解曉莉+韓猛+劉來興+王基隆+楊美+張?jiān)骑w+丁家波+張亮+楊宏軍

摘要：本研究以牛分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴(kuò)增esat6和cfp10基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a（+）-esat6和pET-32a（+）-cfp10，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)重組esat6和cfp10蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化后，對目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證，BCA法測定目的蛋白濃度，最后將east6和cfp10蛋白混合后用于牛結(jié)核病臨床檢測，并對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，牛分枝桿菌esat6和cfp10蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)；其混合蛋白應(yīng)用于結(jié)核病檢測具有較高的特異性，且在皮膚變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ釋放試驗(yàn)兩種檢測方法中具有較高的符合率。說明相較于提純結(jié)核菌素（PPD），esat6和cfp10混合蛋白具有較高的特異性和穩(wěn)定性，將有希望替代PPD用于牛結(jié)核病檢測。

關(guān)鍵詞：牛分枝桿菌；esat6和cfp10蛋白；皮膚變態(tài)反應(yīng)；IFN-γ釋放試驗(yàn)

中圖分類號：S858.23文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）11-0120-04

Expression and Clinical Significance of

Mycobacterium bovis esat6 and cfp10 Protein

Xie Xiaoli1， Han Meng1， Liu Laixing1， Wang Jilong1， Yang Mei1，

Zhang Yunfei1， Ding Jiabo2， Zhang Liang1， Yang Hongjun1

（1. Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250000， China；

2. China Institute of Veterinary Drugs Control， Beijing 100081， China）

AbstractIn this study， the esat6 and cfp10 gene were cloned with genomic DNA of Mycobacterium bovis strain H37Rv as template. Recombinant expression vectors pET-32a（+）-esat6 and pET-32a（+）-cfp10 were constructed to express esat6 and cfp10 protein through the prokaryotic expression system. The recombinant proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography and verified with SDS-PAGE and Western blot. Furthermore， the protein concentrations were determined with BCA method. Then the two proteins were mixed to detect the BTB （bovine tuberculosis） and the results were analyzed. The results showed that esat6 and cfp10 protein were highly expressed in E. coli. There were high specificity and coincidence rate in skin allergic reaction and IFN-γ release test using mixed protein as stimulator. This study confirmed that compared with PPD， esat6 and cfp10 mixed protein had higher specificity and stability and was a promising alternative in BTB detection.

KeywordsMycobacterium bovis； esat6 and cfp10 protein； Skin allergic reaction； IFN-γ release test

牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis）是由牛型分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性消耗性傳染病，在世界各國均有發(fā)生[1]。OIE將該病列為B類動(dòng)物疫病，其廣泛傳播流行，直接影響著畜牧業(yè)的發(fā)展，威脅人類健康，危害公共衛(wèi)生安全[2]。目前牛結(jié)核病的診斷方法主要有提純結(jié)核菌素（PPD）皮膚變態(tài)反應(yīng)及IFN-γ釋放試驗(yàn)。然而，由于PPD與卡介苗（BCG）及部分環(huán)境分枝桿菌存在抗原交叉，所以特異性較低，為了排除交叉反應(yīng)的干擾，近年的研究更傾向于尋找特異性抗原。

esat6、cfp10是牛分枝桿菌的主要毒力因子，能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡，同時(shí)還是重要的T細(xì)胞抗原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生記憶性免疫應(yīng)答[3]?；蚪M學(xué)研究證實(shí)，esat6、cfp10均位于RD1區(qū)，該區(qū)僅存在于MTB等致病性分枝桿菌中，而不存在于BCG及其它非致病性分枝桿菌中[4，5]，因此可以排除交叉反應(yīng)，其作為診斷性抗原具有更好的特異性。esat6、cfp10作為分子伴侶以異二聚體的形式從胞內(nèi)分泌出來，這種結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)活性有密切關(guān)系，本試驗(yàn)把兩者按照1∶1的比例進(jìn)行混合更符合牛分枝桿菌的生物學(xué)特性，這也在一定程度上提高了其作為診斷抗原的敏感性。本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)esat6和cfp10蛋白，并將其以1∶1的比例混合后用于牛結(jié)核病臨床檢測，以評價(jià)其檢測應(yīng)用價(jià)值。

1材料與方法

1.1材料與試劑

牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；pEASY-T3克隆載體、感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）、蛋白質(zhì)Marker均購自北京TransGen Biotech；pET-32a（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ及DNA Marker均購于大連寶生物工程有限公司；Anti-His antibody（His-2）購自Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒均購自北京TianGen Biotech ；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1目的基因克隆根據(jù)NCBI中esat6和cfp10基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對引物，由上海生工技術(shù)有限公司合成。其中esat-6上游序列為：5′-ccggatccatgacagagcagtggaatttcg-3′（劃線處為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)），下游序列為：5′-cggaattctgcgaacatcccagtgacgttg-3′（劃線處為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)）；cfp-10上游序列為：5′-cggaattcgcagagatgaagaccgatgc-3′（劃線處為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)），下游引物序列為：5′-ggaagctttcagaagcccatttgcgag-3′（劃線處為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)）。

以牛分枝菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA為模板，擴(kuò)增esat6和cfp10基因，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，連接至pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選擴(kuò)大克隆，抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定[6]，陽性質(zhì)粒分別命名為pEASY-T3-esat6和pEASY-T3-cfp10并送上海生工有限公司測序。

1.2.2重組esat6蛋白和cfp10蛋白的表達(dá)與鑒定重組質(zhì)粒和pET-32a（+）質(zhì)粒經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切處理后，連接轉(zhuǎn)化至BL21。經(jīng)酶切和測序鑒定，將陽性菌株分別命名為pET32a（+）-esat6/BL21和pET32a（+）-cfp10/BL21。取陽性菌株培養(yǎng)，經(jīng)IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）30℃誘導(dǎo)6 h，同時(shí)設(shè)空載體對照。10 000 r/min離心10 min收集菌體，經(jīng)超聲裂解后離心收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，同時(shí)利用His單抗進(jìn)行Western blot分析。

1.2.3esat6和cfp10蛋白純化與濃度測定利用Ni-NTA親和層析法對His-esat6和His-cfp10蛋白進(jìn)行純化，并通過SDS-PAGE對其純化效果進(jìn)行鑒定。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）對純化蛋白濃度進(jìn)行測定。

1.2.4esat6和cfp10在臨床診斷中的應(yīng)用將純化得到的目的蛋白用 HanksBalanced Salt Solution稀釋至終濃度為50 μg/mL，分裝，-80℃凍存。挑選50頭健康的荷斯坦泌乳牛，分別頸部注射結(jié)核菌素（50 μg/mL）和esat6+cfp10混合蛋白（esat6∶cfp10=1∶1，esat6和cfp10濃度均為25 μg/mL）進(jìn)行皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，同時(shí)觀察牛頸部的炎癥反應(yīng)，篩選出的陽性牛和可疑牛采集抗凝血進(jìn)一步開展IFN-γ試驗(yàn)。皮膚變態(tài)反應(yīng)操作方法及判定標(biāo)準(zhǔn)參照《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T 18645—2002）》。

1.3檢測數(shù)據(jù)分析

將收集的檢測數(shù)據(jù)利用Kappa系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1esat6和cfp10基因的PCR擴(kuò)增

以牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增得到288 bp和303 bp的預(yù)期大小片段（圖1）。

2.2esat6和cfp10重組質(zhì)粒的鑒定

esat6和cfp10重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ﹑HindⅢ雙酶切鑒定，分別得到288 bp和303 bp的目的片段，BLSAT比對結(jié)果顯示兩基因與NCBI公布的相應(yīng)序列同源性均為100%，兩基因重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確（圖2）。

重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.3His-esat6和His-cfp10蛋白的表達(dá)與鑒定

將原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE（圖3A）與Western blot（圖3B）分析顯示，His-esat6和His-cfp10蛋白均已表達(dá)，且大小與預(yù)期大?。ǚ謩e為28 kD和29 kD）一致。

2.4esat6和cfp10蛋白的濃度測定

利用試劑盒中的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），根據(jù)方程y=0.2317x+0.1249及目的蛋白的OD值0.228和0.352，得到esat6和cfp10蛋白含量分別為：444.97 μg/mL和980.15 μg/mL。

2.5esat6和cfp10在臨床診斷中的應(yīng)用

將待檢測蛋白進(jìn)行牛頸部注射后72 h進(jìn)行復(fù)檢，陽性牛肉眼可見注射部位腫脹堅(jiān)硬，觸摸敏感。在皮膚變態(tài)反應(yīng)中，PPD的陽性檢出率為38%，混合蛋白的陽性檢出率為30%。Kappa系數(shù)分析顯示，在以混合蛋白及提純結(jié)核菌素作為刺激劑的皮膚變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ釋放試驗(yàn)中，兩兩間均具有顯著相關(guān)性。不同刺激物和不同檢測方法的符合率均較高（表1）。

3討論

牛結(jié)核病是一種慢性消耗性傳染病，呈世界流行性，且無明顯季節(jié)性，在流行嚴(yán)重的地區(qū)感染率可達(dá)60%[7]。esat6和cfp10抗原僅存在于致病性分枝桿菌的早期培養(yǎng)濾液中，沒有信號肽，是兩種非信號肽依賴的結(jié)核分枝桿菌分泌性小分子量抗原[8]，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平IFN-γ[9]和強(qiáng)烈的DTH反應(yīng)[10]，在牛結(jié)核病的診斷、預(yù)防中起著重要作用。east6和cfp10從胞內(nèi)分泌時(shí)形成1∶1緊密的異二聚體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于調(diào)控蛋白活性，增加蛋白與蛋白之間相互作用的特異性[8]。因此，本研究在試驗(yàn)過程中對esat6與cfp10按照1∶1的比例進(jìn)行混合，以發(fā)揮兩者最大的生物學(xué)功能，提高檢測的靈敏性。

對牛只進(jìn)行皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，檢測結(jié)果顯示，PPD的陽性檢出率為38%，而esat6和cfp10混合蛋白的陽性檢出率為30%，且兩者具有高達(dá)92%的整體符合率，這表明PPD檢測可能具有較強(qiáng)的敏感性，陽性檢出率較高，但PPD是全菌蛋白的抽提物，成分復(fù)雜，與卡介苗（BCG）及環(huán)境中其它分枝桿菌存在抗原交叉反應(yīng)[11]，檢測假陽性的風(fēng)險(xiǎn)較大。從IFN-γ釋放試驗(yàn)的結(jié)果分析，PPD作為刺激物的皮膚變態(tài)反應(yīng)與IFN-γ釋放試驗(yàn)的符合率為78.95%，而以esat6和cfp10混合蛋白作為刺激物的皮膚變態(tài)反應(yīng)與IFN-γ釋放試驗(yàn)的符合率為89.47%，這表明esat6和cfp10的可重復(fù)性、特異性更高，檢出結(jié)果更符合牛群的感染狀況。這也從側(cè)面反映了PPD作為檢測抗原存在較高的假陽性，與Aagaard等[12]的研究結(jié)論相符合。

雖然IFN-γ分泌的靈敏度能夠達(dá)到pg級[13]，特異性也高達(dá)100%，同時(shí)IFN-γ釋放試驗(yàn)作為牛結(jié)核病診斷的最佳方法，是皮膚變態(tài)反應(yīng)無法比擬的，但是IFN-γ釋放試驗(yàn)的體外操作過程復(fù)雜，作為臨床快速診斷試劑應(yīng)用有一定的局限性；而PPD作為檢測抗原存在較高的假陽性；若能將esat6和cfp10混合蛋白替代PPD，可以提高診斷的特異性，降低檢測的假陽性率，這必將有良好的應(yīng)用前景。

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收稿日期：2017-09-02

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系濟(jì)南綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目（CARS-40-S12）；雞蛋生產(chǎn)質(zhì)量安全控制技術(shù)研究與示范（201608）；畜禽健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)研究（CXGC2017B02）；濟(jì)南市畜牧科技與良種推廣能力建設(shè)項(xiàng)目“蛋雞標(biāo)準(zhǔn)健康養(yǎng)殖技術(shù)”；山東省財(cái)政支持農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項(xiàng)目“蛋雞標(biāo)準(zhǔn)化健康養(yǎng)殖技術(shù)推廣”

作者簡介：李福偉（1977—），男，副研究員，碩士，主要從事家禽育種與生產(chǎn)技術(shù)研究。E-mail：lifuwei1224@163.com

通訊作者：黃保華（1964—），男，研究員，本科，主要從事家禽營養(yǎng)學(xué)研究。E-mail：jqsyzs@163.com