牛丹丹，靳曉，吳海洋，劉曉光，林娟，葉秀云*

1(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州，350116)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶高活力突變體的創(chuàng)建與性質(zhì)研究

牛丹丹1，靳曉1，吳海洋2，劉曉光2，林娟1，葉秀云1*

1(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州，350116)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

為進(jìn)一步提高解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶(Bacillusamyloliquefaciensα-amylase, BAA)發(fā)酵生產(chǎn)與應(yīng)用性能，對(duì)BAA編碼基因?qū)嵤┝梭w外隨機(jī)突變，建立了含有2×104個(gè)轉(zhuǎn)化子的BAA突變庫(kù)。BAA編碼基因的突變頻率為56%，基因突變效率為2.8/kb DNA，錯(cuò)義突變26.8%；以平板篩選法和搖瓶發(fā)酵法對(duì)BAA突變庫(kù)進(jìn)行篩選，得到6個(gè)酶活力顯著提高的突變體，其中突變體BAA28的酶活力提高最多，提高達(dá)37%；進(jìn)一步分析突變體BAA28序列，發(fā)現(xiàn)其4個(gè)氨基酸殘基發(fā)生突變，分別是：T341P、P348L、T356P和P362L，其中T341P和T356P位于無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)中，P348L位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中，P362L位于β-折疊結(jié)構(gòu)中。進(jìn)一步制備與純化BAA28，并比較分析其酶學(xué)特征，與野生型BAA相比，BAA28的離子依賴(lài)性、熱穩(wěn)定性發(fā)生了顯著變化；BAA28的比酶活提高了約31%，κcat/Km值提高了92%。突變體BAA28較BAA在催化與應(yīng)用屬性上有了顯著提升，可應(yīng)用于后續(xù)中溫α-淀粉酶高產(chǎn)新菌種的構(gòu)建并可顯著改善其工業(yè)應(yīng)用性能。

中溫α-淀粉酶；突變體；催化效率

解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶 (Bacillusamyloliquefaciensα-amylase, BAA)，又被稱(chēng)為中溫α-淀粉酶(簡(jiǎn)稱(chēng)：中淀)，是中高溫段淀粉液化的主要酶種之一[1]，廣泛應(yīng)用于洗滌、造紙、淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、織物退漿、釀造、酒精工業(yè)、有機(jī)酸工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等[2-4]，是我國(guó)工業(yè)酶制劑的重要組成成員。

BAA屬于糖苷水解酶的第13家族 (glycoside hydrolase family 13，GH13)。BAA的編碼基因，首先由PALVA 等于1982年通過(guò)鳥(niǎo)槍法在Bacillussubtilis中克隆成功[5-6]，對(duì)其結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)關(guān)系研究揭示，D194N或E185K突變，可降低BAA的熱穩(wěn)定性[7]；LEE[8]等對(duì) BAA編碼基因進(jìn)行了隨機(jī)突變，發(fā)現(xiàn)位于氨基酸殘基233位置上的 Ca2+結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于 BAA 的性質(zhì)具有重要影響；劉洋等[9-10]對(duì)BAA中Ca2+結(jié)合位點(diǎn)上的氨基酸殘基231、233和438 分別進(jìn)行定點(diǎn)突變，與天然 BAA 相比，3個(gè)突變體的比酶活均有下降，突變體 D233NKm上升了 55.6%，κcat值下降了 85%，另外2個(gè)突變體的Km和κcat值與天然BAA相比沒(méi)有明顯的變化。另一方面，我國(guó)科研工作者運(yùn)用分子克隆與遺傳重組技術(shù)等[9, 11-12]，對(duì)BAA工業(yè)生產(chǎn)菌種進(jìn)行了成功改良，BAA工業(yè)菌種的發(fā)酵生產(chǎn)水平從早期的300 U/mL大幅提升到1 200 U/mL以上，并且顯著改善了發(fā)酵工藝與產(chǎn)品穩(wěn)定性，使我國(guó)成為世界上中溫α-淀粉酶的生產(chǎn)國(guó)與供應(yīng)國(guó)。

與相關(guān)重要淀粉液化酶特別是高溫α-淀粉酶相比，有關(guān)BAA分子特性改良等研究相對(duì)滯后。通過(guò)分子進(jìn)化等技術(shù)提高其催化效率，不僅有助于其工業(yè)應(yīng)用，也有可能進(jìn)一步提高其生產(chǎn)菌種的發(fā)酵生產(chǎn)水平。為此，本文就BAA催化效率的分子進(jìn)化進(jìn)行探索，為后續(xù)BAA生產(chǎn)菌種遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)CICIM B2125為中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌株[9]，用于本研究的BAA編碼基因的供體，大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109和地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)D402[11,13](ΔamyΔhspΔaprE)用于本研究基因克隆與表達(dá)宿主。pND-113為前期經(jīng)pHY-WZX[14]改造獲得，可介導(dǎo)外源基因在大腸桿菌和地衣芽胞桿菌等宿主細(xì)胞中分泌表達(dá)外源酶分子。pND-BAA為本研究構(gòu)建重組分泌表達(dá)質(zhì)粒，含有BAA編碼基因。除特別說(shuō)明外，所有菌株在LB培養(yǎng)基(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%)中，于37 ℃下培養(yǎng)，必要時(shí)在培養(yǎng)基中添加0.5%可溶性淀粉或/和添加20 μg/mL卡那霉素。

1.1.2 工具酶和試劑

限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Pyrobest、TaqDNA聚合酶、dNTPs、三磷酸核苷、MgCl2及MnCl2購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于美國(guó)OMEGA公司，其余化學(xué)常用試劑均為進(jìn)口或國(guó)藥分析純。BAA純品為實(shí)驗(yàn)室前期純化并保存。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆常規(guī)操作

PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒DNA和PCR產(chǎn)物的提取、純化、酶切、瓊脂糖凝膠電泳、連接、轉(zhuǎn)化等按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[15]。DNA序列測(cè)定采用Sanger氏的雙脫氧末端鏈終止法進(jìn)行。

1.2.2 BAA編碼基因的PCR擴(kuò)增

以B.amyloliquefaciensB2125基因組DNA為模板，以引物BAA-F(5′-TACGGATCCGTAAATGGCACGCTGATGCAGTAT-3′，下劃線處為外加克隆位點(diǎn)BamHI)和BAA-R (5′-TTATTTCTGAACATAAATGGAGACGG-3′)介導(dǎo)目的基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系50 μL模板DNA 1 μL，10×PCR 緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，BAA-F 1 μL，BAA-R 1 μL，Pyrobest DNA多聚酶0.2 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL；PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s)；72 ℃，10 min。

1.2.3 易錯(cuò)PCR反應(yīng)

易錯(cuò)PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：10×PCR 緩沖液(不含Mg2+和Mn2+)5 μL，100 mmol/L dCTP 0.5 μL，100 mmol/L dTTP 0.5 μL，10 mmol/L dATP 1 μL，10 mmol/L dGTP 1 μL，Mg2+6.5 mmol/L, Mn2+0.5 mmol/L, BAA-F 1 μL，BAA-R 1 μL，BamHI線性化pND-BAA DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增在TaqDNA多聚酶介導(dǎo)下進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s)；72 ℃，10 min。

1.2.4 BAA突變體庫(kù)搭建與突變效率檢驗(yàn)

將易錯(cuò)PCR產(chǎn)物純化后，先用DpnI酶切去除模板DNA，再用BamHI酶切，然后與表達(dá)質(zhì)粒pND113進(jìn)行連接，連接物轉(zhuǎn)化入宿主E.coliJM109,將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種于96孔微孔板中，培養(yǎng)并保藏。隨機(jī)挑取100個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取其質(zhì)粒DNA，進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，統(tǒng)計(jì)基因中堿基突變、突變方式及氨基酸突變等。

1.2.5 BAA突變體初篩與復(fù)篩

突變體初篩：在篩選平板(含有0.5%淀粉的LB平板)點(diǎn)種轉(zhuǎn)化子并以E.coliJM109 (pND-BAA)為對(duì)照，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)16～24 h后，目測(cè)淀粉水解圈大小，挑取透明圈明顯增大者保藏及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

將初篩得到的透明圈增大的轉(zhuǎn)化子和對(duì)照J(rèn)M109 (pND-BAA)，1株3瓶接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)12 h后，以10%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%乳糖)，37 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)36 h后，將各菌株培養(yǎng)液10 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集上清液，并測(cè)定淀粉酶酶活力。其質(zhì)粒DNA經(jīng)分離純化后進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定與分析。

1.2.6 BAA突變體的制備與純化

地衣芽胞桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)方法進(jìn)行[14]。將上述獲得的BAA突變體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌D402，在含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上于37 ℃培養(yǎng)2～3 d，篩選出轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)12～14 h作為種子，以10%(v/v)的接種量接于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%乳糖)，在37 ℃，220 r/min 條件下發(fā)酵培養(yǎng)120 h，發(fā)酵結(jié)束后，離心收集上清液，即為BAA突變體粗酶液。酶液純化用AKTA pure system H8(29-2827-26型，GE Healthcare 公司)進(jìn)行。蛋白質(zhì)純度用SDS-PAGE進(jìn)行分析[15]，蛋白質(zhì)濃度按照Bradford的蛋白質(zhì)微量測(cè)定方法進(jìn)行。

1.2.7 酶活測(cè)定

用DNS法[10]。酶活力單位定義為：1 mL稀釋酶液在pH 6.0、60 ℃條件下，1 h水解1.0 %可溶性淀粉產(chǎn)生相當(dāng)于1 mg葡萄糖還原力，定義為1個(gè)酶活力。

1.2.8 酶學(xué)性質(zhì)與特征分析

1.2.8.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

在不同溫度下(30～90 ℃)測(cè)定的淀粉酶活力，以測(cè)得的最高酶活力為100%，計(jì)算其他溫度下的相對(duì)酶活力，確定最適反應(yīng)溫度；在反應(yīng)體系中添加或不添加5 mmol/L Ca2+，將其置于60 ℃或70 ℃水浴中，保溫60 min，每隔15 min取樣，冰浴30 min后，用1.2.7的方法在最適溫度下測(cè)定處理后酶液的殘余酶活力，以未進(jìn)行熱處理的酶液酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，以確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8.2 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

在60 ℃條件下，分別測(cè)定不同pH緩沖溶液下的酶活力，以測(cè)得的最高酶活力值為100%，計(jì)算其他pH條件下的相對(duì)酶活力，確定最適反應(yīng)pH。將酶液置于不同pH值的緩沖液于37 ℃保溫1 h，然后用1.2.7的方法測(cè)定酶液的殘余酶活力，以確定酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.8.3 不同金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

在酶的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度條件下，研究金屬離子和化學(xué)試劑(Na+、Ca2+、K+、Co+、Li+、Mg2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+、EDTA、SDS)對(duì)酶活性的影響，以相同條件下未加金屬離子和化學(xué)試劑的酶反應(yīng)為對(duì)照。

1.2.8.4 酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

配制不同濃度的可溶性淀粉溶液為底物，在pH 6.0，溫度60 ℃條件下，反應(yīng)10 min，采用DNS法測(cè)定酶活力，計(jì)算酶促反應(yīng)速度，測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.9 生物信息學(xué)分析

核苷酸序列與氨基酸序列分析采用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行，BAA及其突變體的3D結(jié)構(gòu)模擬采用SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行分析(https://swissmodel.expasy.org/)。

2 結(jié)果與討論

2.1 BAA編碼基因的克隆、表達(dá)與突變體庫(kù)的搭建

以B.amyloliquefaciensB2125基因組DNA為模板，克隆出大小約1.4 kb、編碼BAA成熟肽的編碼基因amyQ[9-10]，將其克隆入表達(dá)質(zhì)粒pND-113，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pND-BAA，此質(zhì)粒能夠在E.coliJM109中分泌表達(dá)BAA，在淀粉平板上可形成典型的淀粉水解透明圈。

以BamHI線性化的pND-BAA為模板，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化與酶切后克隆入表達(dá)質(zhì)粒pND-113并轉(zhuǎn)化入E.coliJM109，點(diǎn)種轉(zhuǎn)化子于含200 μL培養(yǎng)基的96孔微孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)13～15 h，分裝與保藏，由此搭建出庫(kù)容為2×104個(gè)轉(zhuǎn)化子的BAA突變庫(kù)。隨機(jī)挑取其中100個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析，有99個(gè)轉(zhuǎn)化子含有重組質(zhì)粒，其中有56個(gè)轉(zhuǎn)化子的BAA編碼基因發(fā)生了突變，包括26.8%發(fā)生單點(diǎn)突，14.3%發(fā)生雙位點(diǎn)突變，57.1%發(fā)生多位點(diǎn)突變，1.8%發(fā)生無(wú)義突變，1 kb基因平均有2.8個(gè)堿基發(fā)生突變，同義突變率占73.2%，非同義突變率占26.8%，基本滿足篩選需要。

2.2 BAA酶活提高突變體的篩選

在含有可溶性淀粉的篩選平板上，通過(guò)目測(cè)透明圈大小對(duì)BAA突變體進(jìn)行初篩，共篩選得到68株透明圈大于對(duì)照的轉(zhuǎn)化子，占比0.68%。進(jìn)一步通過(guò)搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩，最終篩選得到6株酶活力高于對(duì)照的突變體，以其中的突變體BAA28酶活力提高最高，是BAA的1.37倍(表1)，以此作為后續(xù)進(jìn)一步研究對(duì)象。

表1 BAA突變體復(fù)篩Table 1 The secondary screening results of BAA mutants

2.3 BAA28突變體序列分析

對(duì)BAA28突變體的編碼基因進(jìn)行序列測(cè)定與分析，其分子共發(fā)生了有7個(gè)堿基突變(G513A、T627C、A1021C、CG1044TT、A1066C、C1085T)并引起4個(gè)氨基酸殘基 (T341P、P348L、T356P、P362L) 發(fā)生變化。從一級(jí)結(jié)構(gòu)看，BAA28的4個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)均位于(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)處，即α-淀粉酶家族中的催化區(qū)域，由203-392 aa折疊形成[16]；從二級(jí)結(jié)構(gòu)看，BAA28的突變位點(diǎn)T341P和T356P位于無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)中，P348L位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中，而P362L位于β-折疊的結(jié)構(gòu)中[16]；從三級(jí)結(jié)構(gòu)看，各突變酶的三維結(jié)構(gòu)和BAA相比，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的差異[16]。

2.4 BAA28酶學(xué)特征

將重組質(zhì)粒pND-BAA28轉(zhuǎn)化入B.licheniformisD402，獲得重組菌D402(pND-BAA28)，通過(guò)搖瓶發(fā)酵制備酶液，經(jīng)純化，在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，大小約58 kDa(圖1)?？梢杂糜诤罄m(xù)酶學(xué)特征分析。采用B.amyloliquefacientsM2125發(fā)酵制備BAA酶液并純化(圖1)，用于后續(xù)研究對(duì)照。

M-相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-BAA28粗酶液；2-純化后的BAA28；3-BAA發(fā)酵液；4-純化后的BAA圖1 BAA28純化后的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE profile of the purified BAA28

2.4.1 最適作用溫度和最適作用pH

將BAA28置于不同溫度或不同pH條件下測(cè)定其酶活力，BAA28的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適作用pH為6.0；在50～70 ℃或pH5～8下皆具有較高活力。此特性與BAA基本保持一致(圖2)。

圖2 BAA28的最適作用溫度(A)與最適作用pH(B)Fig.2 Temperature (A) and pH (B)optima of BAA28

2.4.2 熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性

在反應(yīng)體系中添加或不添加5 mmol/L Ca2+，并在不同溫度(60 ℃，70 ℃)或不同pH下保溫，然后按照標(biāo)準(zhǔn)酶法測(cè)定條件進(jìn)行殘余酶活的測(cè)定，結(jié)果匯總于圖3?？梢?jiàn)，BAA28的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于BAA。BAA28的pH穩(wěn)定性則與BAA基本一致，即沒(méi)有發(fā)生顯著改變(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。

1-BAA，60 ℃，5 mmol/L Ca2+;2-BAA28,60 ℃, 5 mmol/L Ca2+; 3-BAA 28,60 ℃;4-BAA28,70 ℃,5 mmol/L Ca2+;5-BAA,60 ℃; 6-BAA,70 ℃,5 mmol/L Ca2+;7-BAA28,70 ℃;8-BAA,70 ℃圖3 BAA28的熱穩(wěn)定性Fig.3 Effects of temperature on activities of BAA28

2.4.3 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響

不同金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響見(jiàn)表2。BAA28酶活幾乎不依賴(lài)Li+、Ca2+、Na+或Co2+，但此4種金屬離子對(duì)BAA酶活有顯著促進(jìn)作用。可見(jiàn)BAA28中發(fā)生的組合突變，引起了對(duì)金屬離子依賴(lài)性的巨大變化。而這一變化明顯有利于此突變體的后續(xù)工業(yè)應(yīng)用，因?yàn)殚L(zhǎng)期以來(lái)BAA的Ca2+依賴(lài)性，是其工業(yè)應(yīng)用屬性中不利的一面[10]。

表2 不同離子和化學(xué)試劑對(duì)BAA28酶活力的影響Table 2 Effects of different metal ions and chemicals on BAA28

2.4.4 BAA28動(dòng)力學(xué)特征

對(duì)BAA28進(jìn)行比酶活測(cè)定與酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，結(jié)果匯總于表3。與BAA相比，BAA28的比酶活提高約31%，Vmax和κcat分別提高了2.5倍和1.97倍，κcat/Km值提高92%，即突變酶BAA28的催化效率提高了92%。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究通過(guò)分子進(jìn)化與篩選，獲得了催化屬性顯著改進(jìn)的BAA突變體，進(jìn)一步對(duì)突變體BAA28進(jìn)行了較深入的研究與分析，與BAA相比，其比酶活、催化效率等皆有大幅度提升，對(duì)金屬離子的依賴(lài)性也發(fā)生了顯著變化。這些改進(jìn)有助于后續(xù)高產(chǎn)菌種的構(gòu)建及其工業(yè)應(yīng)用。

表3 BAA28的酶促動(dòng)力學(xué)特征Table 3 Kinetic parameters of BAA28

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ConstructionandpropertiesofBacillusamyloliquefaciensα-amylasemutantofimprovedcatalyticefficiency

NIU Dan-dan1， JIN Xiao1, WU Hai-yang2，LIU Xiao-guang2, LIN Juan1, YE Xiu-yun1*

1(College of Biological Science and Engineering, The Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering of Fujian Province, Fuzhou University, Fuzhou 350116,China)2(College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tiqnjin 300457,China)

Bacillusamyloliquefaciensα-amylase (BAA) is one of the most widely used industrial enzymes in the starch processing, food, brewing, fermentation, textile, papermaking, and medical industries. To further enhance fermentation level and application property, the mutant with significantly improved catalytic properties was constructed viainvitromolecular evolution and its nature was preliminarily illustrated. The BAA mutation library, with the mutational frequency of 56%, the efficiency of mutation of 2.8 points/kb DNA, and the missense mutation rate of 26.8%, was constructed with the capacity of 2×104transformants by using error-prone PCR. The BAA mutants with enzymatic activity were screened using halo-plate assay and shaking flask fermentation test. Six mutants with improved activity were selected out and one of which, mutant BAA28, displayed 37% increased activity. Sequencing results illustrated that mutant BAA28 had four separated mutations: T341P, P348L, T356P, and P362L and of which, T341P and T356P were in the random coil structure, P348L was in the-helix structure, and P362L was in the-fold structure. The BAA28 was further heterologously prepared and purified and its biochemical properties were examined in comparison to wild BAA. BAA28 displayed a remarkable change in ion-dependence and thermostability. Its specific activity was significantly increased with 1.31 folds of BAA andκcat/Kmwas increased by 92%. BAA28 mutant performed significantly improved catalysis and application properties in comparison to BAA, which is of potential application in BAA-overproducing strain improvement and industrial properties.

Bacterial α-amylase; mutant; catalysis efficiency

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014866

工學(xué)博士(葉秀云教授為通訊作者,E-mail：xiuyunye@fzu.edu.cn)。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA102101)；福建省教育廳產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(JA15049)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31601407)；福建省自然科學(xué)基金(2016J01157)

2017-06-01,改回日期：2017-06-21