任春宇，薛書(shū)江，梁晚?xiàng)?，倪婷婷，伍生軍，宋建?/p>

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002；2.延邊州畜牧總站，延吉 133000）

·簡(jiǎn)報(bào)·

抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體的制備和鑒定

任春宇1,2，薛書(shū)江1，梁晚?xiàng)?，倪婷婷1，伍生軍1，宋建臣1

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002；2.延邊州畜牧總站，延吉 133000）

為了制備特異的抗豬附紅細(xì)胞體單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb），將純化的豬附紅細(xì)胞體抗原濃縮后免疫6周齡BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備MAb。制備的MAb分別通過(guò)抗體亞類(lèi)試劑盒、Western blot進(jìn)行單抗亞類(lèi)和特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示，共獲得了2株能穩(wěn)定分泌MAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3F7和2C4。2株MAb的亞型均為IgG2a，其腹水效價(jià)分別可達(dá)1:16 000和1:14 000。特異性檢測(cè)表明，2株MAb均能特異性地與豬附紅細(xì)胞體結(jié)合，而與弓形蟲(chóng)、豬鏈球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒均無(wú)反應(yīng)。2株MAb的獲得有望為豬附紅細(xì)胞體病的診斷和防治提供新的材料。

豬附紅細(xì)胞體；單克隆抗體；制備；鑒定

豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis，M. suis）是附著于豬紅細(xì)胞表面的細(xì)胞外寄生蟲(chóng)，可引起紅細(xì)胞損傷和畸形。豬附紅細(xì)胞體病急性臨床癥狀為發(fā)熱性急性貧血和低發(fā)病率、高死亡率的黃疸。病豬感染附紅細(xì)胞體后臨床癥狀表現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、貧血（慢性貧血至威脅生命的溶血性貧血）、繁殖障礙和免疫抑制。人類(lèi)感染附紅細(xì)胞體后可引起嗜睡、乏力、低熱、腹瀉腹痛和反復(fù)上呼吸道感染等癥狀。因此，該病嚴(yán)重危害著畜牧業(yè)發(fā)展和人類(lèi)身心健康[1-3]。目前，還沒(méi)有較成熟的附紅細(xì)胞體體外培養(yǎng)體系，豬附紅細(xì)胞體病的病原學(xué)、致病機(jī)制和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展也因此受到了限制。而附紅細(xì)胞體的診斷方法，尤其是血清學(xué)檢測(cè)方法還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。MAb具有特異性強(qiáng)、效價(jià)高和純度高的特點(diǎn)，在畜禽動(dòng)物疫病的診斷和治療方面，具有較為廣闊的應(yīng)用前景[4-7]。鑒于此，本試驗(yàn)應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備和鑒定了2株附紅細(xì)胞體特異性MAb，旨在為豬附紅細(xì)胞體病的診斷、鑒別診斷及防治提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、聚乙二醇（MW 1450）、弗氏佐劑、HAT和HT選擇性培養(yǎng)基、MAb亞類(lèi)鑒定試劑盒均購(gòu)自于Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶均購(gòu)自Corstar公司。6周齡BALB/c小鼠購(gòu)自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并培養(yǎng)。

1.2 抗原的制備

無(wú)菌操作采取豬抗凝血，制成血涂片經(jīng)姬姆薩氏染色鏡檢，再經(jīng)PCR進(jìn)一步檢測(cè)診斷，結(jié)合臨床癥狀綜合判定。將判定陽(yáng)性的樣本按照朱凝瑜等[8]的方法進(jìn)行分離純化附紅細(xì)胞體。純化后的病原經(jīng)超聲破碎15 min，10 000×g離心30 min，收集上清即為抗原。采用BCA法檢測(cè)抗原濃度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物免疫

取附紅細(xì)胞體抗原與弗氏佐劑等量混合乳化，免疫6周齡BALB/c小鼠。每只小鼠每次免疫抗原劑量為100 μg。每隔14 d 免疫1次，3免后14 d 經(jīng)尾靜脈強(qiáng)化免疫。強(qiáng)化免疫3 d 后，小鼠尾靜脈采血，分離血清，間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。挑選效價(jià)較高的小鼠無(wú)菌分離脾細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。

1.4 細(xì)胞融合與骨髓瘤的篩選

取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞（10:1）在聚乙二醇的作用下融合。具體方法：取50 mL離心管將細(xì)胞混合離心，棄上清，加入1 mL預(yù)熱的聚乙二醇，輕輕旋動(dòng)離心管，緩慢加入10 mL無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，離心后棄上清；用含20%胎牛血清的HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪布在含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用間接ELISA法篩選雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法亞克隆融合成功的細(xì)胞，建株、擴(kuò)大培養(yǎng)，并置于液氮中長(zhǎng)期保存。

1.5 抗豬附紅細(xì)胞體MAb腹水的制備

選取經(jīng)產(chǎn)的健康BALB/c小鼠，腹腔注入0.5 mL液體石蠟。7 d后再向小鼠腹腔內(nèi)注射雜交瘤細(xì)胞。當(dāng)小鼠腹圍明顯膨大，呼吸困難時(shí)，無(wú)菌抽取腹水，小劑量制備MAb。

1.6 MAb抗體亞型的鑒定

按照Sigma公司單抗亞型鑒定試劑盒所附帶的說(shuō)明書(shū)操作流程，對(duì)所制備的MAb在亞型上進(jìn)行鑒定。

1.7 腹水MAb的效價(jià)測(cè)定

將小鼠腹水MAb自1:1000開(kāi)始進(jìn)行稀釋，分別稀釋至1:1000、1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10 000、1:12 000、1:14 000、1:16 000、18 000、1:20 000，應(yīng)用間接ELISA方法對(duì)腹水單抗的抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 MAb的特異性檢測(cè)

將附紅細(xì)胞體、RH株弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）、豬鏈球菌（Streptoco-ccus suis）、豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）、豬呼吸與繁殖綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病原體抗原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。將膜用5%脫脂乳封閉，4℃封閉過(guò)夜；PBST洗膜3次；以1:500稀釋的2株制備的單抗為一抗，37℃孵育2 h；PBST洗膜3次；HRP標(biāo)記的二抗用PBST稀釋1:5000，37℃孵育2 h；PBST洗膜3次；顯色、存圖，從而評(píng)定所制備的附紅細(xì)胞體MAb的特異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的篩選和克隆

融合后的細(xì)胞株經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)，對(duì)結(jié)果為陽(yáng)性的細(xì)胞孔，利用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。通過(guò)反復(fù)克隆檢測(cè)獲得10株成功雜交的細(xì)胞株，其中2株抗體分泌穩(wěn)定、效價(jià)最高，將該2株雜交瘤細(xì)胞株命名為3F7和2C4。

2.2 MAb的亞型鑒定

按照單抗亞型鑒定試劑盒操作流程對(duì)制備的3F7和2C4 2株單抗的抗體亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明3F7和2C4株單抗的抗體亞型均為IgG2a。

2.3 單抗腹水的效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用間接ELISA法對(duì)小鼠的腹水MAb的抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明3F7株的MAb腹水的ELISA抗體效價(jià)達(dá)1:16 000，2C4株的MAb腹水的ELISA抗體效價(jià)達(dá)1:14 000。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)附紅細(xì)胞體單克隆抗體制備和應(yīng)用方面取得了一些進(jìn)展。李玉峰等[9]利用附紅細(xì)胞體重組蛋白對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗MSG1蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)一步分析表明，2 株單抗所識(shí)別的抗原位點(diǎn)是相同的。得到單抗后，李玉峰等[9]又利用此株單抗建立了阻斷ELISA診斷方法，檢測(cè)效果比較理想。張浩等[10]利用純化的附紅細(xì)胞體抗原免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得了5株分泌抗豬附紅細(xì)胞體純化抗原MAb的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)進(jìn)一步鑒定，5株單抗只能識(shí)別附紅細(xì)胞體的54.6 kDa和27.4 kDa兩個(gè)蛋白抗原。為了獲得更多的針對(duì)附紅細(xì)胞體不同抗原位點(diǎn)的MAb，本研究選擇的抗原為附紅細(xì)胞體全病原體抗原，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，經(jīng)過(guò)篩選獲得了3F7株和2C4株2株能穩(wěn)定分泌的，效價(jià)較高的雜交瘤細(xì)胞株。

2.4 MAb的Western blot分析結(jié)果

2株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗所識(shí)別的蛋白抗原是不同的，其中3F7株單抗可識(shí)別約40 kDa蛋白抗原，2C4株單抗可識(shí)別約33 kDa蛋白抗原，見(jiàn)圖1。2株單抗能與附紅細(xì)胞體抗原蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，與弓形蟲(chóng)、豬鏈球菌、豬肺炎支原體和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒等病原體抗原不發(fā)生交叉反應(yīng)（圖1）。

Hoelzle等[11]利用感染附紅細(xì)胞體前后的豬血清進(jìn)行免疫印跡，印跡辨別了附紅細(xì)胞體的抗原成分。研究證明附紅細(xì)胞體至少表達(dá)了8個(gè)不同分子量大小的蛋白質(zhì)抗原，分別為p33、p40、p45、p57、p61、p70、p73、p83。本試驗(yàn)所篩選的2株單抗，抗體亞型經(jīng)檢測(cè)均為IgG2a亞型。但2株單抗所識(shí)別的蛋白質(zhì)抗原是有區(qū)別的，其中3F7株單抗可識(shí)別約40 kDa蛋白抗原，2C4株單抗可識(shí)別約33 kDa蛋白抗原。2株單抗所識(shí)別的蛋白抗原疑似與Hoelzle等[11]報(bào)道的8個(gè)蛋白抗原中的p33、p40相符合。另外，在免疫印跡時(shí)，2C4株單抗識(shí)別33 kDa蛋白抗原外，在其上面還有1條微弱條帶顯現(xiàn)。分析原因，一方面可能由于33 kDa蛋白抗原帶和其上方的抗原帶具有相同的抗原決定簇，被2C4株單抗所識(shí)別；另一方面可能是33 kDa蛋白抗原帶顯色較重，影響到相鄰的抗原帶，使其得以顯現(xiàn)。

綜上所述，本研究成功制備了2株抗豬附紅細(xì)胞體MAb，并對(duì)2株單抗進(jìn)行了抗體亞類(lèi)的鑒定和特異性的檢測(cè)。該結(jié)果不僅可以為附紅細(xì)胞體的鑒別診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后深入開(kāi)展豬附紅細(xì)胞體病防治研究提供了工具。

圖1 單抗3F7和2C4株的Western blot分析Fig.1 Western blot analysis of monoclonal antibody 3F7 and 2C4

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GENERATION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST MYCOPLASMA SUIS

REN Chun-yu1,2, XUE Shu-jiang1, LIANG Wan-feng1, NI Ting-ting1, WU Sheng-jun1, SONG jian-chen1
(1. Agricultural College, Yanbian University, Yanji 133002, China; 2. Yanbian State Animal Husbandry Station, Yanji 133000, China)

In order to generate monoclonal antibodies (MAbs) againstMycoplasma suis, 6-week-old BALB/c mice were immunized with purified and concentratedM. suisantigen and antibody secreting hybridomas were obtained by fusing splenocytes and myeloma cells.Two strains of stable hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies were obtained and designated as 3F7 and 2C4. Both strains were IgG2a as determined using the antibody subclass kit. The antibody titers of ascites were up to 1:16 000 and 1:14 000, respectively.The specificity test showed that both MAbs reacted withM. suisantigen in Western blot but did not recognize antigens ofToxoplasma gondii,Streptococcus suis,Mycoplasma hyopneumoniaeand Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. The availability of these MAbs againstM. suiswould provide biological materials for the diagnosis and prevention of eperythrozoonosis.

Mycoplasma suis; monoclonal antibody; preparation; identification

S855.95

B

1674-6422（2017）06-0056-04

2017-02-06

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31460657）；吉林省科技廳青年科研基金項(xiàng)目（20150520129JH）

任春宇，男，碩士，主要從事動(dòng)物養(yǎng)殖與疾病研究

宋建臣，E-mail：jcsong@ybu.edu.cn