肖華平 ，謝輝 ，羅春陽(yáng) ，李慶 ，方玉江

（1.湘南學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤防治中心，湖南 郴州 423000；2.美國(guó)密蘇里大學(xué)醫(yī)學(xué)院Ellis Fischel腫瘤中心，密蘇里州 哥倫比亞 65212）

基礎(chǔ)研究·論著

DcR3基因?qū)σ认侔┞闶笠浦擦龌熋舾行缘挠绊?

肖華平 1，謝輝 1，羅春陽(yáng) 1，李慶 1，方玉江 2

（1.湘南學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤防治中心，湖南 郴州 423000；2.美國(guó)密蘇里大學(xué)醫(yī)學(xué)院Ellis Fischel腫瘤中心，密蘇里州 哥倫比亞 65212）

目的探討RNA干擾沉默誘騙受體-3（DcR3）對(duì)人胰腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤化療敏感性的影響及其可能機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AsPC-1細(xì)胞1×106個(gè)/ml，接種于5周齡裸鼠右后肢腹股溝，當(dāng)皮下腫瘤直徑為8 mm左右，隨機(jī)分為4組（n=10）：對(duì)照組、化療組、陰性質(zhì)粒+化療組、DcR3 siRNA+化療組。觀察DcR3 siRNA聯(lián)合化療藥物對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤的治療效果。應(yīng)用ELISA和Western blot檢測(cè)DcR3蛋白的變化；TUNEL分析腫瘤細(xì)胞凋亡；Western blot和RT-PCR檢測(cè)FasL、Caspase-8和Caspase-3等凋亡因子的表達(dá)。結(jié)果化療組、陰性質(zhì)粒+化療及DcR3 siRNA+化療組均可抑制移植瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組比較，3組抑瘤率平均值分別為（35.87±4.58）%、（40.68±4.16）%和（90.25±2.53）%，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.736，P=0.000），DcR3 siRNA+化療組抑瘤率較化療組增加；對(duì)照組、化療組、陰性質(zhì)粒+化療以及 DcR3 siRNA+ 化療組移植瘤重量平均值分別為（0.95±0.03）、（0.63±0.04）、（0.67±0.02）和（0.17±0.06）g，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=85.531，P=0.000），DcR3 siRNA+化療組瘤重較化療組減輕；對(duì)照組、化療組、陰性質(zhì)粒+化療組、DcR3 siRNA+化療組凋亡率平均值分別為（6.3±2.21）%、（14.8±2.65）%、（14.5±3.06）%和（54.6±3.23）%，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=104.225，P=0.000），DcR3 siRNA+化療組凋亡率較化療組增加；DcR3 siRNA+化療組的FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)較其他各組上升（P=0.000）。結(jié)論沉默DcR3可激活FasL/Caspase凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加胰腺癌細(xì)胞移植瘤對(duì)化療的敏感性。

胰腺癌；誘騙受體-3；RNA干擾；凋亡；化療敏感性

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）由于具有癥狀隱匿、侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此明確診斷較晚，手術(shù)切除率低及術(shù)后存活率低，化療是其重要的治療方法，然而至今單純的化療也不能延長(zhǎng)患者的存活率。更為遺憾的是，至今還未找到在胰腺癌對(duì)化療藥物耐受機(jī)制中起重要作用的耐受基因。因此，研究如何增強(qiáng)胰腺癌對(duì)化療的敏感性以及提高胰腺癌治療效果有重要的臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RNA干擾沉默誘騙受體-3（decoy receptor 3，DcR3），觀察 DcR3siRNA對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤化療增敏的效果，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系及培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1（美國(guó)密蘇里大學(xué)Ellis Fischel cancer center Dr.Fang惠贈(zèng)）培養(yǎng)條件為：含10%小牛血清PRMI 1640培養(yǎng)基，恒溫37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 DcR3 siRNA質(zhì)粒的構(gòu)建應(yīng)用篩選siRNA的軟件，選取DcR3靶序列：5'-CGCUGCAGCCUCUU GAUGGAGAUGUCC-3'，由上海生物工程股份有限公司合成DcR3特異性siRNA序列：正向：5'-ACAC CCACCUACCCCUGGCDTDT-3'；反向：5'-GCCAGGG GUAGGUGGGUGUDTDT-3'。同時(shí)將上述寡核苷酸序列打亂重新組合，設(shè)計(jì)5'-GACACACCACCUCCC CUGCDTDT-3'和5'-GGCGACGGGUGUGAGGUGU DTDT-3'作為陰性對(duì)照組。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑ELISA檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Bio-Techne 公司），F(xiàn)asL、Caspase-8、Caspase-3、β-action和DcR3抗體（購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司），Alkaline phosph-atase結(jié)合抗-兔 /鼠 IgG二抗（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），核蛋白提取試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Pierce公司），Trizol（購(gòu)自美國(guó)Gibco公司），逆轉(zhuǎn)錄 RCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品），TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Promega公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4～6周齡BALB/c nu/nu雄性裸小鼠，體重18～22 g，共40只，均購(gòu)自中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2015-0006]。

1.2 方法

1.2.1 人胰腺癌裸鼠移植瘤動(dòng)物模型的復(fù)制及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將AsPC-1細(xì)胞按1×106個(gè)/ml每只分別接種于5周齡裸鼠右后肢腹股溝，以瘤體直徑4 mm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)裸鼠皮下腫瘤平均長(zhǎng)徑為8～10 mm。將移植瘤裸鼠隨機(jī)分為4組（n=10）。第1組對(duì)照組，第8天后裸鼠皮下瘤內(nèi)多點(diǎn)注射劑量100 μl的生理鹽水，1次/2 d，共7次；第2組化療組，8 d后腹腔注射吉西他濱100 mg/kg，1次/2 d，共7次；第3組陰性對(duì)照+化療組，8d后腹腔注射吉西他濱100mg/kg，同時(shí)裸鼠皮下瘤內(nèi)多點(diǎn)注射0.5 ml按10 μg/kg的陰性質(zhì)粒和脂質(zhì)體配成的復(fù)合物，1次/2 d，共7次；第4組DcR3 siRNA+化療組，即8 d后裸鼠皮下瘤內(nèi)多點(diǎn)注射0.5ml按10μg/kg的重組質(zhì)粒DcR3 siRNA和脂質(zhì)體配成的復(fù)合物，并予腹腔注射吉西他濱100 mg/kg，1次/2 d，共7次。開(kāi)始治療后，每間隔4天測(cè)量并計(jì)算腫瘤體積，以每次腫瘤體積的均數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線，腫瘤體積的計(jì)算公式為VT（mm3）=ab2/2，a和b分別為長(zhǎng)徑和短徑。荷瘤28 d后脫頸處死裸鼠，剝離腫瘤，稱(chēng)重。并計(jì)算抑瘤率（inhibitory rate，IR），抑瘤率（IR）（%）=[（VA-VB）/VA]×100%，A和B分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組移植瘤中DcR3的蛋白量應(yīng)用Pierce公司試劑盒提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。首先用濃度100μl/孔的抗DcR3 mAb包被ELISA板，置37℃，4h；再用5%小牛血清置37℃封閉40 min，封閉時(shí)將封閉液加滿(mǎn)各反應(yīng)孔，封閉結(jié)束后用洗滌液滿(mǎn)孔洗滌3遍，每遍3 min；將稀釋好DcR3純標(biāo)品和待測(cè)樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，每樣品至少加雙孔，每孔 100 μl，置于 37℃，40～60 min，用洗滌液滿(mǎn)孔洗滌3遍，每遍3 min；最后將生物素標(biāo)記的抗DcR3抗體加入板中，室溫孵育1 h，每孔加入底物TMB 100 μl的置37℃避光放置10 min，加入終止液顯色，A492下讀數(shù)。

1.2.3 TUNEL檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組腫瘤細(xì)胞的凋亡將腫瘤組織連續(xù)切片，置45～50℃孵育箱內(nèi)48 h，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞40min后PBS沖洗1次。加入含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴孵育3 min，PBS沖洗1次。然后用100μl 20 μg/ml Proteinase K溶液在室溫下處理20 min，增加細(xì)胞膜的通透性后，用PBS沖洗3次；制備50μl的TUNEL反應(yīng)混合液：用2 μl TdT酶+48 μl生物素標(biāo)記的Biotin-dUPT。加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液于玻片上，在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。PBS沖洗3次，用抗熒光淬火封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。使用的激光波長(zhǎng)范圍為450nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515nm（綠色熒光）。陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)綠光，觀察10個(gè)200倍鏡下視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)為凋亡指數(shù)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組FasL、Caspase-8和Caspase-3的蛋白表達(dá)腫瘤組織加入細(xì)胞裂解RiPA緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。測(cè)定濃度后各取100 μg蛋白樣本進(jìn)行電泳，通過(guò)電轉(zhuǎn)印法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜（PVDF）上，5%脫脂奶常溫封閉1 h，加入一抗（FasL、β-action:1∶1 000；Caspase-8和 Caspase-3:1∶500），于4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入相應(yīng)的二抗（1∶1 000）常溫孵育1 h，最后NBT/BCIP顯色，相對(duì)蛋白的表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-action灰度值。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組DcR3、FasL、Caspase-8和Caspase-3的基因表達(dá)將液氮凍存的腫瘤組織放入EP管中，用Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA，各取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μl cDNA以FasL、Caspase-8和 Caspase-3的引物（FasL引物：正向 5'-GGTTGCCTTGGTAGGATTGG-3'，反向 5'-CCT TGAGTTGGACTTGCCTGTT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 196 bp；Caspase-8引物：正向5'-TACTACCGAAACTTGGAC C-3'，反向 5'-GTGAAAGTAGGTTGTGGC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為515 bp；Caspase-3引物：正向5'-ATGGAGAAC AATAAAACCT-3'，反向 5'-CTAGTGATAAAAGTAG AGTTC-3'產(chǎn)物長(zhǎng)度為834bp）以及GAPDH的引物（正向 5'-TGACTTCAACAGCGACACCCAC-3'，反向5'-AACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為277bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別檢測(cè)各組中的FasL、Caspase-8、Caspase-3和內(nèi)參GAPDH的mRNA表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)條件為：94℃變性 45 s；60℃（FasL）、50.6℃（Caspase-8）、50℃（Caspase-3） 退火 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。最后取擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，產(chǎn)物條帶用凝膠成像系統(tǒng)照相并進(jìn)行灰度分析，目的片段的相對(duì)表達(dá)量=目的基因的灰度值/GAPDH的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌AsPC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)以及抑制率

根據(jù)所測(cè)得的移植瘤長(zhǎng)短徑，計(jì)算出移植瘤的體積，從而得到4組移植瘤生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，化療組、陰性質(zhì)粒+化療組、DcR03 siRNA+化療組都能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，3種治療方法的抑瘤率平均值分別為（35.87±4.58）%、（40.68±4.16）%和（90.25±2.53）%，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.736，P=0.000），DcR3 siRNA+ 化療組抑瘤率較化療組增加（見(jiàn)圖1A）。

DcR3 siRNA+化療組與化療組治療后第4、8、12、16及20天的移植瘤體積比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的腫瘤體積有差異（F=64.631，P=0.000）；②DcR3 siRNA+ 化療組與化療組的腫瘤體積有差異（F=81.632，P=0.000），與化療組比較，DcR3 siRNA+化療組腫瘤體積較小，相對(duì)抑制腫瘤效果較好；③DcR3 siRNA+化療組與化療組的腫瘤體積變化趨勢(shì)有差異（F=23.585，P=0.016）。見(jiàn)附表和圖1A。

圖1 DcR3 siRNA聯(lián)合化療對(duì)AsPC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用

附表 治療后各組荷瘤小鼠的平均腫瘤體積的比較 （n=10，±s）

附表 治療后各組荷瘤小鼠的平均腫瘤體積的比較 （n=10，±s）

對(duì)照組 926.5±285.3 2 256.5±358.4 4 031.5±506.8 6 174.5±912.6 9 593.8±986.9化療組 508.4±146.2 1 305.7±279.5 2 570.5±612.3 4 185.3±835.6 5 894.5±715.2陰性質(zhì)粒+化療組 485.5±137.8 980.4±215.3 2 265.8±346.1 3 859.4±868.2 5 269.7±654.4 DcR3 siRNA+ 化療組 243.7±48.3 316.4±115.2 425.8±215.5 935.7±479.5 1 375.8±132.1

處死裸鼠后對(duì)照組、化療組、陰性質(zhì)粒+化療組以及DcR3 siRNA+化療組腫瘤重量分別為（0.95±0.03）、（0.63±0.04）、（0.67±0.02）和（0.17±0.06）g，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=85.531，P=0.000），DcR3 siRNA+化療組瘤重較化療組減輕（見(jiàn)圖1B）。

2.2 DcR3在胰腺癌AsPC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤中的表達(dá)

DcR3 siRNA+化療組DcR3蛋白量少于其他各組，與單獨(dú)化療組比較，兩者間DcR3的蛋白量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.478，P=0.000）（見(jiàn)圖 2A）；Western blot檢測(cè)各組DcR3蛋白的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)，在AsPC-1細(xì)胞裸鼠移植瘤中注射DcR3 siRNA能降低DcR3蛋白表達(dá)（見(jiàn)圖2B）。

圖2 DcR3蛋白在AsPC-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤中的表達(dá)

2.3 腫瘤細(xì)胞凋亡情況

對(duì)照組、化療組、陰性質(zhì)粒+化療組、DcR3 siRNA+化療組凋亡率平均值分別為（6.3±2.21）%、（14.8±2.65）%、（14.5±3.06）%和（54.6±3.23）%，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=104.225，P=0.000），DcR3 siRNA+化療組凋亡率較化療組增加（見(jiàn)圖3）。

圖3 各組移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡變化

2.4 FasL、Caspase-8和Caspase-3凋亡因子的表達(dá)

Western blot顯示，DcR3 siRNA+化療組的FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)水平平均值均高于其他各組，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FFasL=61.652，P=0.000；FCaspase-8=79.378，P=0.000；FCaspase-3=68.849，P=0.000），DcR3 siRNA+ 化療組 FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)水平較化療組增加（見(jiàn)圖4A～C）。RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)沉默DcR3后可以上調(diào)FasL、Caspase-8和Caspase-3的表達(dá)，其上調(diào)的效應(yīng)與Western blot結(jié)果一致（見(jiàn)圖4D～F）。

圖4 FasL、Caspase-8及Caspase-3在AsPC-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤中的表達(dá)

3 討論

DcR3是PITTI等[1]在1998年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員，是一種分泌型的可溶性的蛋白分子，在它的氨基酸序列中缺少明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，其配體包括FasL、LIGHT和LTβR。研究發(fā)現(xiàn)，DcR3通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Fas和FasL的結(jié)合，以及阻斷LIGHT和LTβR及HVEM/TR2的相互作作用，從而阻斷FasL和LIGHT介導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及免疫逃逸密切相關(guān)[2-4]。ZHOU等[5]報(bào)道DcR3在胰腺癌中呈高表達(dá)，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)FasL與Fas的結(jié)合在胰腺癌耐受化療的特性中扮演著重要的角色；CHEN等[6]報(bào)道，DcR3能夠阻擋FasL誘導(dǎo)的抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，也提示胰腺癌細(xì)胞的DcR3表達(dá)高并且遠(yuǎn)高于結(jié)腸癌中DcR3的表達(dá)。提示胰腺癌對(duì)化療藥物耐受是否與其的DcR3蛋白過(guò)度表達(dá)存在著聯(lián)系。因此，大家也許能夠運(yùn)用基因敲除的方法減少胰腺癌細(xì)胞上DcR3的表達(dá)從而增加FasL與Fas的結(jié)合，使死亡信號(hào)順利傳遞以達(dá)到提高化療藥物對(duì)胰腺治療效果的目的。

研究證明，凋亡與腫瘤細(xì)胞的化療敏感性有關(guān)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是放療和化療的主要目的之一，凋亡指數(shù)低的細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受性高、化療效果差，因此誘導(dǎo)腫瘤凋亡已作為提高惡性腫瘤化療敏感性的重要方面。DcR3是TNFR超家族成員，DcR3通過(guò)與不同的凋亡配體相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。LIANG等[7]對(duì)肝癌細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默DcR3后，可以增加TRAIL誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，從而增加肝癌細(xì)胞的化療敏感性；ZHANG等[8]研究提示，采用siRNA沉默膠質(zhì)瘤中DcR3高表達(dá)，可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中DcR3 siRNA+化療組FasL的蛋白表達(dá)較其他各組上升。說(shuō)明沉默DcR3表達(dá)后能增加FasL表達(dá)。TUNEL分析結(jié)果顯示，DcR3siRNA+化療組的腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)目高于其他組。以上結(jié)果說(shuō)明，沉默DcR3表達(dá)后可以通過(guò)增加FasL與Fas的結(jié)合，使死亡信號(hào)順利傳遞來(lái)提高胰腺癌的化療敏感性。

DcR3調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡是通過(guò)與FasL競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合而阻斷凋亡信息傳導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[9]。FasL凋亡信號(hào)傳導(dǎo)與Caspase的激活密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DcR3 siRNA+化療組中的Caspases-8和Caspases-3都存在上調(diào)現(xiàn)象。Caspases-8是FasL途徑凋亡通路的啟動(dòng)基因，其下游就是Caspases-3，Caspases-3被認(rèn)為是線粒體凋亡途徑的最終執(zhí)行者[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，沉默DcR3增加化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)激活FasL/Caspase途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

總之，在體內(nèi)沉默DcR3基因的表達(dá)能提高人胰腺癌細(xì)胞的化療藥物治療效果。其機(jī)制可能為沉默DcR3基因可激活FasL/Caspase凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡所致。提示DcR3→FasL→Caspases通路在人胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療敏感性起著至關(guān)重要的作用，有望成為人胰腺癌細(xì)胞基因治療新的靶點(diǎn)之一。

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Effect of Decoy receptor 3 on chemosensitivity in nude mice model of pancreatic cancer*

Hua-ping Xiao1,Hui Xie1,Chun-yang Luo1,Qing Li1,Yu-jiang Fang2
(1.Cancer Center,the Affiliated Hospital of Xiangnan University,Chenzhou,Hunan 423000,China;2.Ellis Fischel Cancer Center,University of Missouri School of Medicine,Columbia,Missouri 65212,USA)

ObjectiveTo investigate the effect of Decoy receptor 3 (DcR3)on chemosensitivity of human pancreatic cancer cells and potential mechanisms.MethodsPancreatic cancer AsPC-1 cells in log-growth phase (1×106cells)were subcutaneously injected in nude mice.Expression of DcR3 was blocked through small interfering ribonucleic acid (siRNA).Seven days post injection,tumor-bearing mice were then randomly divided into 4 groups (n=10 group):control group,chemotherapy group,sham siRNA+chemotherapy group and DcR3 siRNA+chemotherapy.Xenograft of human pancreatic cancer AsPC-1 cells was measured among the groups.Expression level of DcR3 was determined by ELISA and Western blot.Apoptosis rate was detected by TUNEL analysis.Expression levels of FasL protein,Caspase-8,and Caspase-3 were measured by Western blot and RT-PCR.ResultsTumor weight(gram)in chemotherapy group,sham siRNA+chemotherapy group and DcR3 siRNA+chemotherapy group was significantly decreased when compared with control group(0.63± 0.04 vs 0.95±0.03,P=0.000,0.67±0.02 vs 0.95±0.03,P=0.000,0.17±0.06 vs 0.95±0.03,P=0.000),respectively.Silencing of DcR3 expression dramatically reduced weight of tumor when compared with sham siRNA+chemotherapy group (0.17±0.06 vs 0.67±0.02 vs 0.95±0.03,P=0.000).Inhibitory rate of tumor growth in chemotherapy group,sham siRNA+chemotherapy group and DcR3 siRNA+chemotherapy group increased when compared with control group [(35.87±4.58)%vs (0.00±0.00)%,P=0.000,(40.68±4.16)%vs(0.00±0.00)%,P=0.000,(90.25±2.53)%vs(0.00±0.00)%,P=0.000],respectively.Silencing of DcR3 expression dramatically increased inhibitory rate of tumor growth when compared with sham siRNA+chemotherapy group [(90.25±2.53)%vs(0.67±0.02)%vs(40.68±4.16)%,P=0.000].Apoptosis rate in chemotherapy group,sham siRNA+chemotherapy group and DcR3 siRNA +chemotherapy group were significantly increased when compared with control group[(14.8±2.65)%vs(6.3±2.21)%,P=0.000,(14.5±3.06)%vs(6.3±2.21)%,P=0.000,(54.6±3.23)%vs (6.3±2.21)%,P=0.000],respectively.Silencing of DcR3 expression dramatically reduced weight of tumor when compared with sham siRNA+chemotherapy group[(54.6±3.23)%vs(14.5±3.06)%,P=0.000].The expression levels of FasL,Caspase-8,and Caspase-3 in DcR3 siRNA+chemotherapy group were downregulated when compared with the remaining 3 groups(P=0.000).ConclusionSilencing of DcR3 gene can increase the chemosensitivity of human pancreatic cancer by promoting FasL/Caspase-mediated cells apoptosis.

pancreatic cancer;DcR3;small interfering ribonucleic acid;apoptosis;chemosensitivity

R735.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.001

1005-8982（2017）30-0001-07

2017-05-04

湖南省自然科學(xué)基金（No：14JJ3136）；郴州市科技局科研基金（No：CZ2013096）

李慶，E-mail：liqing0685@163.com

（王榮兵 編輯）