李雅楠 ，閆宇 ，王銘 ，劉芳 ，肖永紅

（華北理工大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.臨床醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000）

棕櫚酸對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1刺激的肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響*

李雅楠 1，閆宇 2，王銘 1，劉芳 1，肖永紅 1

（華北理工大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院，2.臨床醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000）

目的研究棕櫚酸對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）刺激的肝星狀細(xì)胞（HSC）增殖、凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）蛋白表達(dá)的影響。方法將液氮保存下的肝星狀細(xì)胞株，于37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，同步化后將細(xì)胞分為5組：空白組、TGF-β1（5 ng/ml）組、TGF-β1+低、中、高劑量棕櫚酸組，即5 ng/ml TGF-β1刺激24 h，再分別加入50、100及200 μmol/L不同劑量棕櫚酸作用24 h后，用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定Caspase-12蛋白表達(dá)。結(jié)果不同濃度棕櫚酸均能抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），且隨著劑量的增加，細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）降低，低、中、高劑量組分別為76.56%、60.93%和34.37%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。透視電鏡發(fā)現(xiàn)，不同劑量棕櫚酸組出現(xiàn)細(xì)胞核變小，細(xì)胞出現(xiàn)大量線粒體空泡，染色質(zhì)邊集等典型凋亡表現(xiàn)?？瞻捉M、TGF-β1組、TGF-β1+低、中、高劑量棕櫚酸組凋亡率分別為（3.32±0.29）%、（1.70±0.14）%、（7.26±0.46）%、（11.24±0.52）%及（15.55±0.31）%，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著棕櫚酸劑量的增加，細(xì)胞Caspase-12蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。結(jié)論棕櫚酸能抑制細(xì)胞增殖，增加Caspase-12蛋白表達(dá)，促進(jìn)HSC凋亡。

肝星狀細(xì)胞；棕櫚酸；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是對(duì)慢性肝損傷的愈合反應(yīng)，為一個(gè)可逆的過(guò)程[1]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝臟分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrixc，ECM）的主要細(xì)胞，HSC 激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞是HF發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[2]。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta-1，TGF-β1）可以激活HSC并增加多種促纖維化因子的表達(dá)，在肝纖維化中起重要作用[3]。如何逆轉(zhuǎn)HF的進(jìn)程是抗HF研究的重點(diǎn)之一。近年來(lái)，針對(duì)誘導(dǎo)活化的HSC凋亡成為研發(fā)抗HF藥物的熱點(diǎn)。棕櫚酸是一種動(dòng)植體內(nèi)常見(jiàn)的高級(jí)飽和脂肪酸，有研究報(bào)道[4]，棕櫚酸刺激巨噬細(xì)胞的脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白（A-FABP）表達(dá)增加，可引起巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡，從而發(fā)揮促動(dòng)脈粥樣硬化作用。亦有研究報(bào)道[5-6]，棕櫚酸通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，且呈濃度和時(shí)間依賴性降低成骨細(xì)胞增殖活性，增加細(xì)胞凋亡，增高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，但其具體機(jī)制目前尚不明確。本研究用棕櫚酸作用于經(jīng)TGF-β1刺激的HSC，觀察細(xì)胞增殖、凋亡及ERS標(biāo)志性蛋白Caspase-12的變化，旨在從ERS途徑探討棕櫚酸對(duì)HSC凋亡的影響，以為HF的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

表型為活化的HSC株，從四氯化碳刺激的大鼠肝細(xì)胞中分離并獲得永生性。

1.1.1 藥品與試劑棕櫚酸（購(gòu)自北京百威靈公司），二甲基亞砜（DMSO）、青霉素及鏈霉素混合液（雙抗）（美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)），胎牛血、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液及含體積分?jǐn)?shù)0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶（購(gòu)自美國(guó)BI公司），TGF-β1（批號(hào)：PHG9204，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（美國(guó)Arigo公司），兔抗鼠Caspase-12一抗（武漢博士德有限公司），F(xiàn)ITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ι（購(gòu)自美國(guó)BD公司）。

1.1.2 儀器3111細(xì)胞孵育箱（美國(guó)Thermo公司），F(xiàn)ACScalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝帝公司），AC24S1生物安全柜（新加坡ESCO公司），TS100F倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司），Universal HoodⅡ凝膠成像分析儀，7500透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將存放于液氮中的細(xì)胞復(fù)蘇傳代培養(yǎng)于含有6%胎牛血清、1%雙抗（100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）DMEM 高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中進(jìn)行孵育。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿密度達(dá)到80%時(shí)，胰蛋白酶進(jìn)行傳代并接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理空白組，TGF-β1組，TGF-β1+低、中、高劑量棕櫚酸組?？瞻捉M加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，TGF-β1組加入5 ng/ml TGF-β1作用細(xì)胞48 h，TGF-β1+低、中、高劑量棕櫚酸組先用5 ng/ml TGF-β1作用細(xì)胞24 h，再分別加入50、100及200 μmol/L棕櫚酸，培養(yǎng)24 h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)的改變。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)HSC增殖 [7]細(xì)胞經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)后，以2.5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔200 μl細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔并在37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行孵育48 h，在培養(yǎng)結(jié)束前，每孔加入20 μl MTT避光孵育4 h，4 h之后棄去上清液，加入200 μl DMSO，避光震蕩10 min后酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處讀取光密度值（OD），計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）RGR= 實(shí)驗(yàn)組OD490/對(duì)照組OD490×100%。

1.2.4 透視電子顯微鏡觀察HSC超微結(jié)構(gòu)的改變[8]將細(xì)胞處理后進(jìn)行消化、離心，預(yù)冷的PBS洗3遍，戊二醛4℃固定過(guò)夜。然后用PBS緩沖液洗2 h，鋨酸固定1.5 h，PBS再次清洗2 h，然后依次經(jīng)過(guò)酒精（30%、50%、70%、90%、100%）脫水，樹(shù)脂包埋，AOE型鉆石切片機(jī)進(jìn)行超薄切片，枸櫞酸鉛，醋酸鈾雙染，透視電子顯微鏡觀察HSC細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.2.5 AV/PI雙染檢測(cè)HSC凋亡[9]細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，預(yù)冷PBS清洗3遍，胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心，沉淀細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS再次清洗3遍；預(yù)留1/3空白組細(xì)胞，不加任何染料，作為陰性對(duì)照組，剩下細(xì)胞加入1×Binding buffer 195 μl+5 μl An-nexin V，輕輕吹打進(jìn)行混勻，避光孵育30 min，離心沉淀細(xì)胞，棄上清液，加入1×Binding buffer 195μl+5 μl PI，輕輕吹打混勻，之后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HSC內(nèi)Caspase-12蛋白表達(dá)[9]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，接種在帶有玻片的6孔板內(nèi)，按照各處理組操作完成后，將培養(yǎng)板孔中的蓋玻片取出，PBS沖洗2次，用4%多聚甲醛固定，按SP法試劑盒操作方法進(jìn)行Caspase-12蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色后，顯微鏡下觀察后攝片。結(jié)果判定：以胞漿棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

圖像分析：將染色后的細(xì)胞爬片經(jīng)Image-pro plus專業(yè)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，200倍視野下每組圖片隨機(jī)選取6個(gè)視野，取其積分光密度值作為Caspase-12蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況

經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，各組OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=195.25，P=0.000），TGF-β1組與空白組比較OD值增高（P＜0.05）；不同濃度棕櫚酸均抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），且隨著劑量的增加，細(xì)胞RGR降低，低、中、高劑量棕櫚酸組，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 HSC細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的改變

空白組細(xì)胞體積較大，輪廓不規(guī)則，伸展性好，周緣伸出密集不規(guī)則的樹(shù)枝狀偽足。胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)正常微絨毛、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和細(xì)胞核（見(jiàn)圖1A）；TGF-β1組和空白組無(wú)差異，有完整的細(xì)胞器，細(xì)胞核處于分裂相，染色質(zhì)分布均勻（見(jiàn)圖1B）；TGF-β1+低劑量棕櫚酸組，細(xì)胞表面微絨毛消失，表面平滑，胞漿收縮（見(jiàn)圖1C）；TGF-β1+中劑量棕櫚酸組染色質(zhì)凝集、濃縮（見(jiàn)圖1D）；TGF-β1+高劑量棕櫚酸組染色質(zhì)密度增加，沿核膜邊集，厚薄不均，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞核變小等典型細(xì)胞凋亡特征（見(jiàn)圖1E）。

2.3 各處理組細(xì)胞間凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各處理肝星狀細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，不同處理組間細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=707.27，P=0.000），TGF-β1組凋亡率低于空白組（P＜0.05）；隨著棕櫚酸劑量加大，細(xì)胞凋亡率增加。見(jiàn)表2。

2.4 HSC內(nèi)Caspase-12蛋白表達(dá)

不同處理組HSC免疫組織化學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖3。與空白組比較，TGF-β1組HSC的細(xì)胞漿染色深淺不明顯（見(jiàn)圖3B）；低、中、高劑量棕櫚酸細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色，且隨著劑量的增加，細(xì)胞漿棕黃色逐漸加深（見(jiàn)圖3C～E）。與空白組比較，TGF-β1組Caspase-12蛋白表達(dá)未見(jiàn)差異（P＞0.05），不同劑量棕櫚酸使HSC中Caspase-12蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表1 不同處理組HSC吸光度的改變 （n=5，±s）

表1 不同處理組HSC吸光度的改變 （n=5，±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與 TGF-β1組比較，P＜0.05；3）與TGF-β1+低劑量棕櫚酸組比較，P＜0.05；4）與TGF-β1+中劑量棕櫚酸組比較，P＜0.05

空白組 1.28±0.13 100.00 TGF-β1組 1.85±0.111） 144.00 TGF-β1+棕櫚酸組低0.98±0.081）2） 76.56 195.25 0.000中0.78 ±0.041）2）3） 60.93高0.44 ±0.031）2）3）4） 34.37

圖1 透視電子顯微鏡下各處理組細(xì)胞的形態(tài)變化

圖2 不同處理組HSC凋亡散點(diǎn)圖

表2 不同處理組HSC凋亡率的改變 （n=3，%，±s）

表2 不同處理組HSC凋亡率的改變 （n=3，%，±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與 TGF-β1組比較，P＜0.05；3）與TGF-β1+低劑量棕櫚酸組比較，P＜0.05；4）與TGF-β1+中劑量棕櫚酸組比較，P＜0.05

空白組 3.32±0.29 TGF-β1組 1.70±0.141）TGF-β1+棕櫚酸組低7.26±0.461）2） 707.27 0.000中11.24±0.521）2）3）高15.55±0.311）2）3）4）

圖3 各處理組細(xì)胞中Caspase-12蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)）

表3 各組HSC中Caspase-12蛋白表達(dá) （n=6，±s）

表3 各組HSC中Caspase-12蛋白表達(dá) （n=6，±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與 TGF-β1組比較，P＜0.05；3）與TGF-β1+低劑量棕櫚酸組比較，P＜0.05

空白組 4 827.12±116.10 TGF-β1組 4 845.49±131.27 TGF-β1+棕櫚酸組低6 545.90±205.891） 517.52 0.000中8 352.85±212.461）2）高9 619.55±114.641）2）3）

3 討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，HF形成過(guò)程中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞是HSC。TGF-β1刺激HSC可作為體外的HF模型，可以用于進(jìn)行HSC基因表達(dá)調(diào)控、抗纖維化藥物作用及纖維化發(fā)生機(jī)制等研究[3]。促進(jìn)活化的HSC凋亡，有助于逆轉(zhuǎn)HF。棕櫚酸是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的飽和脂肪酸，又稱十六烷酸。有結(jié)果表明，棕櫚酸對(duì)βTC6細(xì)胞增殖率及胰島素的合成有抑制作用，并且呈時(shí)間-劑量依賴性作用，證實(shí)棕櫚酸對(duì)βTC6細(xì)胞的毒性損傷作用[10]。本研究用不同劑量棕櫚酸作用于經(jīng)TGF-β1刺激的HSC，MTT結(jié)果顯示，低、中、高劑量棕櫚酸增殖率依次降低，說(shuō)明棕櫚酸明顯抑制HSC增殖。

PARK等[11]發(fā)現(xiàn)，HSC經(jīng)棕櫚酸處理后其線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較對(duì)照組疏松，當(dāng)加入Caspase、p53或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑能使細(xì)胞增殖水平恢復(fù)。表明棕櫚酸能抑制細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞凋亡、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)[5]，棕櫚酸可誘導(dǎo)包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與棕櫚酸誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡過(guò)程。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在棕櫚酸誘導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、胰島細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮重要作用[12-14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是繼死亡受體活化和線粒體損傷之后第3條介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中ERS有1條特有Caspase-12途徑，Caspase-12與其他的Caspases一樣以無(wú)活性的酶原形式存在。ERS引起Caspase-12激活，激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9，活化的Caspase-9激活Caspase-3等效應(yīng)Caspases，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。BITKO等[15]研究發(fā)現(xiàn)，由呼吸道合胞病毒引起的A549人肺上皮細(xì)胞凋亡與Caspase-12活化及ERS有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)法發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量棕櫚酸上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Caspase-12表達(dá)水平。

研究結(jié)果表明，棕櫚酸能抑制細(xì)胞增殖，增加Caspase-12蛋白表達(dá)，促進(jìn)HSC凋亡。用棕櫚酸干預(yù)可能為抗纖維化的治療帶來(lái)了新的提示。

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Effect of palmitic acid on caspase-12 and proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells*

Ya-nan Li1,Yu Yan2,Ming Wang1,Fang Liu1,Yong-hong Xiao1
(1.College of Public Health,2.College of Clinical Medicine,North China University of Science and Technology;Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of palmitic acid (PA)on caspase-12 and proliferation and apoptosis in rat hepatic stellate cells (HSCs)when stimulated by transforming growth factor-β1(TGF-β1).MethodsHSCs were randomly divided into five groups:Sham group,TGF-β1group,TGF-β1+low PA group,TGF-β1+middle PA group and TGF-β1+high PA group.HSCs were stimulated by TGF-β1(5 ng/ml)for 24 hours followed by co-incubation with PA under different doses(50,100,and 200 umol/L).No intervention was performed in Sham group.Cell proliferation was detected by MTT;morphological manifestations of cells were obtained by transmission electronmicroscope;apoptosis rate was determined by flow cytometry;expression levels of caspase-12 was measured by Immunohistochemistry.ResultsCellular proliferation was significantly inhibited with PA treatment in a dose dependent manner(P＜0.05).Transmission electronmicroscope showed typical apoptotic features such as small nuclei,large numbers of mitochondria vacuoles and obvious edge sets of DNA.Treatment of PA dramatically increased apoptosis rate when compared with TGF-β1group[(7.26±0.46)%vs(1.70±0.14)%,P＜0.05;(11.24±0.52)%vs(1.70±0.14)%,P＜0.05;(15.55±0.31)%vs(1.70±0.14)%,P＜0.05].Expression of caspase-12 protein increased significantly with PA in dose dependent manner (P＜0.05).ConclusionPA inhibits cellular proliferation through promoting caspase-12 mediated apoptosis in HSCs.

hepatic stellate cell;palmitic acid;proliferation;apoptosis;caspase-12

R575.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.003

1005-8982（2017）30-0015-06

2017-07-08

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No：H2015209043）

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（王榮兵 編輯）