shù)由中國倉鼠卵巢細胞表達，經(jīng)提純制成的全長糖基化血小板生成素，在治療免疫性血小板減少癥方面效果顯著[1]。rhTPO氨基酸序列的分子量為35.5 kDa，而實際分子量可達到57.5 kDa，與其序列分子量相比增加62%。rhTPO羧基端結(jié)構(gòu)域(154～332氨基酸)為多聚糖區(qū)域，包括6個N-糖基化(N-glycosylation)、若干個O-糖基化(O-glycosylation)修飾潛在位點。根據(jù)糖基化類型，羧基端結(jié)構(gòu)域可進一步分為N-糖基化結(jié)構(gòu)域(154～246氨基酸)和O-糖基化結(jié)構(gòu)域(247～332氨基酸)[2]。已報道rhTPO的N-糖糖型以復(fù)合型(Complex)為主[3]，O-糖糖型以β(1-3)連接型為主，還含有少量其它糖型[4]。此外，rhTPO理論序列中的19個精氨酸(R)和7個賴氨酸(K)的側(cè)鏈氨基及N-末端氨基可在無酶催化的條件下與醛糖或酮糖發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)而引入糖化(Glycation)修飾[5-6]。這些糖修飾與rhTPO的生產(chǎn)工藝、特異活性和生物合成等密切相關(guān)，也會影響體內(nèi)代謝和不良事件的發(fā)生[7]。rhTPO的糖修飾含量高、位點多、種類多、糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，糖修飾研究難度大，但又是其作為新藥申報臨床批文所必須開展的內(nèi)容[4,8]。

雖然對TPO的結(jié)構(gòu)[4]和功能[9]已有一定研究，但其糖含量準(zhǔn)確測定方面的研究卻鮮有報道，尤其是未見關(guān)于rhTPO糖化糖含量研究的報道。目前常用的糖含量分析方法有化學(xué)法、色譜法和質(zhì)譜法?；瘜W(xué)法樣品用量大，靈敏度低且操作繁瑣，不適用于微量樣品和復(fù)雜糖蛋白[10]；色譜法需對糖鏈進行柱前衍生再結(jié)合紫外光譜、熒光光譜、質(zhì)譜進行糖含量分析，操作復(fù)雜，多用于多糖中單糖含量的測定[11]；隨著質(zhì)譜分辨率(常規(guī)檢測時的分辨率一般應(yīng)大于40 000)的飛速提升，高分辨率ESI-MS可以直接獲取抗體等糖蛋白完整分子的準(zhǔn)確分子量及糖含量，但實踐證明，對于rhTPO這類多位點、多糖型的復(fù)雜糖蛋白來說，ESI-MS目前還難以進行準(zhǔn)確的多電荷峰的去卷積解析，以致不能成功獲得完整分子的分子量。圖譜簡單、靈敏度高、分子量范圍寬的MALDI-TOF質(zhì)譜可快速得到rhTPO等復(fù)雜糖蛋白的分子量，但MALDI-TOF質(zhì)譜分辨率較低，準(zhǔn)確度不及ESI-MS，因此，提高MALDI-TOF分子量測定準(zhǔn)確度尤為重要。內(nèi)標(biāo)法可明顯提高MALDI-TOF質(zhì)譜測定準(zhǔn)確度，但標(biāo)準(zhǔn)品的加入可能降低目標(biāo)樣本的靈敏度且可能因為峰重疊而降低結(jié)果準(zhǔn)確度(圖1上)。本文改進了內(nèi)標(biāo)法，稱其為“準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法”，又稱“類似內(nèi)標(biāo)法”(Quasi-internal calibration)：在同一靶點中覆蓋有樣品、標(biāo)準(zhǔn)品互不交叉(或交叉區(qū)域小)；先采集純樣品信號，再采集純標(biāo)準(zhǔn)品信號并累加到樣品信號；最后用標(biāo)準(zhǔn)品信號校正累加有標(biāo)準(zhǔn)品信號的樣品質(zhì)譜圖(圖1下)[12]，可排除內(nèi)標(biāo)物干擾，并獲得樣本的準(zhǔn)確分子量。

本文以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，采用MALDI-TOF質(zhì)譜準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法測定rhTPO仿制藥(國產(chǎn))和原研藥(國產(chǎn))切除N-糖、唾液酸和O-糖前后的準(zhǔn)確分子量，通過對比完整含糖、不同層次切糖后分子量獲得4類糖修飾的相對含量，并進行樣本間和批間一致性比較，為rhTPO復(fù)雜糖修飾的快速評價提供了可靠結(jié)果，首次確定rhTPO糖化糖差異是該品種不同廠家間差異的重要因素。本文為復(fù)雜糖蛋白藥物的質(zhì)量控制和糖一致性分析提供了一種快速、可靠和實用的方法。

圖1 MALDI-TOF質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法(上)和準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法(下)示意圖Fig.1 Schematic diagram of internal(top) and quasi-internal(bottom) calibration of MALDI-TOF MSa,b:correction value;c:corrected value

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

rhTPO仿制藥(批號：A1，A2，A3)為國內(nèi)藥企生產(chǎn)；rhTPO原研藥(批號：B)為特比澳制劑(國產(chǎn))抽提物，由rhTPO仿制藥公司提供。N-糖切除酶PNGase-F、唾液酸切除酶Neuraminidase均購自Sigma公司；O-糖切除酶(O-Glycosidase)購自NEB公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Roche公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)購自Fluka公司。4800型 MALDI TOF/TOF質(zhì)譜購自AB公司。

1.2 儀器參數(shù)

MALDI-TOF質(zhì)譜線型正離子檢測模式檢測，加速電壓為18.2 kV；離子源電壓為20 kV；N2激光器，波長337 nm，能量6 000；延遲提取時間(PIE)480 ns，質(zhì)譜信號單次掃描累加2 000次，質(zhì)量掃描范圍m/z5 000～80 000。數(shù)據(jù)分析軟件為DE4.5(ABSciex)。

1.3 實驗方法

取rhTPO仿制藥和原研藥各150 μg(1 mg/mL，約150 μL)，加入8 mol/L尿素至尿素終濃度為6 mol/L，4 ℃變性30 min后超濾去除尿素，以50 mmol/L碳酸氫銨置換溶劑，按酶與蛋白的質(zhì)量比為1∶25加入N-糖切除酶，渦旋混勻后37 ℃孵育16 h切除N-糖，取20 μL于-20 ℃保存?zhèn)溆?；剩余樣本?0 mmol/L磷酸鈉溶液(pH 6.0)超濾置換溶劑，按酶與蛋白的質(zhì)量比為1∶100加入唾液酸切除酶，渦旋混勻后37 ℃孵育12 h去除唾液酸，取20 μL置于-20 ℃保存?zhèn)溆茫皇Ｓ鄻悠芬?0 mmol/L磷酸鈉溶液(pH 7.5)超濾置換溶劑，按酶體積與蛋白質(zhì)量的比例為1∶10加入O-糖切除酶，渦旋混勻后37 ℃孵育6 h切除O-糖，樣本于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

各取未切糖、切N-糖、切O-糖唾液酸、切O-糖的各樣本和BSA標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別與基質(zhì)(CHCA)按適當(dāng)比例混勻，按準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法點靶，用MALDI-TOF質(zhì)譜分別采集不同處理樣品的分子量圖并校正。

1.4 糖含量計算公式

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

2 結(jié)果與討論

2.1 N-糖相對含量

將各樣本首先進行MALDI-TOF質(zhì)譜檢測獲得完整含糖分子量，以BSA多電荷峰(單電荷、二電荷及三電荷)進行準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法校正，以A1為例，其校正質(zhì)譜圖見圖2，準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法校正結(jié)果見表1。BSA多電荷峰之間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤0.019%，批間RSD為0.002%，與序列分子量的誤差(即方法誤差)小于0.006%。準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法校正后測得仿制藥(A1、A2、A3)的完整含糖分子量在57 550～57 930 Da之間，3批間的RSD為0.37%，批間一致性良好(表2)。與文獻[4]的完整含糖分子量(57 539 Da)相比，rhTPO仿制藥與文獻值基本一致，rhTPO原研藥含糖分子量(56 302.6 Da)則明顯偏低。

圖2 rhTPO完整分子的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI-TOF MS of intact rhTPOA：rhTPO(A1) after BSA internal calibration；B： rhTPO(A1) after BSA quasi-internal calibration

表1 rhTPO切糖前后樣本 BSA準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法的校正結(jié)果比較Table 1 Comparison of BSA quasi-internal calibration results of rhTPO before and after glycan removed

*Avg.and RSD were used to evaluate the consistency of 3 batches biosimilar products of rhTPO

切N-糖樣本進行準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法校正后，BSA多電荷峰之間RSD≤0.075%，批間RSD為0.001%，方法誤差<0.003%(表1)。rhTPO仿制藥切N-糖后的分子量在43 480～43 670 Da之間，批間RSD為0.22%，批間一致性良好，但比原研藥(41 876.7 Da)高約1 500 Da(表2)，而仿制藥的凈N-糖量比原研藥僅低約1個己糖(表2)，兩者N-糖修飾基本一致。根據(jù)公式(1)，rhTPO仿制藥N-糖的相對含量為24.4%～24.8%，RSD為0.81%，批間一致性良好，比原研藥(25.6%)低1.0%左右，仿制藥的相對N-糖量略低于原研藥且超出了1個己糖所占N-糖的相對比例，提示原研藥完整含糖分子量比預(yù)期偏低。

表2 準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法測定rhTPO含糖、去不同糖修飾分子量及對應(yīng)糖相對含量Table 2 Determination of the molecular weight and the relative content of glycan of intact and glycan removed rhTPO by quasi-internal calibration

*Avg.and RSD were used to evaluate the consistency of 3 batches biosimilar products of rhTPO

2.2 O-糖唾液酸相對含量

切O-糖唾液酸樣本以BSA多電荷峰進行準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法校正，BSA多電荷峰之間RSD≤0.051%，批間RSD為0.002%，方法誤差<0.006%(表1)。rhTPO仿制藥切O-糖唾液酸的分子量在41 630～42 090 Da之間(表2)，批間RSD為0.59%，比原研藥(40 218.3 Da)略高約1 600 Da，但兩者凈O-糖唾液酸量接近(表2)。根據(jù)公式(2)，rhTPO仿制藥O-糖唾液酸的相對含量在2.6%～3.2%之間，與原研藥(2.9%)接近。此外，實驗過程中發(fā)現(xiàn)3批原研藥中有1批發(fā)生降解，說明原研藥的穩(wěn)定性不如仿制藥。

2.3 O-糖相對含量

切O-糖唾液酸樣本再經(jīng)O-Glycosidase切除O-糖，以BSA多電荷峰進行準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法校正。BSA多電荷峰之間RSD≤0.048%，批間RSD為0.004%，方法誤差小于0.01%(表1)。rhTPO仿制藥切O-糖后的分子量為38 300～38 470 Da，批間RSD為0.20%，批間一致性良好，比原研藥(37 418.8 Da)高約900 Da(表2)，但仿制藥的凈O-糖量比原研藥高約600 Da。根據(jù)公式(3)，rhTPO仿制藥的O-糖相對含量為8.8%～9.1%，批間較一致，比原研藥(7.9%)高約1.1%，提示兩者O-糖基化修飾有一定差異，原研藥的O-糖基化修飾不足。由于O-Glycosidase僅可特異性切除β(1-3)連接型O-糖，因此，O-糖酶解后樣本存在極少量其它類型的O-糖殘余。此外，實驗過程中發(fā)現(xiàn)切唾液酸后剩余的2批原研藥中又有1批發(fā)生降解，再次提示原研藥的穩(wěn)定性不如仿制藥。

2.4 總糖、糖基化糖及糖化糖相對含量的一致性比較

圖3 糖基化糖、糖化糖及總糖的相對含量(%) Fig.3 Relative content of glycosylation,glycation and total glycan of rhTPO(%)

本文研究過程中發(fā)現(xiàn)，rhTPO除經(jīng)典的酶促糖基化修飾(Glycosylation)外，還存在化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的糖化修飾(Glycation)，并經(jīng)nanoLC-MS/MS鑒定了糖化修飾位點和修飾率。rhTPO仿制藥的實測總糖含量(公式(6))為38.4%～38.8%，樣本間一致性良好，與文獻總糖含量(38.4%)[4]基本一致，而rhTPO原研藥偏低(圖3)。3批rhTPO仿制藥與1批原研藥的糖基化糖(公式(4))相對含量基本一致，仿制藥的糖化糖(公式(5))相對含量為4.9%～5.2%，比原研藥高約1.6%，兩者糖化糖差異較明顯，經(jīng)nanoLC-MS/MS確認(rèn)，兩者糖化修飾位點分布差異較明顯。

值得一提的是，仿制藥與文獻的總糖含量很接近，原研藥與文獻及仿制藥總糖含量均有差異，提示仿制藥的工藝更接近文獻，而上市產(chǎn)品(原研藥)與文獻有一定差異。后續(xù)研究表明，原研藥與仿制藥的糖化位點和相對分布有差異，這種差異是該品種電荷異質(zhì)性的重要來源。此外，實驗過程中發(fā)現(xiàn)原研藥在切唾液酸和O-糖過程中發(fā)生降解，提示原研藥穩(wěn)定性不如仿制藥。國產(chǎn)原研藥上市較早，當(dāng)時的蛋白表達技術(shù)和質(zhì)量分析技術(shù)有限，或許導(dǎo)致了原研藥未能進行充分的工藝優(yōu)化。

需指出的是，糖化是一種非酶相關(guān)的糖修飾，普遍認(rèn)為是有害、應(yīng)盡量避免的化學(xué)修飾，它與生產(chǎn)工藝相關(guān)，工藝差異會引起糖化程度不同，因此會導(dǎo)致糖化糖的含量略有差異。此外，考慮到rhTPO原研藥(B)是經(jīng)過工藝抽提獲得，因此不排除抽提工藝會造成其糖基化糖的丟失，但糖化糖基本不受抽提工藝影響。

3 結(jié) 論

本文采用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，運用MALDI-TOF質(zhì)譜準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法結(jié)合多種酶切對復(fù)雜糖蛋白藥物rhTPO切糖前后分子進行測定，BSA多電荷峰之間RSD均≤0.075%，批間RSD為0.001%～0.004%，方法誤差均<0.01%，說明該檢測方法準(zhǔn)確性好，可靠性高。準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)法作為一種介于內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法之間的方法，不但可以排除標(biāo)準(zhǔn)品對樣本的干擾，還可以提高測定的準(zhǔn)確度，對復(fù)雜糖蛋白的解析有明顯優(yōu)勢。

本文采用上述方法測定了rhTPO去糖前后的分子量，并得到了N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化(Glycation)糖的相對含量，其中，仿制藥(國產(chǎn))分別為24.6%、2.9%、9.0%和5.1%，原研藥(國產(chǎn))分別為25.6%、2.9%、7.9%和3.5%。rhTPO仿制藥和原研藥的糖基化糖(Glycosylation，包括N-糖基化糖和O-糖基化糖及其末端唾液酸)相對含量基本一致，說明該仿制藥所構(gòu)建的生產(chǎn)用細胞株與上市的原研藥基本一致，原研藥的抽提工藝并未明顯改變原研藥的酶相關(guān)糖基化修飾。仿制藥和原研藥的糖化糖含量有一定差異，推測主要是發(fā)酵工藝的差異導(dǎo)致。由于文獻未報道rhTPO的各級糖含量(包括糖化糖)，不能確定國產(chǎn)rhTPO與國外rhTPO的糖含量及批間一致性情況。與文獻rhTPO(國外rhTPO)[4]總糖含量相比，仿制藥總糖含量與其基本一致，而原研藥則偏低，表明仿制藥的工藝更接近文獻，而上市產(chǎn)品(原研藥)與文獻有一定差異。

糖蛋白藥物的糖含量、糖位點、糖型是質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)，是新藥報批的必要內(nèi)容，本方法對于快速判斷多位點、多糖型的復(fù)雜糖蛋白的糖含量及其一致性和工藝優(yōu)化有重要參考價值。

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MALDI-TOF MS with Quasi-internal Calibration Method and Its Study on Batch-to-Batch Consistency in Complex Glycan of rhTPO

LIU Yue-mei1,2，HOU Li-ping3，YANG Mei3，MENG Xiao-guang3，WEI Kai-hua1,2,3*

(1.Graduate School,Anhui Medical University，Hefei 230032,China；2.Beijing Institute of Radiation Medicine，Military Medical Science Academy of PLA，Beijing 100850,China；3.State Key Laboratory of Proteomics,National Engineering Research Center for Protein Drugs(Beijing),Beijing C&N International Sci-Tech Co.，Ltd.，Beijing 102206,China)

The relative contents of four kinds of glycan forms in the inovator and biosimilar products of recombinant human thromboplastin(rhTPO) were accurately determined using matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS) with quasi-internal calibration,the consistencies between products and among batches were evaluated.The N-glycan,sialic acid and O-glycan of rhTPO were removed off with different endoglycosidase,respectively.bovine serum albumin(BSA)used as the standard was pointed target separate with the sample.The molecular weights of the intact glycoproteins and the different forms of deglycosylated proteins were determined by MALDI-TOF MS with quasi-internal calibration.The glycan contents in samples were calculated by the molecular weight differences among different deglycosylated samples.Finally,the consistency of the inovator and biosimilar products were evaluated.The multi-charge peaks of BSA were used for the quasi-internal calibration of MALDI-TOF MS.And their calibration relative standard deviations(RSDs) were all no more than 0.075%,and the RSDs among different calibrations were among 0.001%-0.004%.The method deviations away from the sequence molecular weight were less than 0.01%.For the biosimilar drug,the relative contents of N-glycan,sialic acid,O-glycan,and glycation were 24.6%,2.9%，9.0%and 5.1%,respectively,and the batch-to-batch consistency was quite good.The total glycan contents were consistent with those reported in the literature.For the innovator drug,the relative contents of N-glycan,sialic acid,O-glycan and glycation were 25.6%,2.9%,7.9%and 3.5%,respectively.The total glycan content was lower than that reported in the literature.The relative contents of glycosylation between the innoventor products and the biosimilar products were almost the same but the relative contents of glycation showed some differences.Glycation of rhTPO has not been reported up-to-now,the differences of the relative contents of glycation might be the important factors for the different rhTPO manufacturers,the glycation differences were mainly caused by the differences of fermentation process.

recombinant human thrombopoietin(rhTPO);matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS);quasi-internal calibration; glycan contents; glycation

2017-06-24；

2017-10-09

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃863項目(2014AA020906)；國家科技部重大儀器專項(2012YQ18011710)；蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室課題(SKLP-O201412)

*

魏開華，博士，研究員，研究方向：藥學(xué)，Tel：010-80727777，E-mail：wkh2006@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.007

O657.63

A

1004-4957(2017)12-1458-06