（貴州省遵義市第一人民醫(yī)院 骨科，貴州 遵義 563003）

新型骨軟骨支架輔助Mosaicplasty技術(shù)和攜帶增強(qiáng)基因的ADSCs對(duì)大面積骨軟骨缺損的修復(fù)效果*

阮世強(qiáng)，鄧江，徐林，黃文良，田仁元

（貴州省遵義市第一人民醫(yī)院 骨科，貴州 遵義 563003）

目的考察新型骨軟骨支架輔助Mosaicplasty技術(shù)和攜帶增強(qiáng)基因的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）對(duì)大面積骨軟骨缺損修復(fù)效果。方法復(fù)制比格犬軟骨全層缺損模型，使用多枚骨軟骨支架以Mosaicplasty術(shù)填充大部分缺損后，不用內(nèi)固定，作為E組；于骨軟骨支架內(nèi)及殘留間隙處緩慢由深至淺注入骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）-ADSCs復(fù)合體作為D組；植入絲素蛋白（SF）/殼聚糖（CS）/納米羥基磷灰石（nHA）支架作為C組；植入SF/CS/nHA支架和BMP-2-ADSCs復(fù)合體作為B組；植入SF/CS/nHA支架與BMP-2-ADSCs聯(lián)合富血小板血漿（PRP）凝膠復(fù)合體作為A組。分別于術(shù)后4、8及16周各組隨機(jī)取2、2和4只比格犬在輕度麻醉狀態(tài)下，進(jìn)行組織外觀觀察，處死16周的比格犬，檢測(cè)病變軟骨部位的膠原蛋白Ⅰ和Ⅱ，體外檢測(cè)病變軟骨的極限應(yīng)力、應(yīng)變值和相應(yīng)彈性模量值。結(jié)果與E組比，A～D組的軟骨缺損表面平整，軟骨愈合較好，與B～D組比較，A組恢復(fù)最好。膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅱ表達(dá)、標(biāo)本中心相應(yīng)彈性模量值、標(biāo)本交界極限應(yīng)力和應(yīng)變值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），E組最低，A組最高。結(jié)論植入SF/CS/nHA支架與BMP-2-ADSCs聯(lián)合PRP凝膠復(fù)合體對(duì)于大面積軟骨缺損修復(fù)效果較好，值得臨床推廣。

仿生支架；鑲嵌移植術(shù)；骨軟骨缺損；富血小板血漿；組織工程

隨著社會(huì)的老齡化加快，各種難以避免的關(guān)節(jié)損傷逐漸增多，關(guān)節(jié)內(nèi)損傷引起的軟骨損傷或缺損。成人軟骨幾乎不能夠依賴自身修復(fù)，特別是較大面積的骨軟骨缺損，從而造成骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生，甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙的嚴(yán)重后果，給患者及社會(huì)造成很大的負(fù)擔(dān)。因此，如何實(shí)現(xiàn)大面積骨軟骨修復(fù)成為臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)。利用組織工程修復(fù)骨軟骨缺損已取得重大進(jìn)展，但至今沒有一種與骨軟骨更為匹配的作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的支架系統(tǒng)，尤其是對(duì)于大面積的軟骨缺損。因此，構(gòu)建一種優(yōu)良的種植體是目前急需解決的難題。目前支架材料的研究已經(jīng)取得了較大成果，但國(guó)內(nèi)外尚未研制出一種界內(nèi)公認(rèn)的理想的骨軟骨支架材料，特別是對(duì)大面積骨軟骨缺損，主要存在的問題是材料的安全性、生物力學(xué)性能、可降解性、組織相容性以及降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的影響還需進(jìn)一步的研究加以明確。大量的研究表明，絲素蛋白（silk fibroin，SF）、殼聚糖（chitosan，CS）和納米羥基磷灰石（nano hydroxyapatite，nHA）無毒無味，具有良好的生物學(xué)特性和理化性質(zhì)。SF是從蠶絲中提取的天然生物材料，可應(yīng)用于人工韌帶、軟骨、骨或神經(jīng)組織等方面[1]。但SF降解較慢、干燥時(shí)易碎裂[2]。CS是天然的高分子聚合物，結(jié)構(gòu)與軟骨基質(zhì)糖氨多糖相似，降解產(chǎn)物為氨基葡萄糖單體，目前已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3]，但CS韌性差，降解速度慢。nHA與天然骨中的無機(jī)成分相似，被認(rèn)為是骨缺損修復(fù)的理想材料[4]，但簡(jiǎn)單合成的nHA材料成型后強(qiáng)度低、孔隙度小[5]，引入到復(fù)合材料中可使材料在力學(xué)和生物學(xué)方面具有很大的應(yīng)用潛力[6]。因此，或許可將2種及2種以上材料共混制備復(fù)合支架材料可以彌補(bǔ)各自的不足，利用各種材料的互補(bǔ)特性來滿足組織工程對(duì)支架的要求[7]。然而，至今仍舊沒有一種可以作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的支架材料，因此找到一種更加適合作為骨組織支架的材料是骨組織工程研究中急需解決的難點(diǎn)之一。

本課題組在前期研究單一孔徑的SF/CS和SF/CS/nHA支架中取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然而單一孔徑支架依舊無法滿足骨與軟骨的漸進(jìn)式結(jié)構(gòu)，尤其是對(duì)大面積的軟骨缺損。本課題組利用離心與冷凍干燥相結(jié)合的方法，在成功制備梯度孔徑的骨軟骨SF/CS/nHA支架的基礎(chǔ)上，擬結(jié)合骨軟骨鑲嵌移植術(shù)將支架植入大面積骨軟骨缺損，再將攜帶目的基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）與可注射型富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）凝膠混合后注入支架和支架周圍間隙，進(jìn)一步解決殘留的骨軟骨柱間隙的整合問題，以期實(shí)現(xiàn)重建大面積骨軟骨缺損的修復(fù)，同時(shí)探明支架材料的降解、生長(zhǎng)因子控釋以及支架在體內(nèi)骨軟骨的形成機(jī)制，為制備與骨軟骨重建更匹配、更接近生理代謝特征的種植體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備

1.1.1 主要設(shè)備S-3400N型掃描電鏡（日本日立集團(tuán)），7560型電子顯微鏡（日本日立集團(tuán)），F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)B-D公司），VLP200型真空干燥機(jī)（美國(guó)Savant公司），RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司），TE2000-S型熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司），Ⅱ/03型倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司），超凈工作臺(tái)（丹麥Heto Holten公司），F(xiàn)orma 3141型二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Scientific公司），-80℃W-86L728J型超低溫冰箱（海爾集團(tuán)），-150℃MDF-1155ATN型超低溫冰箱（日本三洋電機(jī)），GDS8000型全自動(dòng)數(shù)碼成像與分析系統(tǒng)（美國(guó)Gen Genius Syngene），UHQc型超純水制備系統(tǒng)（英國(guó)萊特萊德公司），Sanyo-MSE型超聲細(xì)胞破碎儀（日本三洋電機(jī)），LC50RX型液氮罐（美國(guó)ICI公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組選用健康成年比格犬40只（購(gòu)自北京市興隆試驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，合格證號(hào)：SCXK（京）2006-0001），雌雄各半。隨機(jī)分為 A、B、C、D、E 5組，每組8只。A組：植入SF/CS/nHA雙相支架與BMP-2-ADSCs聯(lián)合PRP凝膠復(fù)合體；B組：植入SF/CS/nHA雙相支架和BMP-2-ADSCs復(fù)合體；C組：植入SF/CS/nHA雙相支架；D組：注入BMP-2-ADSCs復(fù)合體；E組：空白對(duì)照組。

1.2 離心-冷凍干燥法制備梯度孔徑SF/CS/nHA骨軟骨支架

SF脫膠、溶解及提純得2%的SF溶液，將2%SF溶液、2%CS溶液和nHA適當(dāng)比例混合，倒入準(zhǔn)備好的鑄模槽內(nèi)，于-20℃條件下5000r/min離心15min，放入-80℃中冷凍3 h，采用冷凍干燥72 h制成固體材料，支架掃描電鏡檢測(cè)顯示平均孔徑為85.67 μm，孔隙率為（91.25±2.35）%，吸水膨脹率（135.65±4.56）%。力學(xué)檢測(cè)顯示壓縮強(qiáng)度為（2.0±0.2）MPa。將制備成功的固體材料乙醇滅菌消毒，PBS緩沖液沖洗，放置4℃冰箱備用。

1.3 含BMP-2基因重組腺相關(guān)病毒（rAAV）的構(gòu)建

通過基因重組技術(shù)構(gòu)建腺相關(guān)病毒rAAV-BMP-2-EGFP，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）進(jìn)行鑒定；重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）反復(fù)感染獲得高滴度重組腺相關(guān)病毒；氯化銫密度梯度離心法純化重組腺相關(guān)病毒，測(cè)定滴度置入-150℃冰箱冷凍保存。

1.4 PRP凝膠制備

以氯胺酮15 mg/kg和地西泮1 mg/kg，于比格犬耳后3～5 cm處肌內(nèi)注射（簡(jiǎn)稱肌注），基礎(chǔ)麻醉，固定四肢后碘伏消毒皮膚，使用頭皮針采集靜脈血30 ml。采用二次離心法提取PRP，加入凝血酶及10%氯化鈣注射液制備成PRP凝膠。

1.5 比格犬細(xì)胞分離、擴(kuò)增及病毒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建復(fù)合凝膠

比格犬麻醉后備皮、消毒、鋪巾，切取頸背部皮下脂肪組織約20 g，充分剪碎，離心后接種于預(yù)置DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）的100 mm培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2飽和濕度下行原代培養(yǎng)，每天于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖情況。臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力。經(jīng)體外培養(yǎng)即可獲得約第2、3代的ADSCs。ADSCs培養(yǎng)擴(kuò)增3代后，將攜帶BMP-2的ADSCs以5×106個(gè)/ml密度的懸濁液2 ml與PRP凝膠進(jìn)行混合，即得。

1.6 梯度孔徑SF/CS/nHA支架體外培養(yǎng)

ADSCs培養(yǎng)擴(kuò)增3代后與SF/CS/nHA支架體外培養(yǎng)，將攜帶BMP-2的ADSCs與PRP凝膠混合后，注入SF/CS/nHA支架體外培養(yǎng)，即得。

1.7 復(fù)制骨軟骨全層缺損模型及各組處理

比格犬肌注速眠新0.1 ml/kg麻醉，取膝關(guān)節(jié)正中切口，顯露股骨滑車及股骨髁。用特制10 mm直徑空心鉆鉆取深5 mm的骨軟骨缺損，填塞止血。使用多枚骨軟骨支架以Mosaicplasty術(shù)填充大部分缺損后，不用內(nèi)固定，作為E組；于骨軟骨支架內(nèi)及殘留間隙處緩慢由深至淺注入BMP-2-ADSCs復(fù)合體作為D組；植入SF/CS/nHA支架作為C組；植入SF/CS/nHA支架和BMP-2-ADSCs復(fù)合體作為B組；植入SF/CS/nHA支架與BMP-2-ADSCs聯(lián)合PRP凝膠復(fù)合體作為A組，所有組別均植入或注入至關(guān)節(jié)面，沖洗關(guān)節(jié)腔后，逐層關(guān)閉切口。

1.8 指標(biāo)檢測(cè)

1.8.1 大體觀察分別于術(shù)后4、8及16周各組隨機(jī)取2、2和4只比格犬在輕度麻醉狀態(tài)下，取標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，并處死動(dòng)物。

1.8.2 PCR檢測(cè)病變軟骨的膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅱ取16周比格犬病變軟骨部位約20 mg組織楊平，用組織剪將其充分剪碎，置于勻漿機(jī)中，加入1 ml Trizol試劑，用勻漿機(jī)打勻，加入氯仿300 μl，離心，吸取上清液，加入等體積異丙醇，離心，去上清，加入75%乙醇，離心，去上清液，揮發(fā)剩余乙醇，用20 μl Nuclease free water溶解。按RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH為內(nèi)對(duì)照，通過RT-PCR對(duì)比分析膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅱ。膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅱ和GAPDH的上下游引物序列及退火溫度（見表1）。PCR 反應(yīng)體系：上下引物各 0.1 μmol，dNPT 1 μl，25 mmol/L MgCl23 μl，Taq DNA 聚合酶 3 μl，cDNA模板 3 μl，10 μl PCR 緩沖液 5 μl，總反應(yīng)體系為50 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性94℃2 min后，進(jìn)入PCR擴(kuò)增循環(huán)，變性94℃ 30 s，退火52℃ 1 min，延伸70℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)后，70℃再延伸7 min，經(jīng)凝膠圖像分析儀進(jìn)行分析，計(jì)算與GAPDH條帶的灰度比值，進(jìn)行目的基因表達(dá)的定量分析。

表1 膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅱ和GAPDH引物序列

1.8.3 力學(xué)測(cè)試取16周的比格犬軟骨標(biāo)本，采用AG1000A型電子式萬能力學(xué)試驗(yàn)儀（日本島津）檢測(cè)各組標(biāo)本極限應(yīng)力、應(yīng)變值和相應(yīng)彈性模量值。試驗(yàn)前將所有標(biāo)本置于4℃的Ringer液中1 h，試驗(yàn)過程用Ringer液滴注保持濕潤(rùn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本組織學(xué)觀察

E組：4、8周時(shí)缺損底部大量纖維細(xì)胞團(tuán)增生，未完全修復(fù)，16周軟骨缺損局部表面凹陷明顯，缺損仍遺留，與周圍正常軟骨界限清楚；D～B組：4、8周時(shí)支架開始降解，8周可見散在軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞生成，16周可見軟骨缺損內(nèi)充填以白色纖維樣組織，軟骨表面略不平整，偶見中心部分凹陷，間隙明顯縮小。A組：4、8周時(shí)可見明顯軟骨樣細(xì)胞生成，形成軟骨，16周，軟骨缺損處色澤與正常軟骨相似，軟骨表面平整，與周圍正常軟骨連接緊密、界限消失，硬度較正常軟骨無差異修復(fù)組織與周圍軟骨愈合較好，無明顯間隙存在。見圖1。

圖1 不同組比格犬膝關(guān)節(jié)恢復(fù)16周組織標(biāo)本

不同組病變膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅱ相對(duì)表達(dá)量的比較，不同組病變膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和Ⅱ相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000），與A組比較，B組膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和Ⅱ表達(dá)均降低（P=0.000），與B組比較，C組膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和Ⅱ表達(dá)均降低（P=0.000），C組和D組膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和Ⅱ表達(dá)相當(dāng)（P＞0.05），與D組比較，E組膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和Ⅱ表達(dá)均降低（P=0.000），見表 2 和圖 2～3。

表2 不同組病變膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅱ相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表2 不同組病變膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅱ相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

A組 90.5±10.1 78.1±8.3 B 組 75.4±12.6 63.8±9.1 C 組 46.8±13.9 38.0±9.3 D組 36.7±13.7 28.6±9.8 E 組 11.6±8.1 5.2±2.1 F值 27.730 49.101 P值 0.000 0.000

2.2 不同組標(biāo)本中心極限應(yīng)力、應(yīng)變值和相應(yīng)彈性模量值

不同組標(biāo)本中心極限應(yīng)力和應(yīng)變值存在E～A的順序逐漸增高的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與A組比較，D組彈性模量降低（F=12.102，P=0.004），與B組比較，D組彈性模量降低（F=6.785，P=0.021），見表 3。

圖2 不同組病變膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅱ表達(dá)

圖3 各組病變膝關(guān)節(jié)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅱ表達(dá)水平比較

2.3 不同組標(biāo)本交界極限應(yīng)力、應(yīng)變值和相應(yīng)彈性模量值

不同組標(biāo)本交界相應(yīng)彈性模量值存在E～A的順序逐漸降低的趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），極限應(yīng)力和應(yīng)變值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。A、B、C及D組與E組比較，極限應(yīng)力和應(yīng)變值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表3 不同組標(biāo)本中心極限應(yīng)力、應(yīng)變值和相應(yīng)彈性模量值

表4 不同組標(biāo)本交界極限應(yīng)力、應(yīng)變值和相應(yīng)彈性模量值

3 討論

自體骨軟骨鑲嵌移植成形術(shù)（Mosaicplasty）是目前新興的治療軟骨缺損的手術(shù)方法[8-9]，其采用自體非負(fù)重區(qū)骨軟骨柱進(jìn)行鑲嵌式移植，有研究證實(shí)與其他軟骨修復(fù)方法如軟骨下鉆孔、微骨折或打磨成形術(shù)等相比，可以修復(fù)透明軟骨缺損，而其他方法則只能恢復(fù)纖維軟骨覆蓋。但Mosaicplasty技術(shù)本身也存在著不足，如鑲嵌的骨軟骨柱之間及其與周圍和基底部骨和軟骨組織的“整合”不良；骨軟骨柱供體來源有限，無法應(yīng)用于大面積骨軟骨缺損；單枚支架直徑過大不利于細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)替代；由于缺損常為不規(guī)則狀，故Mosaicplasty技術(shù)目前多使用于形狀規(guī)則的骨軟骨柱，不可避免地遺留許多缺損間隙即“死區(qū)”，無法達(dá)到正常的透明軟骨覆蓋，而僅能代之以纖維組織填充，從而極大影響骨與軟骨尤其是軟骨面之間的整合[10]。

由于骨軟骨缺損在軟骨缺損的同時(shí)存在部分軟骨下骨缺損，在修復(fù)軟骨的同時(shí)，需修復(fù)軟骨下骨缺損。早期有研究將單一孔徑支架作為支架材料植入缺損區(qū)，但遠(yuǎn)期新生組織常常缺乏正常軟骨由淺層向深層的漸進(jìn)式結(jié)構(gòu)，這便使處于表面的關(guān)節(jié)軟骨缺乏正常的代謝及生物力學(xué)支持，后期出現(xiàn)缺損中心區(qū)域細(xì)胞的退變，致使軟骨碎裂、塌陷[11-12]。因此，利用雙層孔徑支架材料構(gòu)建組織工程骨軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的新理念便應(yīng)運(yùn)而生，隨著雙層支架研究的增多和深入，顯示骨軟骨修復(fù)中固有的缺陷，即軟骨與軟骨下骨區(qū)域結(jié)合部形成一個(gè)截然分開的界線，干細(xì)胞在軟骨與骨交界區(qū)定向分化不均一，或修復(fù)后產(chǎn)生一個(gè)較明顯的“條帶”區(qū)等[13-14]，這種整合欠佳因素，可能會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)期出現(xiàn)分層現(xiàn)象。由于骨與軟骨結(jié)構(gòu)的這種特殊性，只有選擇合適的骨軟骨支架才能使種子細(xì)胞在體內(nèi)增殖形成骨軟骨組織，完成缺損的修復(fù)。因此，在原有的單孔徑SF-CS-nHA支架基礎(chǔ)上，改進(jìn)單純冷凍干燥方法，制備成梯度式孔徑SF/CS/nHA三維支架材料，再?gòu)?fù)合攜帶目的基因的種子細(xì)胞，構(gòu)建基因增強(qiáng)組織工程骨種植體。PRP是全血經(jīng)過離心而得到的血小板濃縮物所形成的凝膠，其濃縮血小板被激活后可以釋放出多種促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的高濃度生長(zhǎng)因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、β2（TGF-p1，p2）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）[15]，其中以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和血小板源性生長(zhǎng)因子含量最高，并且PRP凝膠能夠形成由纖維蛋白構(gòu)成的三維網(wǎng)狀支架，有利于種子細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝，且由自體全血制備而成，無免疫排斥，而且PRP作為一種可注射支架已在口腔外科及整形外科等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[16]。

本研究結(jié)果顯示，BMP-2-ADSCs復(fù)合體、SF/CS/nHA支架、SF/CS/nHA支架和BMP-2-ADSCs復(fù)合體、SF/CS/nHA支架與BMP-2-ADSCs聯(lián)合PRP凝膠復(fù)合體4種材料移植到兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損模型，第16周時(shí)，大部分的軟骨缺損基本修復(fù)，Ⅰ型和Ⅱ型膠原均有表達(dá)，提示生物材料有不同程度地吸收，SF/CS/nHA支架與BMP-2-ADSCs聯(lián)合PRP凝膠復(fù)合體吸收最好。本結(jié)果與早前的研究類似，即將SF-CS-nHA支架材料與BMSCs混合進(jìn)行體外培養(yǎng)，最后將其移植至長(zhǎng)約2 cm橈骨全段骨缺損模型進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，缺損區(qū)影像與正常骨組織已無區(qū)別，骨髓腔完成再通，骨小梁和梭形的骨細(xì)胞，支架材料完全降解，結(jié)果表明SF-CS-nHA支架可較好地修復(fù)兔橈骨大段骨缺損[17]。原因在于，Mosaicplasty技術(shù)填充大部分缺損面積，以PRP凝膠作為一種可注射支架，將PRP凝膠與基因轉(zhuǎn)染BMP-2-ADSCs的復(fù)合物注射入骨軟骨支架及不規(guī)則缺損的間隙內(nèi)，以組織工程學(xué)方法消除“死區(qū)”，整合骨軟骨柱間隙，降低種子細(xì)胞過快流失，同時(shí)，PRP凝膠釋放的細(xì)胞因子可進(jìn)一步促進(jìn)種子細(xì)胞增殖、成骨及成軟骨分化[18]，有利于大面積骨軟骨損傷的修復(fù)。SF/CS/nHA支架與BMP-2-ADSCs聯(lián)合PRP凝膠復(fù)合體吸收最好，另一方面原因與BMP-2相關(guān)：BMP-2是目前所知的具有最強(qiáng)異位成骨能力的細(xì)胞因子，可加速ADSCs向成骨樣細(xì)胞分化成骨細(xì)胞，并誘導(dǎo)形成骨組織，體外研究顯示ADSCs轉(zhuǎn)染BMP-2，2 d后可檢測(cè)堿性磷酸酶分泌增加，堿性磷酸酶是BMP-2向成骨樣細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物；本研究結(jié)果顯示，裸鼠肌肉內(nèi)注入BMP-2轉(zhuǎn)染的ADSCs可在早期發(fā)現(xiàn)肌肉內(nèi)的骨組織[19-20]。

綜上所述，植入SF/CS/nHA支架與BMP-2-ADSCs聯(lián)合PRP凝膠復(fù)合體對(duì)于大面積軟骨缺損修復(fù)，表現(xiàn)出較好的生物相容性和理化特性，生物材料基本吸收，值得臨床推廣。

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Effect of new osteochondral scaffold-assisted Mosaicplasty technology genetically enhanced ADSCs on repair of large area osteochondral defect*

Shi-qiang Ruan,Jiang Deng,lin Xu,Wen-liang Huang,Ren-yuan Tian
(Department of Orthopaedics,the First People's Hospital of Zunyi,Zunyi,Guizhou 563003,China)

ObjectiveTo investigate the effectofnew osteochondralscaffold-assisted Mosaicplasty technology and genetically enhanced adipose-derived stem cells(ADSCs)on repair of large area osteochondral defect.MethodsBeagle dog model of cartilage full-thickness defect was established.The defect was filled with multiple cartilage scaffolds through Mosaicplasty technology.No fixation was performed in group E.BMP-2-ADSCs was implanted in scaffold in group D.SF/CS/nHA was implanted in scaffold in group C.SF/CS/nHA combined with BMP-2-ADSCs was implanted in scaffold in group B.SF/CS/NHA and BMP-2-ADSCs combined with PRP gel complex was implanted in scaffold in group A.Morphological changes of tissue were observed at the 4th,8th,and 16th week post operation,and tissues were harvested at time point of the 16th week post operation.CollagenⅠand CollagenⅡmRNA were measured by PRC.Ultimate stress,strain value and the corresponding elastic modulus of the cartilage were determined.ResultsCompared with group E,cartilages in group A-D experienced better healing procedure with improvement of smooth surface.Group A witnessed dramatically improved cartilages when compared with group B-D (P＜0.05).The expression levels of collagen proteinⅠ and collagenⅡ,ultimate stress,strain value and the corresponding elastic modulus were increased significantly in group A when compared with the remaining groups(P＜0.05).ConclusionNew osteochondral scaffold filled with SF/CS/nHA,BMP-2-ADSCs and PRP gel complex through Mosaicplasty a technology can be therapeutic option for repair of large area cartilage defects.

biomimetic scaffold;mosaic transplantation;osteochondral defect;platelet-rich plasma;tissue engineerin

R683

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.002

1005-8982（2017）30-0008-07

2017-05-28

貴州省科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（No：[2016]1420）；國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81660367）

鄧江，E-mail：770694368@qq.com

（王榮兵 編輯）