戴振清，胡序明，王 芳，陳世豪，賈崇信，豆春峰，耿拓宇，崔恒宓

（1.揚(yáng)州大學(xué)表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)和技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1在雞基因組上下游序列鑒定

戴振清1,2，胡序明1,2，王 芳1,2，陳世豪1,2，賈崇信1,2，豆春峰1,2，耿拓宇1,2，崔恒宓1,2

（1.揚(yáng)州大學(xué)表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)和技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

已知雞基因組中含有禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1序列，而ALVE1在雞基因組中的上游和下游區(qū)域位置在參考基因組中并未成功鑒定。本研究成功鑒定出ALVE1所在雞基因組中的上、下游序列，并通過提取CEF細(xì)胞和DF-1細(xì)胞基因組反過來驗(yàn)證了ALVE1的位置信息。與參考基因組不同的是，我們發(fā)現(xiàn)ALVE1序列包含3'LTR序列，在雞1號(hào)染色體上的插入位置為chr1:65,995,534～65,993,540。本研究不僅提供了ALVE1在雞基因組中的完整信息，也為進(jìn)一步研究ALVE1的功能奠定了基礎(chǔ)。

禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒；ALVE1；鑒定

內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（endogenous Retroviruses）是基因組成分，以其“前病毒”形式存在，幾乎在所有哺乳動(dòng)物（如人、鼠、貓和羊）和脊椎動(dòng)物（如雞）基因組中存在。作為遠(yuǎn)古反轉(zhuǎn)錄病毒感染在宿主體內(nèi)的殘留，過去對(duì)它的功能不夠了解，曾將其視為垃圾DNA（Junk DNA）。直至最近有研究表明，某些內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒不僅對(duì)早期胚胎發(fā)育和胚胎干細(xì)胞的多能性具有重要作用[1-3]，還可能與細(xì)胞天然免疫有關(guān)[4-6]。

目前，在雞基因組中已鑒定多種類型的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒，但其基因組結(jié)構(gòu)都與禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）類似[7]。禽白血病病毒屬于禽反轉(zhuǎn)錄病毒科C型腫瘤病毒，在自然界以內(nèi)源性（ALVE）和外源性（如ALVA、ALVB、ALVC、ALVD和ALVJ）兩種形式存在[8]。禽內(nèi)源性白血病病毒ALVE是最早發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒，可能與宿主免疫應(yīng)答和遺傳抗性有關(guān)[9,10]。早期對(duì)雞的研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE的env轉(zhuǎn)錄物能夠降低細(xì)胞受體的活性，從而保護(hù)機(jī)體免受外源性反轉(zhuǎn)錄病毒的感染[11]；體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)源性ALVE和外源性反轉(zhuǎn)錄病毒env轉(zhuǎn)錄物之間存在相互干擾[12]。特別是，來源于雞1號(hào)染色體上的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1與禽白血病病毒高度同源，可能與禽白血病病毒的感染和增殖具有一定關(guān)聯(lián)。

本研究首先分析了禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒與外源性禽白血病毒病毒的序列同源性和進(jìn)化關(guān)系，然后以雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF）為研究對(duì)象，鑒定了ALVE1在雞1號(hào)染色體的具體插入位置信息，為進(jìn)一步分析ALVE1的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

SPF白羽種雞蛋由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，孵化至10日齡后，按常規(guī)方法制備CEF；DF-1細(xì)胞由教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室秦愛建教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑

TRIzol? Reagent和SMARTer? RACE 5'/3'Kit購自日本TaKaRa公司，AxyPrep基因組DNA小量試劑盒購自美國Axygen公司，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用 DNAMAN 8.0 和 MEGA 6.0 軟件進(jìn)行序列同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，病毒序列信息見表1。

表1 本研究所使用的病毒序列信息Table 1 Viral sequences information used in this study

1.4 cDNA 末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends, RACE）

由TaKaRa公司提供的SMARTer? RACE 5'/3'Kit試劑盒來完成。首先，用TRIzol?Reagent提取總RNA，然后用RNase-free DNase I 去除基因組。在 SMART Scribe Reverse Transcriptase 的作用下分別將1 g去除DNA的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成 5'-或 3'-RACE產(chǎn)物。然后利用通用引物UPM和基因特異性引物（gene-specific primer，GSP）擴(kuò)增，克隆測(cè)序獲得目的RNA序列的5'端及3'端全長序列。最后，通過PCR克隆測(cè)序獲得目的RNA的全長序列。

1.5 反式PCR

通過反式PCR獲得ALVE1插入位置及其上游序列，簡要步驟如下：首先，將大約1 μg雞胚成纖維細(xì)胞基因組DNA通過BamHI、SacI或XhoI限制性酶（ALVE1序列中含有的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行酶切；然后，通過苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀進(jìn)行純化，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物通過TA克隆測(cè)序。

1.6 引物設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank公布的禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1（GenBank登錄號(hào)：AY013303.1），采用Primer 3.0和Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物并委托Invitrogen公司合成，引物序列見表2。

表2 本文所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.7 基因組提取

按照AxyPrep基因組DNA小量試劑盒說明書操作步驟提取基因組，簡要步驟如下：收集細(xì)胞后，離心去上清液并加入350 μL PBS；加入0.8 μL RNase A，漩渦振蕩15 s，室溫靜置1 min；加入150 μL Buffer C-L和8 μL Proteinase K，立即漩渦振蕩1 min混合均勻后56℃水浴10 min；加入350 μL Buffer P-D，漩渦振蕩30 s混合均勻，12 000×g離心10 min。然后，依次加入500 μL Buffer W1，12 000×g離心1 min洗滌1次和700 μL Buffer W2，12 000×g離心1 min洗滌2次。最后加入100～200 μL Eluent buffer或去離子水，室溫靜置1 min，12 000×g離心1 min洗脫DNA。

2 結(jié)果與討論

2.1 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1序列同源性和進(jìn)化樹分析

根據(jù)GenBank公布的禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（E亞群禽白血病病毒）和不同亞群的禽白血病病毒（A、B、C、D和J亞群）核苷酸序列進(jìn)行同源性和進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖1所示，禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄ALVE1與不同亞群的禽白血病病毒在序列上高度相似，序列同源性高達(dá)85%以上，進(jìn)化上高度保守。由于ALVE1與其對(duì)應(yīng)的外源性反轉(zhuǎn)錄病毒高度同源，因而可作為理想的研究模型去揭示內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒在基因組中的功能和作用。研究發(fā)現(xiàn)，SPF雞胚中存在內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1全基因組序列[13]。過去的研究已成功建立禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE表觀遺傳學(xué)分析方法[14]；并且禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1含有完整的LTR，是控制禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1轉(zhuǎn)錄活性的一個(gè)關(guān)鍵因素，其自身轉(zhuǎn)錄受到DNA甲基化調(diào)控[15]。因此，進(jìn)一步確定ALVE1在雞基因組中的具體位置信息，對(duì)研究ALVE1的功能十分重要。

2.2 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1末端序列及其在染色體上插入位置鑒定

我們發(fā)現(xiàn)目前對(duì)ALVE1在1號(hào)染色體上的拼接位置信息有誤。根據(jù)UCSC Genome Browser Gallus_gallus-4.0/galGal4公布的ALVE1在雞1號(hào)染色體的位置信息為chr1:32,561,736～32,568,952，僅含有7217 bp且缺少完整的ALVE1 3'LTR序列（見圖2A）。盡管最新Gallus_gallus-5.0/galGal5版本公布的信息糾正了這一錯(cuò)誤，即ALVE1含有完整的ALVE1 3'LTR序列（圖2B）。然而，根據(jù)這些位置信息設(shè)計(jì)引物均未能擴(kuò)增出ALVE1在1號(hào)染色體上的上、下游序列，由此說明目前對(duì)ALVE1在1號(hào)染色體上的拼接位置信息有誤。本研究鑒定發(fā)現(xiàn)ALVE1在雞1號(hào)染色體上的拼接位置為chr1:65,995,534～65,993,540（圖2C）。首先，通過RACE確認(rèn)ALVE1在1號(hào)染色體含有完整的3'末端LTR序列，并且確認(rèn)其在染色體的插入位置及其下游序列（圖3）。同時(shí)，利用反式PCR鑒定出ALVE1 5'末端在染色體的插入位置及其上游序列,且通過設(shè)計(jì)上游和下游引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序，再次確認(rèn)了ALVE1在雞1號(hào)染色體的插入位置信息及其上、下游序列（圖4）。

2.3 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1在雞基因組中的位置驗(yàn)

圖1 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1同源性和進(jìn)化樹分析Fig.1 Homology and phylogenetic tree analysis of Avian endogenous retrovirus ALVE1

根據(jù)上述結(jié)果獲得的ALVE1在雞1號(hào)染色體的插入位置信息及其上、下游序列設(shè)計(jì)PCR引物（圖4A）；通過常規(guī)PCR擴(kuò)增，從原代雞胚成纖維細(xì)胞CEF基因組擴(kuò)增出全長為7525 bp的序列（圖4B）。而對(duì)照組DF-1細(xì)胞基因組未能擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶（圖4B）。反過來，DF-1細(xì)胞基因組無ALVE1序列，因而在ALVE1插入位置，上、下游序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物可以分別擴(kuò)增出理論大小1800 bp或1400 bp的條帶；而CEF細(xì)胞基因組有ALVE1，因此在相同位置不會(huì)擴(kuò)增出條帶（圖4C）。由此，本研究確定了ALVE1在雞1號(hào)染色體的插入位置、片段大小和插入位置上、下游序列。

圖2 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1在雞基因組中的位置圖示Fig.2 Schematic overview Avian endogenous retrovirus ALVE1 in the chicken genome

圖3 禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1在雞基因組中的上游和下游序列示意圖及擴(kuò)增Fig.3 identification of upstream and downstream of Avian endogenous retrovirus ALVE1 in the chicken genome

圖4 驗(yàn)證禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1在基因組中的上游和下游序列Fig.4 Verification of upstream and downstream sequences of ALVE1 in the chicken genome

本研究提供了一種鑒定內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒序列在染色體上的插入位置鑒定方法，即通過RACE鑒定內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒m RNA的末端序列并結(jié)合反式PCR技術(shù)，反推其在染色體中的位置，這為今后鑒定基因組中的病毒序列提供了一種有效的方法。同時(shí)，本研究對(duì)禽內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1在雞1號(hào)染色體的插入位置信息及其上、下游序列進(jìn)行重新鑒定和驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究ALVE1的功能奠定了基礎(chǔ)。

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IDENTIFICATION OF UPSTREAM AND DOWNSTREAM SEQUENCES OF AVIAN ENDOGENOUS RETROVIRUS ALVE1 IN THE CHICKEN GENOME

DAI Zhen-qing1,2, HU Xu-ming1,2, WANG Fang1,2, CHEN Shi-hao1,2, JIA Chong-xin1,2, DOU Chun-feng1,2,GENG Tuo-yu1,2, CUI Heng-mi1,2
(1. Institute of Epigenetics and Epigenomics, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2.College of Animal Science and Technology,Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

The chicken genome contains endogenous avian leukosis viral element on chromosome 1 (ALVE1). However, the upstream and downstream sequences flanking region of the ALVE1 element remains unidentified in the reference genome. In this study, the upstream and downstream sequences of ALVE1 in the chicken genome were identified using RACE and inverse PCR, and confirmed by PCR Amplification. In addition, the location of ALVE1 was verified using CEF and DF-1 cell genomes. Here, the complete sequences containing the upstream and downstream of ALVE1 element were figured out with genomic DNA from CEF cells. Unlike the reference genome, ALVE1 element contained 3'LTR sequences on chicken chromosome 1 (position: 66086818-66086750). This study not only provided the complete information of ALVE1 in the chicken genome but also provided a basis for further study on the function of ALVE1.

Avian endogenous retroviruses; ALVE1; identification

2017-10-9

國家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃(91540117)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372237）；國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31602032）；江蘇省畜牧學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201611117037Z）

戴振清，女，碩士研究生，特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)專業(yè)

崔恒宓，E-mail：hmcui@yzu.edu.cn

S852.659.3

B

1674-6422（2017）06-0064-06