李曉華，梅 楓，孔 雯，李 陽(yáng)，馬婷婷，皮 婷

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

尼古丁微生物降解代謝機(jī)制和應(yīng)用的研究進(jìn)展

李曉華，梅 楓，孔 雯，李 陽(yáng)，馬婷婷，皮 婷

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

為進(jìn)一步了解利用生物降解消除環(huán)境中尼古丁污染的最有前景的方法，綜述了國(guó)內(nèi)外尼古丁降解微生物、尼古丁降解代謝途徑(真菌的去甲基化途徑、革蘭氏陽(yáng)性菌的吡啶和吡咯途徑、革蘭氏陰性菌吡啶與吡咯途徑的混合途徑)、降解基因簇及其在環(huán)保和藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，旨在為微生物降解尼古丁的深入研究和應(yīng)用提供參考.

尼古?。晃⑸锝到?；代謝途徑；應(yīng)用

尼古丁[1-甲基-2-(3-吡啶基)-吡咯烷]是一種存在于茄科植物(茄屬)中的生物堿，是煙草的重要成分，占煙葉干重的2%～8%[1]. 自然環(huán)境和人類生活環(huán)境中的尼古丁污染大部分來(lái)源于煙草工業(yè)廢棄物，煙草工業(yè)每年生產(chǎn)約300274 t尼古丁廢棄物[2]. 尼古丁易溶于水，導(dǎo)致地下水的污染，擾亂生態(tài)平衡. 因此，將尼古丁污染從土地和水中移除成為了亟待解決的問(wèn)題.

尼古丁能引起嚴(yán)重的血管疾病、癌癥、基因突變、畸形等，作為神經(jīng)毒素能影響細(xì)胞凋亡、細(xì)胞的畸形生長(zhǎng)、提高基因表達(dá)率、分泌激素和調(diào)節(jié)酶的活性等. 它還能快速地通過(guò)生物膜和血腦屏障，加快心率和升高動(dòng)脈壓，引起靜脈功能障礙. 尼古丁還通過(guò)作用于位于中央神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)型尼古丁受體，釋放如多巴胺和血清素的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，激活大腦皮層中心多巴胺系統(tǒng)，加強(qiáng)生理依賴效應(yīng)[3].

目前，降解尼古丁的主要方法有物理法、化學(xué)法和生物法. 物理法包括吸附法和萃取法；化學(xué)法則是利用強(qiáng)氧化劑改變尼古丁官能團(tuán)或化學(xué)鍵的性質(zhì)降解尼古丁. 但是物理或化學(xué)方法降解尼古丁耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)高、效率低、易造成二次污染，故利用生物降解是消除環(huán)境中尼古丁污染的最有前景的方法. 近年來(lái)，越來(lái)越多的尼古丁降解菌被分離，在尼古丁的微生物降解途徑和應(yīng)用方面取得進(jìn)展. 本文對(duì)國(guó)內(nèi)外尼古丁降解微生物、尼古丁降解代謝途徑及其降解基因簇研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述.

1 降解尼古丁的微生物

降解尼古丁的微生物易適應(yīng)被污染的環(huán)境，煙草環(huán)境中的細(xì)菌和真菌都有降解尼古丁的能力[4]，通常將尼古丁作為生長(zhǎng)所需的唯一碳源、氮源和能源. 自20世紀(jì)50年代起，尼古丁降解菌Arthrobacternicotinovorans已被廣泛研究，近年來(lái)，越來(lái)越多的節(jié)桿菌被報(bào)道能夠降解尼古丁(見(jiàn)表1).

從煙草種植地分離出的尼古丁降解菌ArthrobacternicotianaeK9，能在尼古丁濃度達(dá)到1.0 g/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，尼古丁降解效率在24 h內(nèi)達(dá)到85%[5]. Lei 等[6]用節(jié)桿菌K7和K3的細(xì)菌懸液處理收獲的K326煙葉，煙葉的尼古丁含量減少. Ruan等[7]發(fā)現(xiàn)的Arthrobactersp. HF-2降解尼古丁的最適溫度為30℃，最適pH為7.0. 在1953年，Wada和Yamasaki從土壤中分離出Pseudomonassp. 41，該菌株能在pH 6.4和30℃下降解尼古丁[8]. 假單胞菌屬中的尼古丁降解菌能在高濃度尼古丁的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，尼古丁降解效率隨著細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)而增加，降解最適pH值為6.4～7.4，最適溫度為30℃，而PseudomonasstutzeriZCJ為37℃[9].從土壤和煙葉中分離得到的降解尼古丁的細(xì)菌除了節(jié)桿菌和假單胞菌，還包括Rhodococcussp. Y22，Ensifersp. N7，AgrobacteriumtumefaciensS33，Acinetobactersp. TW和Ochrobactrumsp. SJY1等細(xì)菌. 大多數(shù)細(xì)菌能夠在28～30℃、pH 7.0的條件下降解尼古丁，還有少數(shù)真菌被分離鑒定能夠降解尼古丁.

表1 尼古丁降解微生物及其降解最適條件Tab.1 Nicotine-degrading microorganisms and their optimal condition for degradation

注：-表示文獻(xiàn)中未報(bào)道

2 微生物中尼古丁降解基因

編碼尼古丁降解的基因不僅位于細(xì)菌染色體上，也存在于質(zhì)粒上P.convex菌株尼古丁降解基因，除在染色體之外，由NIC質(zhì)粒介導(dǎo).A.nicotinovorans中大小為160 kb的質(zhì)粒pAO1(見(jiàn)圖1，參考文獻(xiàn)[10、14、24、29])包含負(fù)責(zé)尼古丁降解的基因簇. Brandsch等[4]對(duì)pAO1進(jìn)行亞克隆，利用表達(dá)載體pBR322和pUR222將6hdno基因在大腸桿菌進(jìn)行表達(dá). Grether等[36]測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，ndh基因與6hdno基因緊密相鄰，3個(gè)不同大小的亞基組成了ndh基因，ndhA基因在ORFX(1個(gè)小的開(kāi)放閱讀框)之后，6hlno基因則在ndhC基因之后. Schenk[37]等利用噬菌體構(gòu)建了質(zhì)粒pAO1的DNA文庫(kù)，篩選到基因6hlno和基因kdh. Brandsch等[4]將pAO1進(jìn)行了全序列測(cè)定，推測(cè)尼古丁轉(zhuǎn)運(yùn)載體與6hdno形成一個(gè)基因簇. Chiribau等[38]從pAO1中克隆了包含purU-mabO-folD操縱子的基因簇，該操縱子僅在有尼古丁的條件下轉(zhuǎn)錄，并被轉(zhuǎn)錄激活因子pmfR調(diào)控.

通過(guò)基因組挖掘和代謝分析，Wang等[14]在Pseudomonassp. S16中發(fā)現(xiàn)了nic基因簇，4879 bp的nic基因簇編碼3個(gè)ORF，ORF1編碼nicA基因，ORF2編碼hspA基因，ORF3功能未知. 新驗(yàn)證的hspB基因位于遠(yuǎn)離nic基因簇30 kb的基因簇上. 在Pseudomonassp. HZN6中，已驗(yàn)證了4種主要的中間代謝產(chǎn)物，分別為pseudooxynicotine(假氧化尼古丁)、SP(3-琥珀酰吡啶)、HSP(6-羥基-3-琥珀酰吡啶)和不穩(wěn)定的復(fù)合物SAP(3-琥珀酰半醛吡啶)，并外源表達(dá)了3種尼古丁降解基因(SirA2、pna、sap). 基因SirA2編碼SirA2蛋白，是巰基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)SP的降解. 假氧化尼古丁在基因pna編碼的假氧化尼古丁胺氧化酶(PNAO)的催化作用下轉(zhuǎn)化生成SAP. 基因sap編碼依賴NADP+的3-琥珀酰半醛脫氫酶(SAPD)，使SAP脫氫生成SP[39]. Wang等[40]研究表明Pseudomonassp. HF-1的尼古丁降解基因位于質(zhì)粒pMF1(21 kb)，并通過(guò)非染色體DNA的質(zhì)粒調(diào)節(jié).

通過(guò)生物信息學(xué)、轉(zhuǎn)錄分析和異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)，許平等定位了Ochrobactrumsp. Strain SJY1降解尼古丁的基因簇. VPP基因簇包含6個(gè)基因，基因vppB與基因6hlno有24.4%的氨基酸同源性，基因vppD與基因hspB有61.8%的氨基酸同源性，基因vppH到基因vppG作為一個(gè)連續(xù)的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄，可催化2,5-DHP(2,5-二羥基吡啶)到延胡索酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程[24].

SYJ1: Ochrobactrum sp. SJY1; S16: Pseudomonas putida S16; pAO1: Arthrobacter nicotinovorans pAO1;KT2440: Pseudomonas putida KT2440; HZN7: Shinella sp. HZN7圖1 已報(bào)道的尼古丁降解基因簇Fig.1 Gene cluster of reported nicotine degradation

3 微生物降解尼古丁的代謝途徑

微生物降解尼古丁的途徑因不同的菌種而有所差異. 革蘭氏陽(yáng)性菌Arthrobactersp.的尼古丁降解途徑是吡啶途徑，降解過(guò)程中相關(guān)的酶首先作用于吡啶環(huán). 革蘭氏陰性菌Pseudomonassp.的尼古丁降解途徑是吡咯途徑，降解過(guò)程中相關(guān)的酶首先作用于吡咯環(huán). 尼古丁降解真菌一般是去甲基化途徑，即去掉尼古丁吡咯環(huán)的甲基基團(tuán). 最近有研究表明根癌土壤桿菌和蒼白桿菌的尼古丁降解途徑是吡啶途徑與吡咯途徑的混合途徑，即該途徑起始于吡啶途徑，之后轉(zhuǎn)變?yōu)檫量┩緩?

3.1 去甲基化途徑

與尼古丁降解細(xì)菌相比，只有少數(shù)真菌被分離鑒定為能夠降解尼古丁，包括Microsporumgypseum，PelliculariafilamentosaJTS-208和Cunninghamellaechinulata. 這些真菌降解尼古丁的步驟都起始于尼古丁的去甲基化，生成去甲尼古丁(nornicotine).

近期，從煙葉中分離出一株降解尼古丁的霉菌，鑒定為A.oryzae112822. 采用TLC、GC-MS、NMR和FT-IR等方法分析該菌株在尼古丁降解過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，并推測(cè)尼古丁降解途徑(見(jiàn)圖2，參考文獻(xiàn)[35]). 該途徑起始于尼古丁吡咯烷的脫甲基化，先生成去甲尼古丁，再通過(guò)形成吡咯環(huán)的雙鍵轉(zhuǎn)化為麥斯明，隨后吡咯烷裂解生成尚不明確的中間代謝產(chǎn)物，該中間代謝產(chǎn)物進(jìn)一步被水解生成N-甲基煙酰胺和乙酸.N-甲基煙酰胺羥基化生成2-羥基-N-甲基煙酰胺，通過(guò)分解代謝生成2,3-DHP(2,3-二羥基吡啶)和CH3NHCOOH，CH3NHCOOH進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成碳酸，2,3-DHP開(kāi)環(huán)生成琥珀酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)[22]. 但真菌的尼古丁降解途徑中參與的酶尚未得到驗(yàn)證.

圖2 Aspergillus oryzae 112822 降解尼古丁的去甲基化途徑Fig.2 Demethylation pathway of nicotine degradation by Aspergillus oryzae 112822

3.2 吡啶途徑

吡啶途徑主要是節(jié)桿菌屬降解尼古丁的途徑，自20世紀(jì)50年代起，Arthrobacteroxidans作為尼古丁降解菌被廣泛研究，Brandsch等[4]闡明了A.nicotinovorans尼古丁代謝途徑和降解途徑.

吡啶途徑降解尼古丁起始于尼古丁吡咯環(huán)的6位碳羥基化，引入羥基基團(tuán)生成6-HN(6-羥基尼古丁). 該步反應(yīng)由NDH(尼古丁脫氫酶)催化，隨后6-HN(6-羥基尼古丁)吡咯環(huán)的2位碳被氧化，生成6-HMM(6-羥基-N-甲基麥斯明)，該步反應(yīng)由6HLNO(6-羥基-L-尼古丁氧化酶)和6HDNO(6-羥基-D-尼古丁氧化酶)催化. 吡啶途徑的第三步是6-HMM(6-羥基-N-甲基麥斯明)的水解反應(yīng)，自發(fā)打開(kāi)吡咯環(huán)，生成6-HPON(6-羥基假氧化尼古丁). 6-HPON吡啶環(huán)的2位碳被與尼古丁脫氫酶相似的KDH(酮脫氫酶)進(jìn)一步羥基化，生成2,6-DHPON(2,6-羥基假氧化尼古丁)，在2,6-DHPONH(2,6-二羥基假氧化尼古丁水解酶)的作用下，2,6-DHPON的側(cè)鏈裂解生成MGABA(γ-N-甲基丁酸辛酯)和2,6-DHP(2,6-二羥基吡啶). 2,6-DHP進(jìn)一步在吡啶環(huán)3位碳上羥基化生成2,3,6-THP (2,3,6-三羥基吡啶)，由2,6-DHPH (2,6-二羥基吡啶-3-羥化酶)催化. 在有氧的條件下，2,3,6-THP自發(fā)氧化，并二聚體化該羥基化的吡啶環(huán)，部分形成尼古丁藍(lán). Chiribau等[38]的研究表明A.nicotinovorans的mobA基因編碼負(fù)責(zé)生成尼古丁藍(lán)的MobA(含鉬輔因子胞嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)移酶).

MGABA進(jìn)一步的降解有兩種途徑：第一種途徑起始于MABO(γ-N-甲基丁酸辛酯氧化酶)的催化，生成GABA(γ-氨基丁酸)和亞甲基四氫葉酸. 亞甲基四氫葉酸進(jìn)一步被FoLD(亞甲基-四氫葉酸脫氫酶)和PurU(甲酰四氫葉酸脫甲酰酶)催化轉(zhuǎn)化生成甲醛，甲醛可能進(jìn)入糖酵解途徑. 而另外的代謝產(chǎn)物GABA則被MAO(單胺氧化酶)分解成NH3和Ssa(琥珀酸半醛). Ssa進(jìn)一步被依賴于NADP+的SsaDH(琥珀酸半醛脫氫酶)氧化生成琥珀酸，琥珀酸可能進(jìn)入三羧酸循環(huán). MGABA的第二種降解途徑是MGABA通過(guò)AO(單胺氧化酶)脫氨基生成Ssa和甲胺，并伴隨著FAD還原成FADH2，最后生成琥珀酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)(見(jiàn)圖3，參考文獻(xiàn)[10]).

3.3 吡咯途徑

吡咯途徑是假單胞菌屬降解尼古丁的主要途徑，有大量的代謝多樣性，Ruan等[7]發(fā)現(xiàn)Pseudomonassp. HF-1有其他3種與Pseudomonassp. S16不完全相同的吡咯途徑，例如尼古丁轉(zhuǎn)化為可替寧，或者轉(zhuǎn)化為二烯尼古丁、去甲尼古丁，而Pseudomonassp. Nic22則是經(jīng)過(guò)可替寧和去甲尼古丁的吡咯途徑降解尼古丁.

假單胞菌降解尼古丁的吡咯途徑已被廣泛研究，Chen等[15]闡明PseudomonasputidaS16的吡咯途徑起始于尼古丁的吡咯環(huán)形成雙鍵轉(zhuǎn)化為N-甲基麥斯明，nicA基因編碼的NicA(尼古丁氧化還原酶)催化該步脫氫反應(yīng)，NicA還參與尼古丁轉(zhuǎn)化為SP(3-琥珀酰吡啶)的過(guò)程. 第二步反應(yīng)是可逆反應(yīng)，N-甲基麥斯明的雙鍵自發(fā)水解生成假氧化尼古丁，后者是一種煙草特異性的肺部致癌物質(zhì)的前體物質(zhì)[17]，該物質(zhì)進(jìn)一步通過(guò)NicA脫氫生成甲胺和SP.

Qiu等[17]推測(cè)在假氧化尼古丁轉(zhuǎn)化為SP的過(guò)程中產(chǎn)生了兩種不穩(wěn)定的復(fù)合物. SP的6位碳進(jìn)一步被尚不明確的酶催化水解生成HSP(6-羥基-3-琥珀酰吡啶). 基因hsp編碼HSP羥化酶，作用于HSP的3位碳，生成2,5-DHP(2,5-二羥基吡啶)和Ssa(琥珀酸半醛). 2,5-DHP進(jìn)一步降解生成順丁烯酰胺酸，通過(guò)水解作用脫氨基，生成順丁烯. 順丁烯的5、6位碳裂解生成丙酮酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)(見(jiàn)圖4，參考文獻(xiàn)[14]). Ssa則被SsaDH(琥珀酸半醛脫氫酶)轉(zhuǎn)化為琥珀酸，該酶在Pseudomonassp.中常見(jiàn). 編碼HSP羥化酶的基因hspA和hspB參與HSP到2,5-DHP的轉(zhuǎn)化，該氧化反應(yīng)中2分子氧中1個(gè)氧結(jié)合到底物，另1個(gè)氧則用于氧化NADH或NADPH. HspA是NADH依賴的，HspB則需要FAD作為輔基.

圖3 A. nicotinovorans降解尼古丁的吡啶途徑Fig.3 Pyridine pathway of nicotine degradation by A. nicotinovorans

圖4 Pseudomonas putida S16降解尼古丁的吡咯途徑Fig.4 Pyrrolidine pathway of nicotine degradation by Pseudomonas putida S16

然而，Pseudomonassp. Nic22降解尼古丁的途徑屬于另外的吡咯途徑，在尼古丁降解過(guò)程中產(chǎn)生myosmine(麥斯明)，2,3-dipyridyl(2,3-二吡啶)和cotinine(可替寧)等中間代謝產(chǎn)物.Shinellasp. HZN1在尼古丁降解過(guò)程中產(chǎn)生了3種中間代謝產(chǎn)物，通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用分析，驗(yàn)證確定為cotinine、myosmine、nicotyrine(二烯尼古丁)[41].PseudomonasCS3產(chǎn)生3種新型的中間代謝產(chǎn)物[36]，尼古丁脫甲基生成3-(3,4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl) pyridine[3-(3,4-二羥基-2H-5-吡咯)吡啶]，尼古丁吡咯環(huán)的2位碳羥基化，生成1-methyl-5-(3-pyridyl) pyrroline-2-ol[1-甲基-5-(3-吡啶)-2-吡咯]，進(jìn)而生成cotinine.PseudomonasputidaJ5的基因panB編碼酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，參與尼古丁的分解代謝. 吡咯途徑的終產(chǎn)物丙酮酸是酮異戊酸的前體物質(zhì)，該物質(zhì)通過(guò)酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)生成維生素、泛酸鹽[42].

Raman等稱PseudomonasplecoglossicidaTND35的尼古丁降解途徑是一種吡咯途徑的變異途徑，不同于其他細(xì)菌和真菌，TND35菌株氧化尼古丁的部分吡咯環(huán)生成N-methylmyosmine(N-甲基麥斯明)，該中間代謝產(chǎn)物的吡咯2位進(jìn)一步羥基化，生成一種新型的類似于可替寧的代謝產(chǎn)物IM2 [2,3-二羥基-1-甲基-5-(3-吡啶)-1H-2-吡咯][43]. IM2經(jīng)過(guò)脫甲基和羥基化，進(jìn)一步氧化生成另一種類似于可替寧的代謝產(chǎn)物IM3 [5-(3-吡啶)-1H-吡咯]，同時(shí)IM2被氧化并生成甲胺. 最后吡咯環(huán)開(kāi)環(huán)生成終產(chǎn)物IM4[4-羥基-1-(3-吡啶)-1-丁酮] . 但是，在尼古丁降解過(guò)程中還觀察到IM5(1-甲基2-吡咯烷)的存在.

3.4 吡啶途徑與吡咯途徑的混合途徑

越來(lái)越多的細(xì)菌被鑒定能夠降解尼古丁，如Rhodococcussp. Y22、Ensifersp. N7、AgrobacteriumtumefaciensS33、Acinetobactersp. TW和Ochrobactrumsp. SJY1. 其中AgrobacteriumtumefaciensS33、Ochrobactrumsp. SJY1和Shinellasp. HZN7，已有研究表明尼古丁降解途徑是吡啶途徑與吡咯途徑的混合途徑[24]. 通過(guò)TLC、HPLC、GC-MS等分析了Ochrobactrumsp. Strain SJY1的中間代謝產(chǎn)物. 在SYJ1菌株中，尼古丁在含鉬的尼古丁羥化酶VPPA的作用下轉(zhuǎn)化為6HN(6-羥基-尼古丁)，該酶由兩個(gè)亞基組成，小亞基有兩個(gè)[2Fe-2S]簇結(jié)合域，大亞基有一個(gè)MoCo-結(jié)合域. 然后，VPPB(6HN氧化酶)催化6HN轉(zhuǎn)化為6HMM(6-羥基-N-甲基麥斯明)，VPPB以FAD作為輔酶. 6HMM自發(fā)水解生成6HPON(6-羥基假氧化尼古丁). 至此，VPP途徑與吡啶途徑的前半部分相同，隨后經(jīng)過(guò)6HPON轉(zhuǎn)化為4-(6-羥基吡啶)-4-氧代丁醛作為過(guò)渡的中間代謝產(chǎn)物，再經(jīng)酶轉(zhuǎn)化為HSP (6-羥基-3-琥珀酰吡啶)，進(jìn)入VPP途徑與吡咯途徑后半部分相同的階段. HSP在VPPD(HSP-3-單氧酶)的催化作用下生成2,5-DHP (2,5-二羥基吡啶)，該步是吡咯途徑的關(guān)鍵步驟，并且VPPD是需FAD作為輔酶、NAD(P)H依賴的酶. 2,5-DHP在VPPE(2,5-DHP雙加氧酶)的催化作用下打開(kāi)吡啶環(huán)，再在脫甲酰酶VPPF的作用下生成順丁烯酰胺酸，順丁烯酰胺酸經(jīng)去酰胺作用轉(zhuǎn)化為順丁烯，在順丁烯二酸異構(gòu)酶的作用下生成延胡索酸(見(jiàn)圖5，參考文獻(xiàn)[24]).

圖5 Ochrobactrum sp. SJY1降解尼古丁的吡啶與吡咯的混合途徑Fig.5 A composited pathway of pyridine and pyrrolidine of nicotine degradated by Ochrobactrum sp. SJY1

4 尼古丁降解微生物的應(yīng)用

4.1 提高煙葉和煙草產(chǎn)品的質(zhì)量

尼古丁降解菌已被用于減少煙葉中的尼古丁含量和提高香煙產(chǎn)品的質(zhì)量. 如Cellulomonassp.和Pseudomonasputida在含尼古丁和硝酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，在含氧或不含氧的條件下用含菌的培養(yǎng)基處理白肋煙，降低了煙草的硝酸鹽和尼古丁含量，產(chǎn)出降低了氧化氮、氰化氫和尼古丁含量的、溫和的、而沒(méi)有損失理想風(fēng)味和特性的煙草制品[44,45].

4.2 處理煙草廢棄物

許多微生物具有降解尼古丁和其他煙草廢棄物中有害的化合物的能力，SBR(序批式反應(yīng)器)技術(shù)已經(jīng)成為處理煙草廢水的一個(gè)好的選擇，如Pseudomonassp. HF-1加入SBR系統(tǒng)中，與非自動(dòng)化的系統(tǒng)相比，基礎(chǔ)自動(dòng)化系統(tǒng)表現(xiàn)出強(qiáng)有力的污水降解能力，在12 h能降解100%的尼古丁，并減少了84%的化學(xué)需氧量[21]. 利用尼古丁降解菌Acinetobactersp. TW也可以構(gòu)建基礎(chǔ)自動(dòng)化系統(tǒng)，該系統(tǒng)中尼古丁的降解率達(dá)到95%，有機(jī)物的去除率達(dá)80% ～ 90%. 而且在TW菌株和土著菌株中未見(jiàn)明顯的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系. TW菌株在系統(tǒng)中的分布可能有助于尼古丁的降解，使活性污泥中的土著菌株免于尼古丁毒性的傷害，并增加了基礎(chǔ)自動(dòng)化系統(tǒng)中的生物多樣性. 微生物產(chǎn)甲烷作用和堆肥也被應(yīng)用于降解煙草廢棄物中的尼古丁.

4.3 檢測(cè)環(huán)境中的尼古丁含量

通過(guò)基因工程改造微生物作為生物傳感器，用于原位環(huán)境檢測(cè)，根據(jù)已知微生物的尼古丁降解酶的相關(guān)信息，在尼古丁降解微生物中合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子. 利用大腸桿菌表達(dá)調(diào)節(jié)因子等相關(guān)基因，產(chǎn)生的調(diào)節(jié)蛋白作為環(huán)境中存在尼古丁時(shí)的效應(yīng)物分子，可發(fā)展為尼古丁敏感探測(cè)器. 利用6HDNO(6-羥基-D-尼古丁氧化酶)操縱子的啟動(dòng)子和阻遏蛋白構(gòu)建響應(yīng)6HN的可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，為尼古丁敏感探測(cè)器研究提供基礎(chǔ)[10].

4.4 產(chǎn)生有醫(yī)用價(jià)值的中間代謝產(chǎn)物

尼古丁降解微生物能將尼古丁轉(zhuǎn)化為多種中間代謝產(chǎn)物，其中一些中間代謝產(chǎn)物被用于制藥工業(yè). 如吡啶衍生物被廣泛用于抗癌、鎮(zhèn)痛、治療帕金森、緩解高血壓和中央神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂. DHP可用于合成植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、除草劑、抗癌藥、亞鐵血紅素和葉綠素的卟啉類類似物. HSP是合成地棘蛙素類似物藥物的前體，地棘蛙素是一種極其有效的止痛劑分子. Wang等[46]發(fā)現(xiàn)一種利用假單胞菌S16的細(xì)胞將煙草廢棄物中的(S′)-尼古丁轉(zhuǎn)化為HSP的技術(shù)，HSP易于從反應(yīng)物中分離，避免了復(fù)雜的分離步驟. Yu等[24]構(gòu)建了一株工程菌P.putidaP-HSP，該菌株能夠從含有高濃度尼古丁的煙草廢棄物中產(chǎn)出HSP.

4.5 為戒煙提供新方法

目前，用于戒煙有顯著臨床療效的典型藥理方法如尼古丁替代療法、抗抑郁藥物安非他酮，最新的瓦倫尼克林均表現(xiàn)出了較高的禁煙率. 但僅有15%～30%的吸煙者能在治療后維持戒煙超過(guò)1年. 由于來(lái)自香煙的尼古丁能很快被人體吸收并進(jìn)入動(dòng)脈循壞，經(jīng)過(guò)口腔黏膜和肺部快速分布到人體組織約20 s通過(guò)大腦. Xue等[47]提出將尼古丁降解酶NicA2作為戒煙的候選藥物，該法主要通過(guò)破壞或減少尼古丁的循環(huán)，使大腦中尼古丁的濃度不能達(dá)到或維持在致癮濃度.

5 結(jié)語(yǔ)

環(huán)境污染是當(dāng)今世界面臨的主要問(wèn)題之一，煙草產(chǎn)生了大量的含尼古丁的廢棄物，引起環(huán)境污染和人體健康問(wèn)題.研究微生物參與降解尼古丁的代謝途徑和基因，可將生物降解作為一種新的轉(zhuǎn)化有毒復(fù)合物為有價(jià)值的復(fù)合物的工具，尼古丁降解微生物可用于降解煙草廢棄物，大量產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物可被用于制藥業(yè).

目前，用于煙草發(fā)酵和煙草廢棄物的尼古丁降解微生物仍處于小范圍或?qū)嶒?yàn)室水平，未來(lái)研究將集中在如何將其應(yīng)用于大規(guī)模提高煙葉和香煙產(chǎn)品的質(zhì)量、煙草廢棄物的降解、生產(chǎn)有價(jià)值的中間代謝產(chǎn)物. 雖然某些特定的尼古丁降解菌的中間代謝產(chǎn)物和尼古丁降解途徑已取得一定進(jìn)展，但減少人體和環(huán)境中的尼古丁的毒害及其代謝過(guò)程，如何進(jìn)行尼古丁降解微生物的基因修飾和代謝過(guò)程以提高尼古丁降解活性并減少有害代謝產(chǎn)物的積累，仍是未來(lái)重要的研究主題.

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ResearchDevelopmentofNicotineDegradingMechanisminMicroorganismsandTheirApplications

LiXiaohua,MeiFeng,KongWen,LiYang,MaTingting,PiTing

(Key Lab for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission,College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

To learn about the most promising way of biodegradation to eliminate environmental nicotine pollution,this article gave an overview about the development of nicotine degrading microorganisms, degradation pathways (demethylation pathway in fungi, pyridine and pyrrolidine pathway in gram-positive bacteria, and variant pathway of pyridine and pyrrolidine in gram-negative bacteria), degradation gene clusters and their application in environmental protection and pharmacology, which may serve as a reference to guide the further study and application of nicotine degrading microorganisms.

nicotine; microbial degradation; metabolic pathway; application

2016-10-25

李曉華(1968-)，男，博士，教授，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：xhli4451@sina.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31070087,30570046)；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2011CDA079,2008CDB076) ；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(YCZW15104,CZW16005)

Q939

A

1672-4321(2017)04-0027-09