郝 瑩， 郭禮強(qiáng)， 劉東霞， 孫 軍， 趙 晗

產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選鑒定及活性研究

郝 瑩， 郭禮強(qiáng)， 劉東霞， 孫 軍*， 趙 晗

（濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041）

為篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌株，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法與微生物學(xué)方法相結(jié)合的方式進(jìn)行初步篩選。從土壤中分離獲得一株乳酸菌菌株P(guān)9-5，將菌株P(guān)9-5發(fā)酵液作用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)該致病菌有抑制活性。結(jié)合菌落及菌體形態(tài)，通過Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定和16S rDNA基因序列相似性分析，鑒定菌株P(guān)9-5為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），為菌株P(guān)9-5的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了技術(shù)支持。

細(xì)菌素；抑菌特性；高效液相色譜；自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)；鑒定

To study and screen the bacteriocin-producing lactic acid bacteria，a lactic acid bacteria strain P9-5 was isolated from soil.The high performance liquid chromatographic method and microbiology technique were used to screen strains P9-5.The results showed that the culture filtrate of P9-5 exhibited high inhibitory activity against Listeria monocylogenes.According to the colonies，cells morphology，the results of the Biolog automated microbial analysis system and 16S rDNA sequence alignment，the isolated strain was identified as Pediococcus pentosaceus.It provided technical support for further development and utilization of strain P9-5.

bacteriocin；antimicrobial characteristics；high performance liquid chromatography；automatic microbiology analysis system；identification

近年來，世界各地由單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起的中毒事件層出不窮，預(yù)防和控制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染成為了社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)（Vijayakumar等，2015；呂燕妮等，2007）。 乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱，具有多種有益的生理功能，能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)（李悅等，2008）。細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性的多肽或前體多肽，產(chǎn)生菌對(duì)其自身分泌的細(xì)菌素具有免疫作用（Malheiros等，2015；Cui等，2012；劉麗等，2011）。 在研究中發(fā)現(xiàn)，某些乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，這些細(xì)菌素通常都屬于Ⅱa型細(xì)菌素。該類細(xì)菌素經(jīng)濟(jì)、有效，并且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，有望從源頭上對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染加以控制（Furtado 等，2014；Banerjee 等，2013；呂燕妮，2007；韓雪等，2006）。

目前，國(guó)內(nèi)成型的Ⅱa型細(xì)菌素類產(chǎn)品較少。Ⅱa型細(xì)菌素類制劑作為控制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的一種手段急需研究和開發(fā)。本研究通過抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株的篩選，旨在建立合理、有效的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌拮抗乳酸菌株的篩選方法，為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的控制提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 從山東濰坊、煙臺(tái)等地區(qū)采集不同地點(diǎn)的土樣、牛奶、泡菜、發(fā)酵產(chǎn)品等樣品。

1.2 指示菌 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）NICPBP 54002。

1.3 培養(yǎng)基 MRS肉湯培養(yǎng)基：購于北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。稱取52.3 g粉末加入1 L水，加熱煮沸至完全溶解，分裝。115℃高壓滅菌15 min。

MRS瓊脂：購于北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。稱取64.25 g粉末加入1 L水，加熱煮沸至完全溶解。121℃高壓滅菌15 min。冷卻至46℃左右倒平板或斜面。

TSB培養(yǎng)基：購于北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。稱取36 g粉末加入1 L水，加熱煮沸至完全溶解。121℃高壓滅菌15 min。

TSA培養(yǎng)基：購于北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。稱取51 g粉末加入1 L水，加熱煮沸至完全溶解。121℃高壓滅菌15 min。冷卻至46℃左右倒平板或斜面。

BUG+B培養(yǎng)基：購于美國(guó)Biolog公司。稱取57 g粉末于950 mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至25℃，調(diào)整pH至7.3±0.1，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至45～50℃，加入50 mL脫纖維羊血混勻。

1.4 儀器與設(shè)備 HVE-50立式壓力蒸汽滅菌器，日本Hirayama公司；BSC-1300ⅡA/B3生物安全柜，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；CX21顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Aglient 1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；PL 602-S分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Incucell 111恒溫培養(yǎng)箱，德國(guó)MMM公司；移液槍，德國(guó)Eppendorf公司；5417R臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；UV2100分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，美國(guó)Biolog公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 乳酸菌的分離篩選 稱取混合均勻的試驗(yàn)樣品于MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，均勻混合后在無菌條件下用移液器吸取培養(yǎng)液進(jìn)行一系列梯度稀釋。取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂布MRS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落純化（董瑞麗等，2013；Yang 等，2012）。

在無菌條件下，挑取分離純化后的菌落于新鮮的MRS肉湯中，置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h后，菌落培養(yǎng)液離心除去菌體，加入相同體積的0.01 mol/L的硫酸溶液混合均勻，進(jìn)行酸解，12000 r/min離心5 min，過濾稀釋后上機(jī)檢測(cè)菌落培養(yǎng)液中的乳酸含量（馬瑞等，2012；Svetoch，2011）。色譜條件為色譜柱：Aglient ZORBAX SBC18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（pH 2.0），乙腈；磷酸水∶乙腈 5∶95；流速：0.3 mL/min；柱溫：室溫；波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

將檢測(cè)到產(chǎn)生乳酸的純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫試驗(yàn)，選取革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性菌初步確認(rèn)為乳酸菌 （崔一喆等，2016）。

1.5.2 產(chǎn)Ⅱa型細(xì)菌素的乳酸菌篩選及對(duì)單增李斯特氏菌的拮抗作用 將篩選出的乳酸菌株，接入MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，8000 r/min離心10 min，取上清，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)整發(fā)酵液的 pH 到 6.5 ～ 7.0（Huang等，2009；周偉等，2006）；單增李斯特氏菌在TSB肉湯培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)18 h，按1%接種量接種于10 mL新鮮的TSB肉湯培養(yǎng)基中，加入調(diào)節(jié)pH后的乳酸菌發(fā)酵液，置于35℃，連續(xù)培養(yǎng)8 h，每隔一定時(shí)間測(cè)定培養(yǎng)液在600 nm波長(zhǎng)處的OD值，以不加乳酸菌發(fā)酵液的單增李斯特氏菌培養(yǎng)液為對(duì)照 （Goh等，2015；余倩等，2013）。

1.5.3 菌株鑒定 將獲得的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得與菌株16SrDNA同源的序列數(shù)據(jù)，使用MEGA 5.10軟件計(jì)算序列相似性并作系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（齊育平等，2013；Abbasiliasi等，2012）。 同時(shí)，挑取菌株純培養(yǎng)物單菌落，接種于BUG培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24～48 h，CO2濃度為6.5%，轉(zhuǎn)接1～2代。使用Inoculatorz棉簽從BUG平板上沾取菌落接種于IF-C接種液中，將濁度調(diào)整為90%～98%。菌懸液倒入V型加樣水槽中，使用8道移液器將菌懸液按順序加入微孔板的所有孔中，每孔100 μL。將微孔板置于37℃培養(yǎng)16～48 h，使用Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定 （董瑞麗等，2013；劉江等，2012）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離篩選 乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱（李悅等，2008）。劉麗等（2011）將稀釋后的樣品涂布到乳酸菌分離培養(yǎng)基上，通過挑選有溶鈣圈的菌落，多次劃線純化進(jìn)行乳酸菌的分離。崔一喆等（2016）通過革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)，根據(jù)革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶接觸陰性初步確定為乳酸菌。董雨馨等（2016）使用傾注法將樣品接種在碳酸鈣-MRS瓊脂平板上，培養(yǎng)后，選取有溶鈣圈的菌落，初步判斷為乳酸菌，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。本文應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)稀釋一定倍數(shù)的純化后的細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)與定性分析，將乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)出峰時(shí)間進(jìn)行判斷，乳酸出峰時(shí)間為12.5 min左右，通過對(duì)檢測(cè)結(jié)果（圖1和圖2）的分析，將培養(yǎng)液中乳酸檢測(cè)陽性的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。對(duì)上機(jī)篩選所得菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫試驗(yàn)，乳酸菌為革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陰性。

圖1 乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

圖2 乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品的色譜圖

2.2 產(chǎn)Ⅱa型細(xì)菌素乳酸菌的篩選及對(duì)單增李斯特氏菌的拮抗作用 由圖3可知，菌株P(guān)9-5發(fā)酵液對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。含單增李斯特氏菌的培養(yǎng)基與菌株P(guān)9-5發(fā)酵液混合后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與發(fā)酵液處理組中單增李斯特氏菌均持續(xù)增長(zhǎng)，但發(fā)酵液處理組的菌體增長(zhǎng)速度與菌體量一直低于對(duì)照組。培養(yǎng)2 h后，對(duì)照組與處理組中單增李斯特氏菌的增長(zhǎng)差距逐漸增大，培養(yǎng)到6 h時(shí)，對(duì)照組與發(fā)酵液處理組中單增李斯特氏菌的增長(zhǎng)均趨于平穩(wěn)，菌體量差距達(dá)到最大。在培養(yǎng)過程中，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵液處理后，與對(duì)照相比，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長(zhǎng)量降低30%，其生長(zhǎng)受到明顯抑制。

圖3 P9-5對(duì)單增李斯特氏菌的拮抗作用

2.3 菌株鑒定 純化后的菌株P(guān)9-5在MRS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為乳白色菌落，邊緣整齊，正面略凸起，表面光滑濕潤(rùn)，不透明，革蘭氏染色呈陽性，無芽胞。提取菌株P(guān)9-5基因組DNA，擴(kuò)增其16S rDNA基因序列，進(jìn)行核苷酸序列分析。

將測(cè)序獲得的菌株核苷酸序列信息提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心，利用Blast檢索系統(tǒng)在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已知核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，獲得與菌株P(guān)9-5 16S rDNA同源性較高的序列數(shù)據(jù)，使用MEGA 5.10軟件計(jì)算序列相似性并作系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建菌株P(guān)9-5的系統(tǒng)發(fā)育樹（李強(qiáng)坤等，2016）。由圖4可以看出，菌株P(guān)9-5與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的核苷酸序列具有最高的同源性，初步確定為戊糖片球菌。

圖4 基于16S rDNA建立的P9-5菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，是利用微生物對(duì)不同碳源呼吸代謝的差異，針對(duì)每一類微生物篩選95種不同碳源或其他化學(xué)物質(zhì)，配合四唑類顯色物質(zhì)（如TTC、TV），通過檢測(cè)微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行呼吸代謝產(chǎn)生的氧化還原物質(zhì)與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化以及微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異，生成特征指紋圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，即可得出鑒定結(jié)果（董瑞麗等，2013）。

使用Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株P(guān)9-5進(jìn)行鑒定，得出四個(gè)最可能的鑒定結(jié)果（表1）。相似度指數(shù)值表示了測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應(yīng)數(shù)據(jù)條的匹配程度，培養(yǎng)后，只有當(dāng)相似度指數(shù)大于0.50時(shí)，鑒定結(jié)果才能被接受（劉江等，2012）。菌株P(guān)9-5鑒定結(jié)果顯示與戊糖片球菌相似度指數(shù)為0.726，綜合16S rDNA試驗(yàn)分析結(jié)果，確定菌株P(guān)9-5 為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。

表1 P9-5的Biolog鑒定結(jié)果

3 討論

單核細(xì)胞增生李斯特菌是常見的致病微生物，可引起李斯特菌病，致死率相對(duì)較高。并且單增李斯特菌在4℃條件下仍可繁殖，預(yù)防和控制該菌的污染具有一定的困難 （董雨馨等，2016；許紅巖，2013）?；瘜W(xué)類防腐劑以及抗生素的添加可以有效抑制致病菌的生長(zhǎng)，但是可能存在致癌、致畸、抗藥性和食物中毒等安全問題，而細(xì)菌素可作為抗競(jìng)爭(zhēng)分子生物膜的信號(hào)分子阻礙致病菌入侵微生物群落，可被動(dòng)物消化道的部分蛋白酶降解，具有無毒、無抗藥性、無副作用、無殘留等優(yōu)點(diǎn)（董雨馨等，2016；胡美忠等，2016；尹樂斌等，2016；許紅巖，2013）。許紅巖等（2013）從土壤中分離出一株單增李斯特氏菌的拮抗微生物，鑒定為枯草芽孢桿菌，在食品保鮮中顯示出了良好的應(yīng)用前景。姜晶等（2016）從酸馬奶中提純的植物乳桿菌細(xì)菌素可有效抑制大腸桿菌O78的生長(zhǎng)。李強(qiáng)坤等（2016）通過牛津杯法篩選得到幾株高抑菌活性的植物乳桿菌，對(duì)大腸桿菌O157∶H7和金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。

本研究通過微生物與高效液相色譜方法相結(jié)合的方式，建立了篩選乳酸菌的新方法，采用液體培養(yǎng)法篩選得到有效的產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌P9-5，對(duì)單增李斯特氏菌的生長(zhǎng)具有很好的抑制作用。通過分子生物學(xué)方法以及Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株P(guān)9-5進(jìn)行鑒定，確定其為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境中易被單增李斯特氏菌污染的階段，有利于提高單增李斯特氏菌防控水平，促進(jìn)畜牧業(yè)以及食品行業(yè)的安全發(fā)展。

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S816.3

A

1004-3314（2017）22-0019-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172205

山東檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目計(jì)劃（SK201217）；濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（2014RKX094）

*通訊作者