牛丹丹，靳曉，吳海洋，劉曉光，林娟，葉秀云*

1(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州，350116)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶高活力突變體的創(chuàng)建與性質(zhì)研究

牛丹丹1，靳曉1，吳海洋2，劉曉光2，林娟1，葉秀云1*

1(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州，350116)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

為進一步提高解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶(Bacillusamyloliquefaciensα-amylase, BAA)發(fā)酵生產(chǎn)與應(yīng)用性能，對BAA編碼基因?qū)嵤┝梭w外隨機突變，建立了含有2×104個轉(zhuǎn)化子的BAA突變庫。BAA編碼基因的突變頻率為56%，基因突變效率為2.8/kb DNA，錯義突變26.8%；以平板篩選法和搖瓶發(fā)酵法對BAA突變庫進行篩選，得到6個酶活力顯著提高的突變體，其中突變體BAA28的酶活力提高最多，提高達37%；進一步分析突變體BAA28序列，發(fā)現(xiàn)其4個氨基酸殘基發(fā)生突變，分別是：T341P、P348L、T356P和P362L，其中T341P和T356P位于無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)中，P348L位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中，P362L位于β-折疊結(jié)構(gòu)中。進一步制備與純化BAA28，并比較分析其酶學(xué)特征，與野生型BAA相比，BAA28的離子依賴性、熱穩(wěn)定性發(fā)生了顯著變化；BAA28的比酶活提高了約31%，κcat/Km值提高了92%。突變體BAA28較BAA在催化與應(yīng)用屬性上有了顯著提升，可應(yīng)用于后續(xù)中溫α-淀粉酶高產(chǎn)新菌種的構(gòu)建并可顯著改善其工業(yè)應(yīng)用性能。

中溫α-淀粉酶；突變體；催化效率

解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶 (Bacillusamyloliquefaciensα-amylase, BAA)，又被稱為中溫α-淀粉酶(簡稱：中淀)，是中高溫段淀粉液化的主要酶種之一[1]，廣泛應(yīng)用于洗滌、造紙、淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、織物退漿、釀造、酒精工業(yè)、有機酸工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等[2-4]，是我國工業(yè)酶制劑的重要組成成員。

BAA屬于糖苷水解酶的第13家族 (glycoside hydrolase family 13，GH13)。BAA的編碼基因，首先由PALVA 等于1982年通過鳥槍法在Bacillussubtilis中克隆成功[5-6]，對其結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)關(guān)系研究揭示，D194N或E185K突變，可降低BAA的熱穩(wěn)定性[7]；LEE[8]等對 BAA編碼基因進行了隨機突變，發(fā)現(xiàn)位于氨基酸殘基233位置上的 Ca2+結(jié)合位點對于 BAA 的性質(zhì)具有重要影響；劉洋等[9-10]對BAA中Ca2+結(jié)合位點上的氨基酸殘基231、233和438 分別進行定點突變，與天然 BAA 相比，3個突變體的比酶活均有下降，突變體 D233NKm上升了 55.6%，κcat值下降了 85%，另外2個突變體的Km和κcat值與天然BAA相比沒有明顯的變化。另一方面，我國科研工作者運用分子克隆與遺傳重組技術(shù)等[9, 11-12]，對BAA工業(yè)生產(chǎn)菌種進行了成功改良，BAA工業(yè)菌種的發(fā)酵生產(chǎn)水平從早期的300 U/mL大幅提升到1 200 U/mL以上，并且顯著改善了發(fā)酵工藝與產(chǎn)品穩(wěn)定性，使我國成為世界上中溫α-淀粉酶的生產(chǎn)國與供應(yīng)國。

與相關(guān)重要淀粉液化酶特別是高溫α-淀粉酶相比，有關(guān)BAA分子特性改良等研究相對滯后。通過分子進化等技術(shù)提高其催化效率，不僅有助于其工業(yè)應(yīng)用，也有可能進一步提高其生產(chǎn)菌種的發(fā)酵生產(chǎn)水平。為此，本文就BAA催化效率的分子進化進行探索，為后續(xù)BAA生產(chǎn)菌種遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)CICIM B2125為中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌株[9]，用于本研究的BAA編碼基因的供體，大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109和地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)D402[11,13](ΔamyΔhspΔaprE)用于本研究基因克隆與表達宿主。pND-113為前期經(jīng)pHY-WZX[14]改造獲得，可介導(dǎo)外源基因在大腸桿菌和地衣芽胞桿菌等宿主細胞中分泌表達外源酶分子。pND-BAA為本研究構(gòu)建重組分泌表達質(zhì)粒，含有BAA編碼基因。除特別說明外，所有菌株在LB培養(yǎng)基(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%)中，于37 ℃下培養(yǎng)，必要時在培養(yǎng)基中添加0.5%可溶性淀粉或/和添加20 μg/mL卡那霉素。

1.1.2 工具酶和試劑

限制性內(nèi)切酶、連接酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Pyrobest、TaqDNA聚合酶、dNTPs、三磷酸核苷、MgCl2及MnCl2購自上海生工生物工程有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購于美國OMEGA公司，其余化學(xué)常用試劑均為進口或國藥分析純。BAA純品為實驗室前期純化并保存。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆常規(guī)操作

PCR擴增、質(zhì)粒DNA和PCR產(chǎn)物的提取、純化、酶切、瓊脂糖凝膠電泳、連接、轉(zhuǎn)化等按照實驗室常規(guī)方法進行[15]。DNA序列測定采用Sanger氏的雙脫氧末端鏈終止法進行。

1.2.2 BAA編碼基因的PCR擴增

以B.amyloliquefaciensB2125基因組DNA為模板，以引物BAA-F(5′-TACGGATCCGTAAATGGCACGCTGATGCAGTAT-3′，下劃線處為外加克隆位點BamHI)和BAA-R (5′-TTATTTCTGAACATAAATGGAGACGG-3′)介導(dǎo)目的基因擴增。PCR擴增體系50 μL模板DNA 1 μL，10×PCR 緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，BAA-F 1 μL，BAA-R 1 μL，Pyrobest DNA多聚酶0.2 μL，補ddH2O至50 μL；PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；擴增30個循環(huán)(94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s)；72 ℃，10 min。

1.2.3 易錯PCR反應(yīng)

易錯PCR擴增體系(50 μL)為：10×PCR 緩沖液(不含Mg2+和Mn2+)5 μL，100 mmol/L dCTP 0.5 μL，100 mmol/L dTTP 0.5 μL，10 mmol/L dATP 1 μL，10 mmol/L dGTP 1 μL，Mg2+6.5 mmol/L, Mn2+0.5 mmol/L, BAA-F 1 μL，BAA-R 1 μL，BamHI線性化pND-BAA DNA 1 μL。PCR擴增在TaqDNA多聚酶介導(dǎo)下進行。擴增程序為：95 ℃ 5 min；擴增30個循環(huán)(94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s)；72 ℃，10 min。

1.2.4 BAA突變體庫搭建與突變效率檢驗

將易錯PCR產(chǎn)物純化后，先用DpnI酶切去除模板DNA，再用BamHI酶切，然后與表達質(zhì)粒pND113進行連接，連接物轉(zhuǎn)化入宿主E.coliJM109,將轉(zhuǎn)化子點種于96孔微孔板中，培養(yǎng)并保藏。隨機挑取100個轉(zhuǎn)化子，提取其質(zhì)粒DNA，進行核苷酸序列測定，統(tǒng)計基因中堿基突變、突變方式及氨基酸突變等。

1.2.5 BAA突變體初篩與復(fù)篩

突變體初篩：在篩選平板(含有0.5%淀粉的LB平板)點種轉(zhuǎn)化子并以E.coliJM109 (pND-BAA)為對照，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)16～24 h后，目測淀粉水解圈大小，挑取透明圈明顯增大者保藏及進一步實驗。

將初篩得到的透明圈增大的轉(zhuǎn)化子和對照J(rèn)M109 (pND-BAA)，1株3瓶接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)12 h后，以10%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%乳糖)，37 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)36 h后，將各菌株培養(yǎng)液10 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集上清液，并測定淀粉酶酶活力。其質(zhì)粒DNA經(jīng)分離純化后進行核苷酸序列測定與分析。

1.2.6 BAA突變體的制備與純化

地衣芽胞桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化按文獻方法進行[14]。將上述獲得的BAA突變體表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌D402，在含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上于37 ℃培養(yǎng)2～3 d，篩選出轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)12～14 h作為種子，以10%(v/v)的接種量接于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%乳糖)，在37 ℃，220 r/min 條件下發(fā)酵培養(yǎng)120 h，發(fā)酵結(jié)束后，離心收集上清液，即為BAA突變體粗酶液。酶液純化用AKTA pure system H8(29-2827-26型，GE Healthcare 公司)進行。蛋白質(zhì)純度用SDS-PAGE進行分析[15]，蛋白質(zhì)濃度按照Bradford的蛋白質(zhì)微量測定方法進行。

1.2.7 酶活測定

用DNS法[10]。酶活力單位定義為：1 mL稀釋酶液在pH 6.0、60 ℃條件下，1 h水解1.0 %可溶性淀粉產(chǎn)生相當(dāng)于1 mg葡萄糖還原力，定義為1個酶活力。

1.2.8 酶學(xué)性質(zhì)與特征分析

1.2.8.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

在不同溫度下(30～90 ℃)測定的淀粉酶活力，以測得的最高酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活力，確定最適反應(yīng)溫度；在反應(yīng)體系中添加或不添加5 mmol/L Ca2+，將其置于60 ℃或70 ℃水浴中，保溫60 min，每隔15 min取樣，冰浴30 min后，用1.2.7的方法在最適溫度下測定處理后酶液的殘余酶活力，以未進行熱處理的酶液酶活力為100%，計算相對酶活，以確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8.2 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

在60 ℃條件下，分別測定不同pH緩沖溶液下的酶活力，以測得的最高酶活力值為100%，計算其他pH條件下的相對酶活力，確定最適反應(yīng)pH。將酶液置于不同pH值的緩沖液于37 ℃保溫1 h，然后用1.2.7的方法測定酶液的殘余酶活力，以確定酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.8.3 不同金屬離子及化學(xué)試劑對酶活力的影響

在酶的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度條件下，研究金屬離子和化學(xué)試劑(Na+、Ca2+、K+、Co+、Li+、Mg2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+、EDTA、SDS)對酶活性的影響，以相同條件下未加金屬離子和化學(xué)試劑的酶反應(yīng)為對照。

1.2.8.4 酶的動力學(xué)參數(shù)測定

配制不同濃度的可溶性淀粉溶液為底物，在pH 6.0，溫度60 ℃條件下，反應(yīng)10 min，采用DNS法測定酶活力，計算酶促反應(yīng)速度，測定酶的動力學(xué)參數(shù)。

1.2.9 生物信息學(xué)分析

核苷酸序列與氨基酸序列分析采用DNAMAN 5.0軟件進行，BAA及其突變體的3D結(jié)構(gòu)模擬采用SWISS-MODEL在線軟件進行分析(https://swissmodel.expasy.org/)。

2 結(jié)果與討論

2.1 BAA編碼基因的克隆、表達與突變體庫的搭建

以B.amyloliquefaciensB2125基因組DNA為模板，克隆出大小約1.4 kb、編碼BAA成熟肽的編碼基因amyQ[9-10]，將其克隆入表達質(zhì)粒pND-113，獲得重組表達質(zhì)粒pND-BAA，此質(zhì)粒能夠在E.coliJM109中分泌表達BAA，在淀粉平板上可形成典型的淀粉水解透明圈。

以BamHI線性化的pND-BAA為模板，進行易錯PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化與酶切后克隆入表達質(zhì)粒pND-113并轉(zhuǎn)化入E.coliJM109，點種轉(zhuǎn)化子于含200 μL培養(yǎng)基的96孔微孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)13～15 h，分裝與保藏，由此搭建出庫容為2×104個轉(zhuǎn)化子的BAA突變庫。隨機挑取其中100個轉(zhuǎn)化子進行分析，有99個轉(zhuǎn)化子含有重組質(zhì)粒，其中有56個轉(zhuǎn)化子的BAA編碼基因發(fā)生了突變，包括26.8%發(fā)生單點突，14.3%發(fā)生雙位點突變，57.1%發(fā)生多位點突變，1.8%發(fā)生無義突變，1 kb基因平均有2.8個堿基發(fā)生突變，同義突變率占73.2%，非同義突變率占26.8%，基本滿足篩選需要。

2.2 BAA酶活提高突變體的篩選

在含有可溶性淀粉的篩選平板上，通過目測透明圈大小對BAA突變體進行初篩，共篩選得到68株透明圈大于對照的轉(zhuǎn)化子，占比0.68%。進一步通過搖瓶發(fā)酵進行復(fù)篩，最終篩選得到6株酶活力高于對照的突變體，以其中的突變體BAA28酶活力提高最高，是BAA的1.37倍(表1)，以此作為后續(xù)進一步研究對象。

表1 BAA突變體復(fù)篩Table 1 The secondary screening results of BAA mutants

2.3 BAA28突變體序列分析

對BAA28突變體的編碼基因進行序列測定與分析，其分子共發(fā)生了有7個堿基突變(G513A、T627C、A1021C、CG1044TT、A1066C、C1085T)并引起4個氨基酸殘基 (T341P、P348L、T356P、P362L) 發(fā)生變化。從一級結(jié)構(gòu)看，BAA28的4個氨基酸突變位點均位于(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)處，即α-淀粉酶家族中的催化區(qū)域，由203-392 aa折疊形成[16]；從二級結(jié)構(gòu)看，BAA28的突變位點T341P和T356P位于無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)中，P348L位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中，而P362L位于β-折疊的結(jié)構(gòu)中[16]；從三級結(jié)構(gòu)看，各突變酶的三維結(jié)構(gòu)和BAA相比，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異[16]。

2.4 BAA28酶學(xué)特征

將重組質(zhì)粒pND-BAA28轉(zhuǎn)化入B.licheniformisD402，獲得重組菌D402(pND-BAA28)，通過搖瓶發(fā)酵制備酶液，經(jīng)純化，在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，大小約58 kDa(圖1)?？梢杂糜诤罄m(xù)酶學(xué)特征分析。采用B.amyloliquefacientsM2125發(fā)酵制備BAA酶液并純化(圖1)，用于后續(xù)研究對照。

M-相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-BAA28粗酶液；2-純化后的BAA28；3-BAA發(fā)酵液；4-純化后的BAA圖1 BAA28純化后的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE profile of the purified BAA28

2.4.1 最適作用溫度和最適作用pH

將BAA28置于不同溫度或不同pH條件下測定其酶活力，BAA28的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適作用pH為6.0；在50～70 ℃或pH5～8下皆具有較高活力。此特性與BAA基本保持一致(圖2)。

圖2 BAA28的最適作用溫度(A)與最適作用pH(B)Fig.2 Temperature (A) and pH (B)optima of BAA28

2.4.2 熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性

在反應(yīng)體系中添加或不添加5 mmol/L Ca2+，并在不同溫度(60 ℃，70 ℃)或不同pH下保溫，然后按照標(biāo)準(zhǔn)酶法測定條件進行殘余酶活的測定，結(jié)果匯總于圖3?？梢?，BAA28的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于BAA。BAA28的pH穩(wěn)定性則與BAA基本一致，即沒有發(fā)生顯著改變(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。

1-BAA，60 ℃，5 mmol/L Ca2+;2-BAA28,60 ℃, 5 mmol/L Ca2+; 3-BAA 28,60 ℃;4-BAA28,70 ℃,5 mmol/L Ca2+;5-BAA,60 ℃; 6-BAA,70 ℃,5 mmol/L Ca2+;7-BAA28,70 ℃;8-BAA,70 ℃圖3 BAA28的熱穩(wěn)定性Fig.3 Effects of temperature on activities of BAA28

2.4.3 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活性的影響

不同金屬離子及化學(xué)試劑對酶活性的影響見表2。BAA28酶活幾乎不依賴Li+、Ca2+、Na+或Co2+，但此4種金屬離子對BAA酶活有顯著促進作用?？梢夿AA28中發(fā)生的組合突變，引起了對金屬離子依賴性的巨大變化。而這一變化明顯有利于此突變體的后續(xù)工業(yè)應(yīng)用，因為長期以來BAA的Ca2+依賴性，是其工業(yè)應(yīng)用屬性中不利的一面[10]。

表2 不同離子和化學(xué)試劑對BAA28酶活力的影響Table 2 Effects of different metal ions and chemicals on BAA28

2.4.4 BAA28動力學(xué)特征

對BAA28進行比酶活測定與酶促反應(yīng)動力學(xué)特征進行分析，結(jié)果匯總于表3。與BAA相比，BAA28的比酶活提高約31%，Vmax和κcat分別提高了2.5倍和1.97倍，κcat/Km值提高92%，即突變酶BAA28的催化效率提高了92%。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究通過分子進化與篩選，獲得了催化屬性顯著改進的BAA突變體，進一步對突變體BAA28進行了較深入的研究與分析，與BAA相比，其比酶活、催化效率等皆有大幅度提升，對金屬離子的依賴性也發(fā)生了顯著變化。這些改進有助于后續(xù)高產(chǎn)菌種的構(gòu)建及其工業(yè)應(yīng)用。

表3 BAA28的酶促動力學(xué)特征Table 3 Kinetic parameters of BAA28

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ConstructionandpropertiesofBacillusamyloliquefaciensα-amylasemutantofimprovedcatalyticefficiency

NIU Dan-dan1， JIN Xiao1, WU Hai-yang2，LIU Xiao-guang2, LIN Juan1, YE Xiu-yun1*

1(College of Biological Science and Engineering, The Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering of Fujian Province, Fuzhou University, Fuzhou 350116,China)2(College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tiqnjin 300457,China)

Bacillusamyloliquefaciensα-amylase (BAA) is one of the most widely used industrial enzymes in the starch processing, food, brewing, fermentation, textile, papermaking, and medical industries. To further enhance fermentation level and application property, the mutant with significantly improved catalytic properties was constructed viainvitromolecular evolution and its nature was preliminarily illustrated. The BAA mutation library, with the mutational frequency of 56%, the efficiency of mutation of 2.8 points/kb DNA, and the missense mutation rate of 26.8%, was constructed with the capacity of 2×104transformants by using error-prone PCR. The BAA mutants with enzymatic activity were screened using halo-plate assay and shaking flask fermentation test. Six mutants with improved activity were selected out and one of which, mutant BAA28, displayed 37% increased activity. Sequencing results illustrated that mutant BAA28 had four separated mutations: T341P, P348L, T356P, and P362L and of which, T341P and T356P were in the random coil structure, P348L was in the-helix structure, and P362L was in the-fold structure. The BAA28 was further heterologously prepared and purified and its biochemical properties were examined in comparison to wild BAA. BAA28 displayed a remarkable change in ion-dependence and thermostability. Its specific activity was significantly increased with 1.31 folds of BAA andκcat/Kmwas increased by 92%. BAA28 mutant performed significantly improved catalysis and application properties in comparison to BAA, which is of potential application in BAA-overproducing strain improvement and industrial properties.

Bacterial α-amylase; mutant; catalysis efficiency

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014866

工學(xué)博士(葉秀云教授為通訊作者,E-mail：xiuyunye@fzu.edu.cn)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2013AA102101)；福建省教育廳產(chǎn)學(xué)研項目(JA15049)；國家自然科學(xué)基金(31601407)；福建省自然科學(xué)基金(2016J01157)

2017-06-01,改回日期：2017-06-21