任海霞+宮志遠(yuǎn)+蔣志琴+陸玉榮+任鵬飛+萬魯長

摘要：香菇（Lentinus edodes）是世界上著名的食用菌之一，其菌株種類較多，遺傳背景較為復(fù)雜。本研究利用ISSR-PCR技術(shù)，對(duì)26個(gè)香菇菌株進(jìn)行DNA指紋分析，并使用NTSYS-PC軟件對(duì)其遺傳差異性進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，從106個(gè)隨機(jī)引物中共篩選到9個(gè)引物，利用這9個(gè)引物對(duì)26個(gè)香菇菌株的DNA進(jìn)行ISSR-PCR，檢測(cè)到124個(gè)較為清晰的擴(kuò)增位點(diǎn)，其擴(kuò)增片段DNA分子量大小主要介于0.2～4.5 kb之間。通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)相似水平在55%時(shí)出現(xiàn)種系分離；相似水平65%時(shí)，26個(gè)菌株聚為5個(gè)群組。本研究為山東省香菇遺傳信息庫的建立和遺傳育種工作奠定了一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香菇；ISSR-PCR；聚類分析；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S646.1+20.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）11-0020-05

Analysis of Genetic Diversity of 26 Lentinus edodes strains

Ren Haixia1， Gong Zhiyuan1， Jiang Zhiqin2， Lu Yurong2， Ren Pengfei1， Wan Luzhang1

（1.Institute of Agriculture Resources and Environment， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Wastes Matrix Utilization， Ministry of Agriculture， Jinan 250100，China；

2. Bazhou Science and Technology Development Exchange Center of Xinjiang， Bazhou 841000，China）

AbstractLentinus edodes is one of the most famous edible fungus species in the world. It has various strains and complex genetic background. In this study， we conducted DNA fingerprinting of 26 familiar Lentinus edodes strains by ISSR-PCR， and analyzed their genetic diversity by cluster analysis of NTSYS-PC software. The results showed that， 9 primers were selected from 106 random primers， which were used to conduct DNA ISSR-PCR in 26 Lentinus edodes strains， and 124 relatively clear sites were amplified with the DNA molecular weight ranging from 0.2 kb to 4.5 kb. Cluster analysis results showed that， species separation was appeared at the similarity level of 55%， and the 26 strains were mainly divided into five groups at the similarity level of 65%. This study laid certain foundations for establishing the genetic information library and genetic breeding of Lentinus edodes in Shandong Province.

KeywordsLentinus edodes；ISSR-PCR；Cluster analysis；Genetic diversity

香菇（Lentinus edodes）屬于真菌門，擔(dān)子菌綱，傘蘑目，皮傘科，富含蛋白質(zhì)、多種人體必需氨基酸、糖類、礦物質(zhì)、維生素和脂類等營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)含有香菇多糖、香菇嘌呤、雙鏈核糖核酸等免疫活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值[1，2]。香菇是世界上第二大食用菌栽培菌種，其產(chǎn)量僅次于雙孢菇。中國香菇栽培生產(chǎn)發(fā)展迅速，近年來在香菇的產(chǎn)銷量上一直位居世界第一位[3]。隨著產(chǎn)銷量的增長，國內(nèi)外對(duì)其栽培、育種、保鮮加工等方面高度重視，而香菇菌種是香菇生產(chǎn)中最重要的基礎(chǔ)，因此，引進(jìn)和選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的菌株有助于香菇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[4]。但是目前我國香菇引種比較混亂，菌株同名異物和同物異名現(xiàn)象頻發(fā)，故對(duì)香菇菌株進(jìn)行鑒定并確立其DNA指紋圖譜將有助于從分子生物學(xué)角度準(zhǔn)確識(shí)別菌種、了解其親緣關(guān)系，從而有效利用不同香菇品種的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行育種，促進(jìn)生產(chǎn)的發(fā)展[5]。

ISSR（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性）技術(shù)是在SSR和PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，由Zietkiewicz等于1994年首次在植物研究中使用[6] ，由于操作簡(jiǎn)單、成本低、快速、靈敏、檢測(cè)多態(tài)性能力強(qiáng)等特點(diǎn)而倍受青睞[7]。近幾年該技術(shù)已逐步開始在食用菌種質(zhì)資源研究、菌株鑒別和菌株遺傳多樣性分析等方面進(jìn)行應(yīng)用[8，9]。本研究采用ISSR-PCR方法，從106個(gè)隨機(jī)引物中篩選出9個(gè)引物，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的26個(gè)香菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，構(gòu)建遺傳相關(guān)聚類圖，明確26個(gè)香菇菌株之間的親緣關(guān)系，以便為香菇育種積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。endprint

1材料與方法

1.1供試菌株

本試驗(yàn)所用的26個(gè)香菇菌株均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所提供。各供試菌株的編號(hào)、名稱、特征及來源見表1。

1.2培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，蛋白胨3 g，酵母浸粉2 g，瓊脂21 g，加水定容至1 000 mL，121℃滅菌30 min。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨4 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 mL，pH值7.0，121℃滅菌30 min。

1.3引物與試劑

試驗(yàn)所用引物序列來自UBC Primer Set #9（Microsatellite），均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。DNA Marker、dNTPs、Taq酶以及EB等其它試劑均為天根生化科技有限公司產(chǎn)品，皆為分析純。

1.4香菇菌絲體培養(yǎng)及收集

挑取保藏香菇菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，25℃活化培養(yǎng)7～10天，再轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，在25℃、150 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)12天。將培養(yǎng)液以3 000 r/min離心，棄上清液，用無菌蒸餾水洗滌菌絲3次，濾紙吸干殘余水分，將所得菌絲體在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5香菇菌絲DNA的提取

DNA提取采用改進(jìn)的SDS法[10]。

1.6ISSR-PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系為20 μL，其中含有1×PCR Buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.6 μmol/L引物，200 μmol/L dNTPs，模板DNA 50 ng，0.06 U/μL Taq 酶。

ISSR-PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，50℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，停止反應(yīng)。4℃保存反應(yīng)液備用。

1.7ISSR-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

用1×TAE緩沖液配制濃度為1.2%的瓊脂糖溶液，ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR管中各加4 μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液，取13～15 μL至上樣孔，以4～5 V/cm進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，用5 mg/mL EB溶液對(duì)瓊脂糖凝膠染色20 min，再用去離子水脫色漂洗10 min，于凝膠紫外成像系統(tǒng)上觀察、拍照[11]。

1.8ISSR-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)及處理分析

將所得的瓊脂糖凝膠電泳圖譜用Quantity One軟件進(jìn)行處理，對(duì)各泳道的DNA條帶進(jìn)行分子量標(biāo)記并輸出，以不同分子量DNA片段的條帶有無作為多態(tài)性狀，有記為1，無記為0，DNA凝膠電泳圖譜即轉(zhuǎn)換為[0，1]數(shù)字矩陣。然后利用NTSYS-PC軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建26個(gè)香菇菌株的親緣關(guān)系樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1ISSR-PCR的引物篩選

一般來說，ISSR-PCR擴(kuò)增所用引物是隨機(jī)且通用的，但是每個(gè)引物并非適合所有物種。由于引物是決定ISSR-PCR擴(kuò)增成敗及其特異性的關(guān)鍵因素，因此對(duì)于某具體物種來說，應(yīng)盡可能地對(duì)多個(gè)引物進(jìn)行篩選，以篩選出擴(kuò)增多態(tài)性水平高并且重復(fù)性好的引物。本研究首先從所保存的菌株中隨機(jī)選取香1310（菌株編號(hào)為4）和申香10號(hào)（菌株編號(hào)為11）2個(gè)菌株作為研究對(duì)象，以其DNA為模板，用隨機(jī)選取的106個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選到9個(gè)多態(tài)性高、重復(fù)性好、帶型清晰的引物，引物序列見表2。

2.226個(gè)香菇菌株ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用篩選到的9個(gè)引物對(duì)26個(gè)香菇菌株的DNA進(jìn)行ISSR-PCR，共檢測(cè)到124個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其擴(kuò)增片段DNA分子量大小主要介于0.2～4.5 kb之間。每個(gè)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)介于11～17個(gè)，多態(tài)性比率介于78.6%～100.0%，9個(gè)引物擴(kuò)增出的124個(gè)位點(diǎn)中，有111個(gè)為多態(tài)性，擴(kuò)增位點(diǎn)平均多態(tài)性比率為89.5%（表3）。由此可見，本文所篩選的引物對(duì)香菇菌株的DNA擴(kuò)增多態(tài)性豐富、穩(wěn)定，可以用于香菇菌株間的親緣關(guān)系分析，構(gòu)建其親緣關(guān)系聚類樹狀圖。引物ISSR 873和ISSR 895對(duì)26個(gè)香菇菌株的ISSR-PCR擴(kuò)增圖譜見圖1和圖2。

M：Marker Ⅲ；B：空白；1～26：香菇菌株（見表1），下圖同。

2.326個(gè)香菇菌株的聚類分析

利用NTSYS-PC軟件對(duì)得到的26個(gè)香菇菌株的相似性[0，1]數(shù)字矩陣進(jìn)行非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPMGA）聚類分析，得到這26個(gè)菌株的親緣關(guān)系樹狀圖，見圖3?？梢钥闯?，供試的26個(gè)香菇菌株相似性在0.55～0.88之間。在0.65的相似水平上可以將26個(gè)香菇菌株分為五組，其中55C（菌株編號(hào)為19）、虎皮香菇（菌株編號(hào)為25）分別自成一組，野生香菇（菌株編號(hào)為5）和SNL23（菌株編號(hào)為9）聚成一組，香菇（菌株編號(hào)為1）和WH021（菌株編號(hào)為2）聚成一組，其余20個(gè)香菇菌株聚為一組。55C是一個(gè)野生種與生產(chǎn)種的雜交菌株，與其它香菇親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，故自成一組；虎皮香菇與香菇同屬香菇屬，但是不同種，故也自成一組；野生香菇（菌株編號(hào)為5）和SNL23（菌株編號(hào)為9）都是采自神農(nóng)架的野生香菇，故聚成一組；香菇（菌株編號(hào)為1）和WH021（菌株編號(hào)為2）都是中高溫型、子實(shí)體較大的香菇，且與其它品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，故聚成一組；其余20個(gè)香菇菌株主要是常用的栽培菌株，故聚為一個(gè)大組。

3討論與結(jié)論

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為在分子水平上研究菌種的親緣關(guān)系提供了技術(shù)保證。近年來，DNA技術(shù)已被廣泛用于真菌的系統(tǒng)發(fā)育研究，對(duì)香菇品種進(jìn)行菌株鑒定可有助于從分子生物學(xué)角度準(zhǔn)確地識(shí)別菌種[12]。目前用于親緣關(guān)系分析的DNA技術(shù)有很多，而ISSR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、條件穩(wěn)定、快速、靈敏、檢測(cè)多態(tài)能力強(qiáng)、所需DNA模板量少等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性和品種鑒定的研究[13]，在食用菌中的應(yīng)用也日益廣泛。本研究利用ISSR-PCR技術(shù)對(duì)26個(gè)香菇菌株進(jìn)行親緣關(guān)系聚類分析，結(jié)果顯示，26個(gè)香菇菌株的多態(tài)性較為豐富，在65%的相似水平上，可以分為5大類：55C、虎皮香菇分別自成一類，野生香菇和SNL23同是神農(nóng)架的野生采集品種，聚成一類，香菇和WH021聚成一類，其余20個(gè)香菇菌株聚為一類。說明野生香菇和栽培香菇具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，各香菇菌株間的親緣關(guān)系與其產(chǎn)地并無太大相關(guān)性。

本研究初步明確了本實(shí)驗(yàn)室保存的26個(gè)香菇菌株親緣關(guān)系。但是由于香菇的栽培菌株特別多，栽培面積大，種植戶、菌種廠相互引種的現(xiàn)象特別多，所以遺傳背景比較復(fù)雜，僅采用一種分子生物學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行分析還遠(yuǎn)不能滿足香菇遺傳信息庫和香菇遺傳育種工作的技術(shù)需求，今后還需要采用一些必要的輔助方法如菌絲形態(tài)、子實(shí)體形態(tài)以及出菇條件等，對(duì)更多的菌株進(jìn)行系統(tǒng)分析和研究[14]。

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收稿日期：2017-06-18endprint