岳朝馳 ，楊向東 ，李俊 ，陳小朝 ，屈景輝

（1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 中醫(yī)科,四川 瀘州 646000；2.成都肛腸?？漆t(yī)院結直腸外科，四川 成都 610015）

臨床研究·論著

胃饑餓素對結腸癌細胞增殖和侵襲的影響及機制探討

岳朝馳 1，楊向東 2，李俊 1，陳小朝 2，屈景輝 2

（1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 中醫(yī)科,四川 瀘州 646000；2.成都肛腸專科醫(yī)院結直腸外科，四川 成都 610015）

目的探討胃饑餓素（Ghrelin）對結腸癌細胞增殖、侵襲的影響及作用機制。方法收集90例行手術切除的結腸癌（CRC）組織及癌旁組織，免疫組織化學染色檢測組織Ghrelin表達，分析Ghrelin表達與結腸癌患者臨床資料、生存預后的關系。按照轉染類型將細胞分為3組：空白對照組（WT）、陰性對照組（NC）和sh-Ghrelin轉染組。采用短發(fā)夾RNA（shRNA）技術抑制結腸癌HT29、SW480細胞Ghrelin表達，CCK-8法檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞周期及早期凋亡的情況，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，Western blot檢測磷脂酰肌醇 3- 激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）表達水平。結果結腸癌組織Ghrelin高表達率為64.4%（58/90），癌旁組織Ghrelin高表達率為27.8%（25/90），兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2=24.347，P=0.001）。腫瘤直徑≥5 cm組Ghrelin高表達率高于腫瘤直徑＜5 cm組，Ⅲ、Ⅳ期組Ghrelin高表達率高于Ⅰ、Ⅱ組，淋巴結轉移組Ghrelin高表達率高于無淋巴結轉移組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Ghrelin表達與性別、年齡及腫瘤分級無關（P＞0.05）。生存曲線分析顯示，Ghrelin高表達組總生存期和無病生存率均低于Ghrelin低表達組（P＜0.05）。在結腸癌HT29和SW480細胞中，sh-Ghrelin組細胞增殖能力低于NC組和WT組，處于S期比例、早期凋亡比例高于NC組和WT組（P＜0.05）。處于G0/G1期比例低于NC組和WT組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。sh-Ghrelin組細胞遷移距離、侵襲細胞數(shù)少于NC組和WT組（P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，在HT29、SW480細胞中，sh-Ghrelin組PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白相對表達量低于NC組和WT組（P＜0.05），NC組、WT組間PI3K、Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論結腸癌組織Ghrelin表達上調，并與結腸癌患者生存預后有關。干擾Ghrelin表達能夠抑制結腸癌細胞增殖、侵襲，其作用機制可能與抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路有關。

胃饑餓素；結腸癌；增殖；細胞周期；侵襲；信號通路

結腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤，居癌癥相關死亡的第4位[1]。盡管結腸鏡等腔鏡技術的發(fā)展和普及有利于結腸癌早期發(fā)現(xiàn)，然而據(jù)世界衛(wèi)生組織調查顯示[2]，全球每年結腸癌發(fā)病人口依然＞100萬，其中，60%的CRC患者確診時已是中晚期。即使給予手術、放、化療等，結腸癌患者遠期生存依然不容樂觀。因此了解結腸癌的發(fā)病機制具有重要的臨床意義。胃饑餓素（Ghrelin）[3-4]是由胃合成和分泌的一種生長激素，在調控人體食欲、食物攝取及機體能量平衡方面發(fā)揮重要作用。近年來有研究報道[5-6]，胃饑餓素對不同細胞的增殖和遷移有不同的影響，如胃饑餓素能夠促進胰腺癌細胞的增殖，但對肺癌細胞則有抑制作用。也有報道稱[7]，饑餓素能促進腸道惡性腫瘤的發(fā)生和進展，結腸癌患者血清胃饑餓素水平高于正常人群，并且胃饑餓素水平與患者預后密切相關。但是關于胃饑餓素與結腸癌發(fā)病的關系及作用機制尚未見報道。鑒于此，本研究分別檢測結腸癌組織和細胞胃饑餓素表達水平，并探討不同胃饑餓素表達水平對結腸癌細胞增殖、侵襲的影響及作用機制，旨在為結腸癌的預防、治療和診斷提供潛在的作用靶點。

1 資料與方法

1.1 樣本收集

選取2010年4月-2011年4月本院收治的90例結腸癌患者。納入標準：①入組前未接受任何抗癌治療；②入院后擬行手術治療；③術前簽署知情同意書，并自愿捐獻組織樣本供本研究使用；④術后經病理學確診。排除標準：合并其他惡性腫瘤、嚴重自身免疫性疾病及不宜或拒絕手術者。所有患者術中切除結腸癌組織及配對的癌旁組織（距癌組織切緣＞5 cm），組織樣本取出后分成兩部分，一部分立即置于液氮中保存，另外一部分用10%甲醛固定用于免疫組織化學（免疫組化）染色。術后對患者進行電話隨訪或門診復查，定義無病生存期（disease-free survival，DFS）：從術后第2天開始至疾病復發(fā)、遠處轉移或因結腸癌死亡的時間；總生存期（overall survival，OS）：從術后第2天開始至因任何原因引起死亡的時間。本研究隨訪截止時間2016年12月31日。本研究樣本的采集、患者的治療均得到醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 細胞來源

人結腸上皮細胞HIEC、人結腸癌細胞HT29及SW480均購自美國菌種保藏中心（美國弗吉尼亞州），所有細胞均接種于DMEM培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific公司）。培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100u/ml青霉素及100u/ml鏈霉素，在培養(yǎng)箱中37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)。每隔2天更換1次培養(yǎng)基，細胞融合達80%～90%時傳代，選擇傳＞3代細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗試劑

pGPU6/GFP/Neo-sh-Ghrelin表達載體（購自上海吉瑪制藥技術有限公司），短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，正向引物：5'-GUAAUGAGGAGGGCUAUUA-3'，反 向 引 物 ：5'-CGU AUGCGCGUACUCUAAUTT-3'。Lipofectamine 2000TM購自（美國Invitrogen公司），Trizol試劑、RIPA裂解液（購自廣州碧云天生物技術研究所），逆轉錄試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒（購自美國Fermentas公司），CCK-8增殖活性測定試劑盒（購自長沙貝博生物科技有限公司），細胞周期檢測試劑盒（購自北京雷根生物技術有限公司），Transwell小室、Matrigel人工基底膜（購自美國Sigma公司）?？?Ghrelin（1∶100，武漢博士德生物公司）、抗磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）（1∶50，上海生工生物工程有限公司）、抗哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）（1∶500，海門碧云天生物技術研究所）、抗磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylation mTOR，p-mTOR）（phosphorylationAkt，p-Akt）（1∶200，海門碧云天生物技術研究所）、抗蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）（1∶100，上海生工生物工程有限公司）、抗磷酸化蛋白激酶B（phosphorylation Akt，p-Akt）（1∶100，上海生工生物工程有限公司）、抗β-actin（1∶200，武漢博士德生物公司），流式細胞儀（購自美國BD公司），PVDF膜、ECL化學發(fā)光試劑盒（購自美國Millipore公司）。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化染色檢測結腸癌組織Ghrelin表達將甲醛固定的結腸組織和癌旁組織常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm的切片，脫蠟至水，加熱修復抗原，加入H2O2消除內源性過氧化物酶。滴加2、3滴Ghrelin抗體，4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加1、2滴二抗，37℃孵育15 min，DAB顯色液顯色10 min，顯微鏡下觀察圖像。染色強度參考以下標準，0分：無染色，1分：弱陽性染色，2分：陽性染色，3分：強陽性染色。陽性細胞比例參考以下標準，1分：0～25%，2分：26%～75%，3分：76%～100%。每張切片隨機選擇5個視野，由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法進行評價，若判定結果不一致，則由第3位醫(yī)師做出最后判定。免疫染色評分（immunoreactive score，IRS）以染色強度和陽性細胞比例綜合判定，兩者相乘，IRS評分0～9分，其中0分為陰性，1～2分為低表達，3～9分為高表達。

1.4.2 細胞轉染轉染前24 h，將HT29和SW480鋪于6孔板，細胞密度為1×106個/孔，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞達80%融合度，利用Lipofectamine 2000TM轉染質粒。按照轉染類型將細胞分為3組：空白對照組（WT）、陰性對照組（NC）和 sh-Ghrelin轉染組，空白對照組加入等量Lipofectamine 2000TM試劑，陰性對照組加入陰性對照的質粒和Lipofectamine 2000TM試劑，sh-Ghrelin轉染組加入sh-Ghrelin質粒和Lipofectamine 2000TM試劑。質粒和Lipofectamine 2000TM試劑按照1∶3比例進行配置，轉染6 h后，再向每孔中加入300μl FBS，轉染24h后更換為DMEM培養(yǎng)基，轉染72h后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 Ghrelin mRNA表達以評價轉染效率。

1.4.3 qRT-PCR檢測Ghrelin mRNA表達取生長旺盛期細胞，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入Trizol試劑，按照試劑說明書依次氯仿抽提、異丙醇沉淀、乙醇洗滌；將1 μg總RNA逆轉錄為cDNA，參考SYBR GREEN定量PCR說明書進行PCR反應，總反應體系30μl。反應條件：95℃預變性5min，95℃變性 5 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，總計40個循環(huán)。Ghrelin正向引物：5'-GTTGGGTGTGATG GAGGGAAG-3'，反向引物：5'-CCTTCTCAGTGGTGC AACTGTG-3'；β-actin 正向引物：5'-CACCATTGGC AATGAGGGGTTC-3'，反向引物：5'-AGGTCTTTGCG GATGTCCACGT-3'。定量分析結果以Ct值表示，以β-actin作為內參，2-△△Ct作為目的基因相對表達量。

1.4.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性將細胞鋪于96孔板中（2×103個/孔），同時設置試劑空白對照孔和細胞空白對照空，孵育24 h后于每孔中加入預先配置好的CCK-8試劑（10 μl/孔），37℃繼續(xù)孵育，于450 nm處檢測吸光度值，并以標準曲線讀出樣品的光密度值（OD）。

1.4.5 流式細胞術檢測細胞生長周期細胞鋪于6孔板中（1×106個/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集貼壁細胞，加入75%乙醇固定，4℃過夜；第2天棄去固定液，加入RNA酶以消除RNA的干擾；再加入PI染液（10 μl），上機檢測，每次實驗操作3次，取平均值。

1.4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡將細胞鋪于6孔板中（1×106個/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集貼壁細胞，依次加入 Annexin V（400μl）和 Annexin V-FITC（5 μl）染液，避光孵育 15 min，再加入 PI染液（10 μl），上機檢測，每次實驗操作3次，取平均值。

1.4.7 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力用不含血清的培養(yǎng)基將轉染后細胞濃度調整為1.0×105個/ml，Transwell上室每孔接種150 μl細胞，下室加入600 μl含有20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基作為趨化劑，37℃培養(yǎng)48 h，輕輕拭去表面非侵襲性細胞，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色10 min，顯微鏡下統(tǒng)計穿透濾膜的細胞數(shù)。

1.4.8 劃痕實驗檢測細胞遷移能力將細胞接種于6孔板，Marker筆在培養(yǎng)板后均勻劃間距為0.5 cm的橫線，每孔中鋪1×105個細胞，細胞融合度≥80%時用無菌用移液槍槍頭在單層細胞沿底部劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3次后，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下測量劃痕愈合的寬度。

1.4.9 Western blot檢測 PI3K、Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR蛋白表達取對數(shù)生長期細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入離心管中，再加入1 ml RIPA裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃條件下離心15 min，BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白純度。將20 μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉膜，加入5%脫脂牛奶孵育封閉2 h。分別加入PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 及 p-mTOR 抗體，4℃孵育 24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS沖洗3次，按照ECL化學發(fā)光顯影試劑盒顯影，以β-actin作為內參照，分析目的條帶相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，計數(shù)資料以構成比（%）表示，分析用χ2檢驗，Kaplan-Meier法繪制ROC曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ghrelin在肺癌組織中表達

免疫組化染色結果顯示，Ghrelin蛋白主要位于細胞漿和細胞質，出現(xiàn)棕色顆粒為陽性細胞（見圖1）。結腸癌組織Ghrelin高表達率為64.4%（58/90），癌旁組織Ghrelin高表達率為27.8%（25/90），結腸癌組織Ghrelin高表達率高于癌旁組織（χ2=24.347，P=0.001）。

2.2 Ghrelin表達與結腸癌患者臨床資料及生存預后的關系

Ghrelin表達與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移有關，腫瘤直徑≥5 cm組Ghrelin高表達率高于腫瘤直徑＜5 cm組，Ⅲ、Ⅳ期組Ghrelin高表達率高于Ⅰ、Ⅱ組，淋巴結轉移組Ghrelin高表達率高于無淋巴結轉移組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Ghrelin表達與性別、年齡及腫瘤分級無關（P＞0.05）（見附表）。90例結腸癌患者共計有82例獲得完整隨訪，其中，低表達隨訪30例，高表達隨訪52例。生存曲線分析顯示，Ghrelin高表達總生存期和無病生存率均低于Ghrelin低表達（χ2=4.983和4.001，P=0.034和0.043）。見圖2。

2.3 靶向Ghrelin shRNA抑制目的基因mRNA的表達

圖1 結腸癌和癌旁組織Ghrelin表達 （免疫組化）

附表 Ghrelin表達與結腸癌患者臨床資料的關系

HIEC、HT29及SW480細胞Ghrelin mRNA相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（F=7.210，P=0.000）。HT29、SW480細胞Ghrelin mRNA相對表達量高于HIEC 細胞（P＜0.05），HT29、SW480細胞間 Ghrelin mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖3A）。NC、WT及sh-Ghrelin組HT29細胞和SW480細胞的Ghrelin mRNA相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（F=5.431和6.193，P=0.014和0.000），sh-Ghrelin組HT29和SW480細胞的Ghrelin mRNA相對表達量低于WT組和NC組（P＜0.05）（見圖 3B、C）。NC、WT及 sh-Ghrelin組 HT29細胞和SW480細胞的Ghrelin蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（F=4.037和5.172，P=0.031和0.025），sh-Ghrelin組HT29和SW480細胞的Ghrelin蛋白相對表達量低于WT組和NC組（P＜0.05）（見圖3D、E），證實sh-RNA轉染成功。

圖2 Ghrelin表達與結腸癌患者生存預后的關系

圖3 各組細胞Ghrelin mRNA表達水平

2.4 靶向Ghrelin shRNA抑制結腸癌細胞的增殖

對HT29和SW480細胞的CCK-8檢測結果顯示，從培養(yǎng)的24～120 h，NC組和WT組細胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；從48～120 h，sh-Ghrelin組細胞增殖能力低于NC組和WT組（P＜0.05）（見圖4A、B）。細胞周期檢測結果顯示，在HT29和SW480細胞中，sh-Ghrelin組細胞處于S期的比例高于 NC 組和 WT 組（FHT29=18.043，PHT29=0.000；FSW480=19.247，PSW480=0.000），而 NC 組、WT 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4C、D。

2.5 靶向Ghrelin shRNA促進結腸癌細胞凋亡

利用流式細胞儀檢測細胞早期凋亡情況，結果顯示NC、WT及sh-Ghrelin組HT29和SW480細胞早期凋亡比例比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.910和12.943，均P=0.000），在HT29和SW480細胞中，sh-Ghrelin組細胞早期凋亡比例高于NC組和WT組（P＜0.05），NC組、WT組間細胞早期凋亡比例比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖4 各組細胞周期和增殖

2.6 靶向Ghrelin shRNA抑制結腸癌細胞侵襲和遷移

劃痕實驗顯示，NC、WT及sh-Ghrelin組HT29、SW480細胞的遷移距離比較差異有統(tǒng)計學意義（F=75.016 和 72.940，均P=0.000），HT29、SW480 細胞中，sh-Ghrelin組細胞遷移距離少于NC組和WT組（P＜0.05），NC組、WT組間細胞遷移距離比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖 6A、B）。Transwell小室實驗結果顯示，NC、WT及 sh-Ghrelin組HT29、SW480細胞的侵襲細胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（F=25.401 和 20.745，均P=0.000），HT29、SW480 細胞中，sh-Ghrelin組侵襲細胞數(shù)少于NC組和WT組（P＜0.05），NC組、WT組間侵襲細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖6。

2.7 靶向Ghrelin shRNA抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路

Western blot檢測結果顯示，NC、WT及sh-Ghrelin組HT29細胞中PI3K、p-Akt以及p-mTOR蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（FPI3K=7.641，PPI3K=0.001；Fp-Akt=6.218，Pp-Akt=0.000；Fp-mTOR=4.732，Pp-mTOR=0.002），NC、WT 及 sh-Ghrelin組SW480細胞中PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（FPI3K=6.590，PPI3K=0.000；Fp-Akt=7.321，Pp-Akt=0.000；Fp-mTOR=5.470，Pp-mTOR=0.011）， 在 HT29、SW480 細胞中，sh-Ghrelin 組 PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量低于NC組和WT組（P＜0.05），NC組、WT 組間 PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 及 p-mTOR 蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖7。

圖5 各組細胞凋亡的影響

圖6 各組細胞遷移、侵襲能力

圖7 干擾Ghrelin表達對PI3K-Akt-mTOR信號通路相關蛋白的影響

3 討論

胃饑餓素是由胃黏膜細胞分泌的一種活性多肽，已被證實與迷走神經的興奮性有關。胃饑餓素與內源性受體結合，刺激下丘腦攝食中樞，使食欲增加和減少脂肪分解。有研究發(fā)現(xiàn)[8]，胃饑餓素能夠維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，在糖尿病及其并發(fā)癥的治療中展現(xiàn)潛在的價值。近年來大量研究指出，胃饑餓素在腫瘤的發(fā)生、進展方面發(fā)揮一定作用。杜成雄[9]報道，終末期、分化程度低的直腸癌患者血清胃饑餓素升高。TAKIGUCHI等[10]也證實，組織胃饑餓素表達水平與胃癌的浸潤深度、分化類型及TNM分期密切相關。本研究顯示，結腸癌組織Ghrelin高表達率高于癌旁組織，Ghrelin表達水平與結腸癌瘤體大小、TNM分期及淋巴結轉移有關，提示胃饑餓素在結腸癌中可能起到類似癌基因的作用。TAKIGUCHI等[11]對行根治性遠端胃切除術的胃癌患者進行隨訪觀察，結果發(fā)現(xiàn)胃饑餓素可以使患者胃排空延遲，并導致術后化療相關惡心嘔吐；血漿胃饑餓素水平越高，患者3年生存率越低。本研究對結腸癌患者術后進行規(guī)律隨訪，結果發(fā)現(xiàn)Ghrelin高表達組總生存期和無病生存率均低于Ghrelin低表達組，提示胃饑餓素亦可以作為評價結腸癌預后生存的指標之一。

為進一步探討Ghrelin對結腸癌生物學行為的影響及作用機制，本研究采用shRNA技術干擾人結腸癌細胞HT29和SW480中Ghrelin的表達，結果顯示HT29、SW480細胞Ghrelin mRNA相對表達量高于HIEC細胞，說明結腸癌細胞Ghrelin高表達，Ghrelin可能是結腸細胞惡性病變的標志物。干擾HT29、SW480細胞 Ghrelin表達，sh-Ghrelin組細胞增殖能力低于陰性對照組（NC組）和野生組（WT組），說明敲除Ghrelin基因能夠抑制結腸癌細胞的增殖能力。李振遠等[12]報道，Ghrelin參與維持核糖體的正常功能，并促進DNA的復制和相關蛋白的合成，這也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過程。抑制Ghrelin的表達，腫瘤細胞正常功能蛋白合成受阻，增殖功能也受到影響。細胞的增殖與分裂周期密切相關，本研究進一步發(fā)現(xiàn)抑制Ghrelin表達能夠引起細胞分裂阻滯S期，從而抑制結腸癌細胞的生長。有研究顯示[13]，Ghrelin能夠促進細胞周期相關基因的表達和Cyclins-CDKs復合物功能，使DNA合成加速并誘導瘤體生長。也有學者認為[14]，特異性沉默Ghrelin基因，能夠序貫性降低下游Cyclin D1基因的表達，導致調控細胞S周期轉變“檢查點”功能失調，細胞被特異性阻滯S周期。限本研究的設計方案，尚未深入探討Ghrelin對細胞周期阻滯的具體機制。

細胞凋亡是真核生物最重要的生長調控機制，也是影響細胞增殖速度的主要因素。細胞凋亡由一系列凋亡途徑所介導，細胞的凋亡增加，必然引起細胞增殖能力減弱。國外研究顯示[15]，抑制Ghrelin能夠下調凋亡抑制基因Bcl-2和p53，并激活凋亡因子Caspase家族成員（Caspase-3、Caspase-9），導致細胞凋亡加速。本研究利用流式細胞術檢測結腸癌細胞凋亡情況，結果顯示，抑制Ghrelin可以提高結腸癌細胞早期凋亡比例。但需要注意的是，對絕大多數(shù)結腸癌細胞，p53在早期已經發(fā)生突變，理論上無法參與后續(xù)的凋亡信號途徑，因此Ghrelin所介導的促凋亡效應可能與其他機制有關。有研究報道稱[16]，胃癌細胞發(fā)生EMT時，TGF-β能夠促進Ghrelin表達，而Ghrelin過表達又能反過來刺激TGF-β表達增加，使細胞獲得侵襲、遷移的能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，HT29、SW480細胞中，sh-Ghrelin組侵襲細胞數(shù)、細胞遷移距離低于NC組和WT組，說明抑制Ghrelin可以阻斷結腸癌細胞侵襲、遷移等生物學行為。但是本研究尚無法證實侵襲、遷移的抑制是否與阻斷EMT有關。

PI3K-Akt-mTOR信號通路是調控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要生物學信號轉導通路[17-18]，包括細胞周期調控、血管新生、基因的轉錄及翻譯等。激活磷脂肌醇3-激酶可以誘導蛋白激酶B（Akt）磷酸化，活化的Akt又將信號傳遞至下游底物雷帕霉素靶體蛋白，并控制諸如凋亡、轉錄及翻譯等生物學效應。研究顯示[19]，絲蘇氨酸激酶抑制劑能夠抑制PI3K-AktmTOR通路，阻斷結腸癌細胞增殖和侵襲等行為。PARK等[20]也證實，PI3K-Akt-mTOR信號通路激活程度可以作為結腸癌患者預后的重要指標。本研究顯示，結腸癌HT29、SW480細胞中，sh-Ghrelin組PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白相對表達量低于NC組和WT組，說明抑制Ghrelin表達能夠阻斷PI3KAkt-mTOR信號通路，并抑制細胞的增殖和侵襲。上述研究結果也說明Ghrelin可能是通過PI3K-AktmTOR信號通路調控結腸癌細胞增殖和侵襲等生物學行為。

綜上所述，結腸癌組織Ghrelin表達上調，并與結腸癌患者生存預后有關。干擾Ghrelin表達能夠抑制結腸癌細胞增殖、侵襲，其作用機制可能與抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路有關。

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Regulation of Ghrelin in proliferation and invasion of colon carcinoma

Chao-chi Yue1,Xiang-dong Yang2,Jun Li1,Xiao-zhao Chen2,Jun-hui Qu2
(1.Department of Traditional Chinese Medicine,Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;2.Department of Colorectal Surgery,the Anorectal Specialist Hospital of Chengdu,Chengdu,Sichuan 610015,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Ghrelin on cellular proliferation and invasion of colon carcinoma and potential mechanisms.MethodsA total of 90 patients diagnosed with colon carcinoma were included in this study,and cancer as well as paracancerous normal tissue was collected.Expression of Ghrelin wasmeasured by Immunohistochemicalstaining assay;Co-relationship analysisbetween ghrelin expression and clinical manifestation of patients including survival rate was performed.Expression of Ghrelin in colon carcinoma cell line HT29 and SW480 was genetically inhibited by short hairpin RNA (shRNA).Cellular proliferation,cell cycle as well as apoptosis,migration,and cell invasion were determined by CCK-8 assay,Flow cytometry,Wound heal assay,and Transwell assay,respectively.Expression levels of PI3K,Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR protein were measured by Western blot.ResultsExpression of Ghrelin in cancer tissue,group with tumor diameter≥5 cm,and group with tumor underⅢ～Ⅳ phase was upregulated when compared with that in paracancerous tissue,group with tumor diameter＜5 cm group,group with tumor under metastasis-free phase,respectively (P＜0.05).No correlation between Ghrelin expression and gender,age and tumor grade respectively was observed (P＞0.05).Overall survival and disease-free survival in group with highly expressed Ghrelin was significantly lower than that in group with lowly expressed Ghrelin (P＜0.05).Proliferation,migration and invasion capacity of HT29 and SW480 cells decreased while ratio of cells in S phase and early apoptosis increased significantly in sh-Ghrelin group when compared with those in NC group and WT group(P＜0.05).In HT29 and SW480 cells expression levels of PI3K,p-Akt,p-mTOR protein were dramatically down-regulated in sh-Ghrelin group when compared with those in NC group and WT group (P＜0.05).No statistical difference in the expression of PI3K,Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR protein in NC group and WT group was observed (P＞0.05).ConclusionsThe expression of Ghrelin is up-regulated in colon carcinoma tissue,which is closely associated with disease prognosis.Beneficial effect of Ghrelin is potentially mediated through inhibition of PI3K-Akt-mTOR signaling pathway.

Ghrelin;colon carcinoma;proliferation;cell cycle;invasion;signaling pathway

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.005

1005-8982（2017）30-0026-10

2017-05-04

（王榮兵 編輯）