王志剛，陳文晶，胡 影，徐偉慧，王春龍，呂智航，劉澤平

DNA在黑土膠體微界面的吸附與解吸特性

王志剛，陳文晶，胡 影，徐偉慧，王春龍，呂智航，劉澤平

（齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

為了揭示DNA在黑土微生物的遺傳進化和基因轉移機制方面的重要意義，采用平衡法研究了含有機質黑土膠體（Coarse organic colloid，COC）和去有機質黑土膠體（Coarse inorganic colloid，CIC）對DNA的吸附與解吸特性。結果表明：CIC在快速吸附期吸附DNA的速率和數量都小于COC，且更快達到吸附平衡；隨著pH值升高，黑土膠體表面吸附DNA數量逐漸減少；Langmuir吸附方程可較好地描述COC和CIC對DNA的等溫吸附，COC和CIC的決定系數（R2）分別為0.972和0.991，且COC的吸附平衡常數（K）大于CIC，說明COC對DNA的吸附親和能力大于CIC；CIC和COC表面DNA的解吸率分別為63.5%和47.4%。研究結果證明，有機質在黑土膠體吸附DNA的數量和親和力方面貢獻較大，pH是影響黑土膠體吸附DNA的重要因子。

黑土膠體；DNA；含有機質膠體；去有機質膠體；等溫吸附；解吸

土壤中包含大量的生命有機體，富含DNA和酶等生物活性物質。土壤環(huán)境中的胞外DNA主要來源于微生物、動植物細胞的主動分泌或細胞裂解釋放，以往認為環(huán)境中的DNA會立即被存在的DNase I所降解[1]，而根據大量研究表明，生物釋放到環(huán)境中的DNA能被其周圍的土壤膠體吸附固定[2-3]，使DNA對DNase I的反應特性以及敏感度發(fā)生改變，進而抵御DNase I的降解而長期保存于環(huán)境中，直至被合適的宿主細胞所吸收利用[4-5]，在特定條件下，在合適宿主細胞內發(fā)生遺傳轉化，DNA基因編碼就能得到表達。土壤胞外DNA可以通過重組、轉導、轉化和轉位等途徑在微生物之間轉移，甚至在植物與微生物之間發(fā)生轉移[6]，在微生物的遺傳進化和生物多樣性等方面起著重要作用[7]。這種環(huán)境中的“隱性基因”已經引起醫(yī)學、生物學、土壤學、生命起源學等相關領域的廣泛關注。

土壤膠體對DNA的固定，使土壤成為DNA活性保存的載體和基因轉移的重要媒介[8]。土壤膠體包括有機膠體和無機膠體，它是土壤肥力的重要物質基礎[9]。東北黑土為世界上僅有的四大黑土區(qū)之一，有機質含量高達5%～7%，是我國重要的自然資源。在黑土中棲息著大量的微生物[10]，這些生物的新陳代謝勢必要向土壤環(huán)境釋放大量的胞外DNA，而膠體與DNA的吸附與解吸特性直接影響著DNA在宿主細胞中的水平遺傳轉化過程[11]。因此，研究DNA在黑土膠體中的吸附與解吸過程，對揭示DNA在黑土微生物的遺傳進化和基因轉移機制等方面的作用具有重要意義。為此，本文研究了黑土有機與無機膠體對DNA的吸附與解吸特性，以期為揭示土壤胞外DNA分子存在狀態(tài)和歸宿以及生態(tài)安全評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試DNA

使用德國Sigma公司生產的鮭魚精DNA為供試材料。用雙蒸水溶解后使用，配制成500 μg·mL-1的儲備液，使用超微量分光光度計 2000 C（Thermo Fisher Scientific，美國）測定其A260/A280值為1.86，于 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 黑土膠體的制備

實驗所用黑土采自黑龍江省克山縣（126°4′57″E，48°21′43″N）農田，室溫條件下自然風干，剔除植物根系、碎石塊與草屑等異物，研磨并全部過200目篩。

土壤膠體的提取方法參照Li等[12]實驗方法并加以改進，具體步驟為：稱取50 g黑土樣品兩份，分別置于500 mL燒杯中，加100～150 mL純水攪拌均勻，其中一份加入適量的雙氧水（30%），不斷攪拌直至沒有明顯氣泡產生，除凈有機質后，用于制備去有機質膠體（Coarse inorganic colloid，CIC），另一份不需要雙氧水處理，用于制備含有機質膠體（Coarse organic colloid，COC），兩份懸液超聲分散1 h，期間不斷攪拌，然后把土壤懸液澆注于320目篩，以除去砂粒。過篩后的土壤懸液轉入2000 mL燒杯，用超純水定容至2000 mL，上下攪拌（避免產生旋渦）后靜置。根據Stokes定律計算沉淀粒徑＜2 μm膠體顆粒所需時間為2 h，反復多次提取膠體，直至懸液澄清透亮。在收集的膠體溶液中加入250 mL的0.5 mol·L-1CaCl2溶液絮凝膠體，傾去上清液。用20 mL去離子水與20 mL 95%的無水乙醇清洗絮凝物，采用AgNO3滴定法檢測Cl-，直至無Cl-。最后將黑土膠體冷凍干燥后，用瑪瑙研缽研磨過200目篩后，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 黑土膠體懸液的制備

準確稱取1.000 g黑土膠體于50 mL容量瓶中，加入滅菌的超純水，超聲波分散1 h并充分搖勻，用0.1 mol·L-1的NaOH與HCl溶液多次調節(jié)pH值使其穩(wěn)定在7.0，補充超純水使總體積為50 mL，得到COC和CIC膠體懸液，膠體濃度為20 mg·mL-1，避光保存?zhèn)溆谩５V物組成用X-射線衍射法（XRD）進行測定?？傆袡C質含量（Totalorganiccarbon，TOC）和陽離子交換量（Cation exchange capacity，CEC）分別用 KCr2O7-H2SO4外加熱法和中性乙酸銨法測定。比表面積（Specific surface area，SSA）采用BET氮氣吸附法進行測定，測定條件：80℃真空脫氣3 h。膠體電荷零點（Point of zero charge，PZC）用zeta電位儀測定。供試黑土膠體的形貌見圖1，理化性質見表1。如圖1所示，含有機質膠體與去有機質膠體均呈現(xiàn)層狀結構。

1.2 黑土膠體對DNA吸附過程

在 10 mL DNA LoBind低吸離心管（Eppendorf）中分別加入 1.6 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol·L-1，pH7.4）、0.4 mL DNA溶液、0.5 mL黑土膠體懸液，控制總體系為 2.5 mL；25 ℃條件下，旋轉振蕩 10、20、40、60、80、120、180 min；振蕩完畢后取出，14 500 r·min-1離心20 min，上清液用超微量分光光度計在260 nm波長比色測定；為避免膠體的不完全沉淀對實驗結果造成影響，上清液中的DNA含量等于“膠體+DNA”上清的DNA量減去膠體吸附后的上清DNA量，獲得DNA在土壤膠體上的吸附量。實驗設置清水、膠體和DNA溶液3個處理，每個實驗處理3組平行。

黑土膠體 TOC/% SSA/m2·g-1CEC/cmol·kg-1PZC 礦物組成COC 2.68±0.13 83.3±5.1 46.80±3.22 2.5±0.1蒙脫石，伊利石CIC 1.06±0.11 111.8±6.3 41.6±4.03 2.0±0.1蒙脫石，伊利石

圖1 掃描電鏡下的土壤膠體形貌圖（5 μm）Figure 1 Scanning electron microscope images of COC and CIC（5 μm）

1.3 等溫吸附曲線

10 mL DNA LoBind低吸離心管（Eppendorf）中分別加入 1.6 mL 0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）、0.5 mL黑土膠體懸液，以及0.4 mL DNA溶液，控制總體系為2.5 mL。體系中的DNA終濃度為10、20、40、60、80、100、120、140 μg·mL-1。后續(xù)步驟同 1.2所示。

1.4 pH值對DNA吸附的影響

在10 mL離心管中分別加入1.6 mL不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）的 TE 緩沖液、0.4 mL DNA 溶液、0.5 mL黑土膠體懸液，控制總體系為2.5 mL。后續(xù)步驟同1.2所示。

1.5 解吸實驗

解吸實驗是根據等溫吸附實驗結果，在DNA吸附平衡后，在體系中加入10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（0.05 mol·L-1，pH 7.4），振蕩 30 min，然后測緩沖液的OD260nm值，反復解吸3～5次，直到上清液中檢測不到DNA為止。DNA的解吸率由下方公式求得：

DNA解吸率=（DNA解吸量/DNA吸附量）×100%

2 結果與分析

2.1 黑土膠體對DNA的吸附過程

由圖2可知，DNA在COC和CIC表面均可以發(fā)生吸附過程，但是吸附過程規(guī)律卻完全不同。COC對DNA的吸附過程呈現(xiàn)明顯的三個階段：快速吸附期（0～10 min）、平緩吸附期（10～80 min）和吸附平衡期（＞80 min）；CIC對DNA的吸附過程分為兩個階段：快速吸附期（0～40 min）和吸附平衡期（＞40 min）。在快速吸附期，COC吸附曲線斜率明顯高于CIC，說明COC吸附速率高于CIC。在整個吸附過程中，CIC表面吸附DNA的量小于COC，且更快達到吸附平衡。

2.2 pH對DNA吸附的影響

圖2 DNA在黑土膠體上的吸附動力學特征Figure 2 Kinetic characteristics of DNA adsorption on black soil colloids

圖3 pH對DNA在黑土膠體表面吸附的影響Figure 3 Effect of pH on DNA adsorption on black soil colloids

pH是影響DNA在土壤膠體表面吸附的重要因素，由圖3可知，黑土膠體表面的DNA吸附量隨著體系pH值的上升而降低。pH＜5時，COC對DNA的吸附量從 16.62 μg·mg-1降低到 6.25 μg·mg-1，CIC 表面DNA 的吸附量從 15.52 μg·mg-1降低到 9.54 μg·mg-1；pH≥6時，隨著pH升高，COC和CIC對DNA的吸附量持續(xù)降低，但COC的吸附量高于CIC，在pH=9時，CIC 的吸附量僅為 1.5～2 μg·mg-1。

2.3 等溫吸附曲線

由圖4可知，在黑土膠體吸附體系中，當DNA濃度低于30 μg·mL-1時，吸附等溫線的斜率較大，吸附量隨DNA濃度的增加快速上升；而當DNA濃度大于30 μg·mL-1時，等溫吸附曲線變得較為平緩，表明吸附逐漸趨于飽和。在所有DNA濃度下，CIC的吸附量小于COC，且較COC的DNA飽和濃度低。通過Langmuir吸附方程對黑土膠體等溫吸附DNA曲線的擬合發(fā)現(xiàn)（表 2），COC 的決定系數（R2）為 0.972，最大吸附量（qm）為 6.95 μg·mg-1，CIC 的 R2為 0.991，qm為4.27 μg·mg-1。COC 的吸附平衡常數（K）大于 CIC，說明COC對DNA的吸附親和能力高于CIC。

圖4 黑土膠體對DNA的等溫吸附曲線Figure 4 Curves of isotherm adsorption of DNA on black soil colloids

表2 DNA在黑土膠體表面吸附擬合Langmuir方程相關參數Table 2 Parameters of Langmuir equation simulation for the adsorption of DNA on black soil colloids

2.4 土壤膠體上DNA的解吸

吸附在黑土膠體表面的DNA用0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖液進行解吸，解吸2～3次后，溶液中DNA解吸完全，由圖5可看出，CIC表面DNA的解吸率為63.5%，而COC表面DNA的解吸率為47.4%，CIC表面的DNA解吸率較高，也印證了Langmuir等溫吸附模型中，COC對DNA的親和力大于CIC的結論。

3 討論

土壤膠體具有巨大的比表面積與表面電荷特性，土壤膠體與進入其中的物質間有很高的親和性，其微界面過程是土壤研究的熱點。DNA分子質子化后可攜帶電荷，能與攜帶相反電荷的土壤膠體表面結合[13]。土壤膠體界面吸附的DNA可以抵御核酸酶降解和其他物質損傷[14]，增加DNA在環(huán)境中的存活周期，提升其發(fā)生遺傳轉化的幾率[15-16]，對環(huán)境生物水平遺傳轉化具有重要意義。

圖5 黑土膠體表面DNA的解吸Figure 5 Desorption of DNA on black soil colloids

通過X-射線衍射法研究發(fā)現(xiàn)，黑土膠體的主要礦物成分為高嶺石和蒙脫石，蒙脫石或高嶺石的斷裂邊緣具有活性羥基，可作為質子供體或受體而與其他物質形成氫鍵，DNA分子可通過氫鍵與土壤顆粒發(fā)生吸附作用[17]，Cai等[18]證明DNA可以通過靜電引力吸附在蒙脫石表面，而DNA分子與高嶺石之間還存在配體交換作用，CIC和COC的吸附曲線進一步證明了DNA可以與高嶺石和蒙脫石發(fā)生吸附作用，并且有機質的存在強化了這種吸附作用。CIC表面DNA快速吸附期的吸附速率和吸附量都小于COC，且更快達到吸附平衡。在Langmuir吸附方程中，COC的K值大于CIC值，說明COC對DNA的吸附親和能力大于CIC，這可能是由于有機質更容易與DNA形成相對穩(wěn)定的氫鍵所導致的[19]；解吸實驗中，CIC表面DNA的解吸率為63.5%，顯著高于COC表面DNA的解吸率47.4%，結果與Langmuir方程的研究結論一致，說明有機質在黑土膠體對DNA的吸附過程中起關鍵作用，而且有機質含有較多的官能團，可通過氫鍵等作用而增強對DNA的吸附。

在不同pH條件下，黑土膠體吸附DNA的規(guī)律與火山土膠體的特征相反[20]，可能是由于DNA的等電點約為5，當體系pH＜5時，DNA表面帶正電荷，DNA與黑土膠體之間的靜電引力作用增強，因此DNA的吸附量較大；而pH＞5時，DNA分子中的磷酸基團發(fā)生去質子化，DNA帶負電荷。同時，由于黑土膠體的電荷零點為2.0左右，當體系的pH值上升，DNA與膠體表面的負電荷均增加，靜電排斥作用增強，因此吸附量降低。這表明，DNA與膠體表面存在靜電作用[21]，但低pH可能會導致DNA沉淀，也可能是吸附量增加的原因[22]，但是其作用機制仍需要進一步研究。

4 結論

（1）DNA可在黑土膠體表面發(fā)生吸附作用，快速吸附期COC對DNA的吸附速率和吸附量都高于CIC。

（2）COC對DNA的吸附親和能力大于CIC，說明有機質在黑土膠體對DNA的吸附過程中起關鍵作用。

（3）黑土膠體對DNA的吸附量隨著pH值的升高而降低，pH是影響黑土膠體吸附DNA的重要因子。

致謝：Kui Chen教授在論文寫作過程中提供了寶貴意見，謹致謝忱。

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Characteristics of DNA adsorption and desorption on micro-interfaces of black soil colloids

WANG Zhi-gang,CHEN Wen-jing,HU Ying,XU Wei-hui,WANG Chun-long,Lü Zhi-hang,LIU Ze-ping
（Institute of Life Science and Agriculture and Forestry,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China）

The characteristics of DNA adsorption and desorption affect the presence of intact DNA and are of great significance for genetic transformation on micro-interfaces of soil colloids.The adsorption and desorption characteristics of DNA by coarse organic colloid（COC）and coarse inorganic colloid（CIC）were studied using the balanced reaction method.The results showed that the rate and quantity of DNA adsorption were lesser on CIC than on COC.The quantity of the adsorbed DNA on black soil colloids decreased gradually with increasing pH.Langmuir adsorption equation could describe the isothermal adsorption of DNA by COC and CIC well,with corresponding determination coefficients（R2） of 0.972 and 0.991,respectively.The equilibrium constant of Langmuir（K） of COC was higher than that of CIC,which proved that the adsorption affinity of COC was better than that of CIC.The rates of DNA desorption from COC and CIC were 63.5%and 47.4%,respectively.The present study indicates that DNA can be adsorbed onto the surface of black colloid,the organic matter contributed greatly to the capability of the DNA adsorption,and that pH is an important factor affecting the adsorption of DNA on black soil colloids.

black soil colloid;DNA;coarse organic colloid;coarse inorganic colloid;adsorption isotherms;desorption

X53

A

1672-2043（2017）10-2058-05

10.11654/jaes.2017-0619

王志剛，陳文晶，胡 影，等.DNA在黑土膠體微界面的吸附與解吸特性[J].農業(yè)環(huán)境科學學報,2017,36（10）：2058-2062.

WANG Zhi-gang,CHEN Wen-jing,HU Ying,et al.Characteristics of DNA adsorption and desorption on micro-interfaces of black soil colloids[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（10）：2058-2062.

2017-04-27 錄用日期：2017-06-23

王志剛（1980—），男，博士，副教授，主要從事土壤微生物方面的研究。E-mail：wzg1980830@sina.com

國家自然科學基金項目（31670375）；齊齊哈爾大學研究生創(chuàng)新項目（YJSCX2015-ZD02）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（31670375）；Graduate Student Innovation Program at Qiqihar University（YJSCX2015-ZD02）