石 慧，白翠華，周昌敏，羅東林，姚麗賢

施用豬糞土壤中抗生素的降解、植物有效性及土壤酶活性變化

石 慧，白翠華，周昌敏，羅東林，姚麗賢*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

在土壤中添加不同用量（0、1%、2%和4%）豬糞進(jìn)行土壤培養(yǎng)和荔枝盆栽試驗(yàn)，研究來自豬糞的抗生素（金霉素、強(qiáng)力霉素）在土壤360 d內(nèi)的降解動(dòng)態(tài)和土壤酶活性的變化，并探討不同時(shí)間（153 d和210 d）收獲的荔枝植株吸收兩種抗生素能力變化。結(jié)果表明：施用豬糞顯著提高土壤兩種抗生素含量（p＜0.05），金霉素和強(qiáng)力霉素在土壤中的半衰期分別為26.84 d和58.89 d；施入豬糞可提高土壤過氧化氫酶、脲酶和酸性磷酸酶活性。當(dāng)豬糞施用量為1%和2%時(shí)，土壤3種酶活性與金霉素和強(qiáng)力霉素含量為顯著正相關(guān)（p＜0.05）。隨荔枝生長時(shí)間延長，植株金霉素含量顯著提高，但與豬糞用量關(guān)系不大；植株強(qiáng)力霉素含量隨豬糞用量增加而顯著提高，但隨荔枝生長被生物量稀釋而下降。金霉素在植株體內(nèi)向上轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)（轉(zhuǎn)移系數(shù)0.595～0.789），強(qiáng)力霉素則很弱（轉(zhuǎn)移系數(shù)＜0.01）。收獲荔枝植株后，根際土壤兩種抗生素的累積也與豬糞用量正相關(guān)。荔枝為多年生果樹，如長期連續(xù)大量施用此類禽畜糞肥，可能造成抗生素在果園土壤的累積，荔枝果實(shí)存在吸收抗生素、尤其是金霉素的風(fēng)險(xiǎn)。

糞肥；抗生素；土壤；荔枝；植物有效性

禽畜糞肥被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥，一直被推薦長期大量施用[1-2]。但在集約化禽畜養(yǎng)殖中，為預(yù)防疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長，通常會(huì)在禽畜飼料中添加抗生素[3-4]。禽畜對(duì)抗生素的利用率通常較低，大部分隨糞便排出體外，導(dǎo)致抗生素在禽畜糞中的殘留[5-7]。禽畜糞中檢出的抗生素包括磺胺類[5-7]、四環(huán)素類[5-7]、喹諾酮類[6-7]、大環(huán)內(nèi)脂類[7]等，其中四環(huán)素類抗生素（如金霉素、土霉素等）的檢出率最高且含量也較高。施用養(yǎng)殖場(chǎng)禽畜糞可導(dǎo)致糞肥中的抗生素在農(nóng)田土壤的累積[7-8]，進(jìn)而被蔬菜[4，9]、玉米[10]等作物吸收累積，這些農(nóng)產(chǎn)品被人類食用后可能會(huì)引起健康風(fēng)險(xiǎn)。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道外源添加抗生素對(duì)土壤酶活性的影響[11-13]，但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道隨糞肥進(jìn)入土壤的抗生素對(duì)土壤酶活性的影響[14]。實(shí)際生產(chǎn)中，抗生素主要是隨糞肥進(jìn)入土壤[4，7-8]。土壤酶作為土壤肥力的重要指標(biāo)，對(duì)植物生長也有重要影響[15]。因此，極有必要研究以探明施用含有抗生素殘留的糞肥對(duì)土壤酶活性的影響。

我國是最大的荔枝（Litchi chinensis Sonn.）生產(chǎn)國，華南是我國最重要的荔枝產(chǎn)區(qū)[16]。荔枝為多年生木本果樹，在生產(chǎn)上有長期大量施用禽畜糞的習(xí)慣[17]。然而，目前在果園土壤施用禽畜糞后，抗生素在果園土壤的累積及果樹對(duì)抗生素的吸收累積能力缺乏研究。本研究在荔枝園土壤添加不同用量養(yǎng)殖場(chǎng)豬糞進(jìn)行土壤培養(yǎng)試驗(yàn)和荔枝盆栽試驗(yàn)，研究抗生素在土壤中的降解動(dòng)態(tài)和土壤酶活性的變化，進(jìn)一步探究荔枝植株對(duì)抗生素的吸收利用能力，為禽畜糞肥在荔枝種植中的合理安全施用提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)土壤采自廣東省廣州市增城縣荔城街東林果園（113°45′56.32″E，23°14′33.85″N）。所用土壤為赤紅壤，砂質(zhì)黏壤土，具體理化性質(zhì)和抗生素含量見表1。土壤經(jīng)風(fēng)干、粉碎、過2 mm篩后用于培養(yǎng)試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)。

供試豬糞采于廣東省肇慶市四會(huì)縣某豬場(chǎng)。豬糞經(jīng)風(fēng)干、粉碎過2 mm篩后備用。采集基礎(chǔ)樣本測(cè)定基本理化性質(zhì)、金屬和抗生素含量，結(jié)果見表2。

供試?yán)笾ζ贩N為淮枝。淮枝新鮮果實(shí)購于廣州市從化區(qū)溫泉鎮(zhèn)宣星村農(nóng)戶果園。荔枝果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室獲得種子后，在網(wǎng)室內(nèi)用干凈河沙育苗，僅澆自來水。在種子發(fā)芽生長2個(gè)月后，選取株高大小基本一致、具有6片真葉的荔枝苗移植進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方案

1.2.1 土壤培養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)于2015年10月至2016年10月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室進(jìn)行。據(jù)調(diào)查，華南荔枝主產(chǎn)區(qū)荔枝有機(jī)肥施用量在 1～200 kg·株-1范圍內(nèi)[17]，按我國荔枝平均種植密度330～390株·hm-2[18]計(jì)算，相當(dāng)于施用量為330～78 000 kg·hm-2。因此，設(shè)置豬糞添加量為 0、10、20、40 g·kg-1，分別記為對(duì)照 CK、1%、2%、4%，每個(gè)處理重復(fù)4次。將不同用量豬糞分別與土壤（10 kg）混拌均勻后裝入10 L白色PVC塑料桶（25.1 cm×27.9 cm），加入自來水保持土壤水分為田間持水量的75%左右進(jìn)行培養(yǎng)。在第 0、10、20、30、40、50、60、80、100、120、150、180、210、240、270、300、330、360 d 采集土壤樣本，每次用不銹鋼土鉆采集約250 g土，每桶分別采集3鉆土樣，混勻?yàn)橐粋€(gè)土壤樣本。土樣混勻后分為兩部分：一部分風(fēng)干，用于測(cè)定土壤酶活性；另一部分土壤立即凍干，磨碎后放在-20℃冰箱保存，用于測(cè)定抗生素（金霉素、強(qiáng)力霉素）含量。

表1 供試土壤理化性質(zhì)Table 1 Basic physicochemical properties of the soil used

表2 供試豬糞理化性質(zhì)Table 2 Basic physicochemical properties of pig manure

1.2.2 盆栽試驗(yàn)

試驗(yàn)于2015年10月至2016年5月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室進(jìn)行。盆栽試驗(yàn)處理及豬糞用量與培養(yǎng)試驗(yàn)相同，但每個(gè)處理重復(fù)9次。將不同用量豬糞分別與供試土壤（4 kg）混拌均勻，裝入5 L白色PVC塑料桶（19.7 cm×19.3 cm），加入自來水調(diào)節(jié)土壤水分約為田間持水量的75%，老化20 d后移栽荔枝幼苗，每桶移栽一株。試驗(yàn)期間保持土壤水分約為田間持水量的75%。在荔枝移栽后的153 d和210 d，分別收獲荔枝植株，同時(shí)采集粘附在荔枝根系的根際土壤。荔枝植株收獲后，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，用大量自來水徹底沖洗植株根、莖、葉，用蒸餾水二次充分沖洗，用濾紙吸干植株表面水分，稱植株鮮重后立即凍干、磨碎，放在-20℃冰箱保存用于測(cè)定抗生素的含量；土壤樣本也立即凍干，磨碎后測(cè)定抗生素含量。

1.3 儀器與試劑

所用儀器有Waters xevo高效液相色譜儀-TQD（三重四極桿）-MS質(zhì)譜檢測(cè)器（美國Waters公司）（UPLC-MS/MS）、Alpha1-4/LD plus冷凍干燥機(jī)（德國Christ公司）、Eppendorf Centrifuge 580R高速冷凍離心機(jī)、Unique-R20超純水機(jī)、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀）、SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）、XHDZF-6020真空干燥箱（上海霄漢實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）、HSE-08A多功能數(shù)控固相萃取系統(tǒng)（天津市恒奧科技發(fā)展公司）、JP200-24 24孔干式氮吹儀（上海旌派儀器有限公司）、Sartorius BSA224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、Waters Oasis SAX強(qiáng)陰離子交換柱（6 mL·500 mg-1）、Waters Oasis HLB 固相萃取柱（6 mL·500 mg-1）。

甲醇、乙腈均為色譜純（Aladdin公司），其他試劑均為優(yōu)級(jí)純（廣州化學(xué)試劑廠）。金霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥80%）和強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）均購于Aladdin公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取金霉素和強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇，配制成100 mg·L-1的抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取各種儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)母液。取混合標(biāo)準(zhǔn)母液以甲醇逐步稀釋，配制成校正曲線工作液，含量范圍為 0.1～1000 μg·L-1，避光保存。

EDTA-McIlvaine緩沖液：稱取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉27.5 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，溶于水中并定容到 1 L（pH=4.0）。

1.4 測(cè)定方法和條件

土壤脲酶采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定，其活性以24 h后100 g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示；過氧化氫酶用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，其活性以每克土消耗的0.1 mol·L-1的高錳酸鉀的毫升數(shù)表示；酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法，結(jié)果以24 h后100 g土壤中酚的毫克數(shù)表示[15]。

土壤和荔枝植株金霉素、強(qiáng)力霉素含量用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定。具體操作過程為：稱取過100目篩的樣品1.00 g，置于50 mL離心管中，加入 10 mL 正己烷、Na2EDTA-McI1vaine（1∶1，V∶V）緩沖液（pH 4.0）的混合液，恒溫振蕩 10 min，超聲萃取 15 min，10 ℃下 5000 r·min-1離心 20 min后收集提取液。重復(fù)提取3次，將上清液合并轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，棄去正己烷層，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10 min至液體不再沸騰。提前依次用10 mL甲醇和10 mL超純水將SAX和HLB固相萃取柱淋洗活化，再將提取液上柱萃取。萃取后用6 mL超純水沖洗SAX和HLB柱，將SAX柱棄去，將HLB柱40℃抽真空2 h以去除柱中殘留水分，用甲醇（含0.1%甲酸）洗脫柱子，將洗脫液用氮吹至近干，用乙腈水溶液（1∶1，V∶V）定容至 1 mL，過0.22 μm濾膜后裝瓶待測(cè)。

UPLC測(cè)定條件：色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。柱溫 35℃，流速 5 μL·min-1，進(jìn)樣量 4 μL；流動(dòng)相為（0.1%甲酸）乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序?yàn)椋?～2 min，10%～40%A；2～3 min，40%～60%A；3～3.2 min，60%～10%A；3.2～4.5 min，10%A。

MS檢測(cè)條件：電噴霧離子源（ESI），離子源溫度150℃，脫溶劑溫度450℃，脫溶劑氣和錐孔氣為氮?dú)猓撊軇饬魉?700 L·h-1，錐孔氣流速 50 L·h-1，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）監(jiān)測(cè)。金霉素和強(qiáng)力霉素MRM參數(shù)見表3。ESI-MS/MS選擇性反應(yīng)正離子檢測(cè)，進(jìn)樣量4 μL。金霉素和強(qiáng)力霉素的檢測(cè)限分別為0.40、0.03 μg·kg-1。

表3 金霉素和強(qiáng)力霉素的MRM參數(shù)Table 3 MRM parameters of chlortetracycline and doxycycline

圖1 不同用量豬糞處理土壤金霉素和強(qiáng)力霉素含量動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Changing trend of chlortetracycline and doxycycline in soils applied with various rates of pig manure

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析和作圖。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。用SAS軟件（2002 by SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用 Duncan 法進(jìn)行差異顯著性比較。IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。培養(yǎng)試驗(yàn)中四環(huán)素類抗生素在土壤中的降解動(dòng)態(tài)用對(duì)數(shù)函數(shù)模擬，公式為：

式中：a、b 為常數(shù)；Y 為土壤中抗生素的含量，mg·kg-1；X為培養(yǎng)時(shí)間，d。

抗生素轉(zhuǎn)移系數(shù)的計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤金霉素和強(qiáng)力霉素的降解動(dòng)態(tài)

施用豬糞土壤的金霉素和強(qiáng)力霉素降解動(dòng)態(tài)如圖1所示。對(duì)照土壤在培養(yǎng)期間均未測(cè)出兩種抗生素。與對(duì)照處理相比，施用豬糞可導(dǎo)致金霉素和強(qiáng)力霉素在土壤中的累積。豬糞施用量為1%時(shí)，土壤中金霉素含量在0～20 d快速下降，降解率達(dá)58.5%±3.2%；20 d后，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，金霉素含量變化不明顯。添加2%和4%豬糞處理土壤金霉素含量在0～60 d快速下降，至60 d時(shí)，降解率分別為57.8%±1.1%和68.4%±6.3%。約從60 d開始，這兩個(gè)處理的金霉素含量緩慢下降并逐漸接近。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，3個(gè)處理土壤金霉素降解率在88.3%±0.6%～95.6%±0.9%之間，殘留的金霉素含量在（0.1±0.0）～（0.3±0.0）mg·kg-1之間。不同用量豬糞處理土壤強(qiáng)力霉素含量在培養(yǎng)期間變化規(guī)律與金霉素類似。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，土壤中強(qiáng)力霉素的降解率為（76.6%±5.6%）～（88.9%±1.8%），殘留量在（0.2±0.1）～（0.5±0.1）mg·kg-1之間。

兩種抗生素均為施加高量處理的前期降解速率高于低量處理。究其原因，可能是由于豬糞中有機(jī)質(zhì)含量遠(yuǎn)高于抗生素含量，施用高量豬糞處理顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)，增加了微生物可利用的碳源[19]，從而提高了微生物活性，導(dǎo)致抗生素前期降解速率較高[14]。隨時(shí)間延長，由于抗生素自身對(duì)土壤微生物有抑制作用[12]，且Cu等金屬元素對(duì)抗生素抑制土壤微生物作用具有協(xié)同作用[20]，從而降低了抗生素后期的降解速率。兩種抗生素在土壤的降解半衰期可用對(duì)數(shù)函數(shù)擬合計(jì)算獲得（表4）。3個(gè)處理金霉素的平均半衰期為26.86 d。土壤強(qiáng)力霉素的平均半衰期為58.89 d。由于高量處理的抗生素降解速率快于低量處理，兩種抗生素的半衰期均為4%處理明顯短于低量處理。

表4 不同用量豬糞處理土壤金霉素和強(qiáng)力霉素的半衰期（d）Table 4 Half-lives of chlortetracycline and doxycycline in soils applied with various rates of pig manure（d）

2.2 土壤酶活性變化

土壤過氧化氫酶在生物氧化過程中起分解過氧化氫的作用，其活性用于表征土壤生物氧化過程的強(qiáng)弱，并且與土壤肥力有著重要的關(guān)系[21-22]。施入豬糞后土壤酶活性隨時(shí)間變化的趨勢(shì)如圖2所示。CK土壤在360 d內(nèi)過氧化氫酶活性變化較小，其值在（0.01±0.00）～（0.04±0.00）mL 0.1 mol·L-1KMnO4·g-1·min-1之間波動(dòng)，這可能是由于土壤中的絕大部分微生物處于休眠狀態(tài)導(dǎo)致的[23]。在0～80 d，土壤過氧化氫酶活性隨豬糞用量增加而提高，從80 d開始至培養(yǎng)結(jié)束，施入1%和2%豬糞處理的土壤過氧化氫酶活性較為接近，但施加4%豬糞處理的過氧化氫酶活性在培養(yǎng)期間均顯著高于兩個(gè)低量處理。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，4%處理土壤的過氧化氫酶活性分別是CK、1%和2%處理的8.2、8.6倍和 3.9倍。

圖2 不同用量豬糞處理土壤酶活性的變化Figure 2 Changing trend of enzyme activities in soils applied with various rates of pig manure

土壤脲酶是唯一對(duì)尿素的轉(zhuǎn)化具有重要影響的酶[22]，能夠催化尿素分解生成氨、二氧化碳和水，對(duì)提高氮素利用率及促進(jìn)土壤氮素循環(huán)具有重要作用[24]。CK處理土壤脲酶活性在培養(yǎng)期間變化較小，在（5.17±1.45）～（14.55±1.04）mg NH3-N·100 g-1·24 h-1范圍內(nèi)波動(dòng)。施肥處理可顯著提高土壤脲酶活性（p＜0.05），脲酶活性為CK的3.2～11.8倍。施加1%和2%豬糞處理的脲酶在培養(yǎng)期間活性均接近，而且變化幅度均較小。4%豬糞處理在培養(yǎng)期間呈現(xiàn)下降-上升-下降的規(guī)律，但至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)仍顯著高于其他處理，分別為CK、1%和2%處理的14.4、6.6倍和2.6倍。

磷酸酶能促進(jìn)有機(jī)磷化合物的分解，提高土壤磷素的有效性，為植物提供有效磷素，可以表征土壤磷狀況[15，25]。培養(yǎng)期間，CK處理土壤酸性磷酸酶活性在（88.47±5.55）～（129.08±12.62）mg Phenol·100 g-1·24 h-1之間波動(dòng)。所有處理土壤酸性磷酸酶活性培養(yǎng)期間變化規(guī)律相似，均呈現(xiàn)下降-上升的變化規(guī)律，且CK處理在培養(yǎng)期間酸性磷酸酶的活性始終小于施加豬糞處理。因此，施加豬糞可以提高土壤中酸性磷酸酶的活性，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，除1%處理，其他兩個(gè)施肥處理的酸性磷酸酶活性均顯著高于CK處理（p＜0.05）。

2.3 施用豬糞對(duì)荔枝生長影響

從表5荔枝植株生物量可以看出，在第153 d收獲時(shí)，施加豬糞并未明顯提高荔枝植株的生物量，當(dāng)豬糞用量提高到4%時(shí)生物量顯著降低。有報(bào)道指出，禽畜糞中的抗生素、重金屬等物質(zhì)通過抑制植株根系的生長，進(jìn)而抑制植株對(duì)養(yǎng)分的吸收，從而降低了植株的生物量[26-28]。試驗(yàn)所用豬糞2種抗生素和Cu、Zn含量均較高（表2），參照《德國腐熟堆肥限量標(biāo)準(zhǔn)》（Cu≤100 mg·kg-1，Zn≤400 mg·kg-1），本試驗(yàn)所用豬糞Cu、Zn含量約為該標(biāo)準(zhǔn)的8倍，至153 d時(shí)土壤仍有一定含量的金霉素和強(qiáng)力霉素（圖1），且高用量處理殘留量高于低用量處理。因此，豬糞施用量較高的處理可能是在一定程度上通過抑制根系的生長進(jìn)而抑制荔枝植株的生長。同時(shí)，從荔枝苗移栽到第153 d收獲，正值廣州冬春季節(jié)，溫度低，不利于植物根系的生長。因此，即使豬糞中含有充足的氮磷鉀等養(yǎng)分元素，前期也難以被植株充分吸收，從而未能表現(xiàn)出促進(jìn)植株生長的作用。第210 d時(shí)，3個(gè)添加豬糞處理荔枝植株生物量十分接近，均顯著高于對(duì)照。由此可見，隨施入時(shí)間延長，土壤抗生素的含量逐漸降低（圖1），對(duì)荔枝植株的抑制作用變小，同時(shí)豬糞的氮磷鉀等養(yǎng)分元素可為植株提供充足的養(yǎng)分[29]，因此豬糞在后期逐步表現(xiàn)出促進(jìn)荔枝生長的作用。

表5 不同用量豬糞處理荔枝在不同收獲時(shí)間的生物量（鮮重，g·pot-1）Table 5 Biomass of litchi plants in various treatments and time（fresh weight，g·pot-1）

2.4 荔枝吸收抗生素能力

CK處理荔枝植株不同收獲期地上部和根系均未檢出抗生素（表6）。在153 d時(shí)，施用豬糞處理荔枝植株地上部和根系金霉素含量分別為（24.9±0.0）～（25.3±0.4）μg·kg-1和（42.1±0.2）～（42.3±0.1）μg·kg-1，處理間含量均極為接近。在210 d收獲時(shí)，地上部金霉素含量在 （99.4±4.7）～（122.3±11.4）μg·kg-1之間，4%處理顯著高于1%和2%處理；但荔枝根系金霉素含量則差異不大，在（139.7±15.3）～（148.8±17.6）μg·kg-1范圍內(nèi)。210 d植株地上部和根系金霉素含量均為153 d的數(shù)倍，表明隨豬糞施入時(shí)間延長及荔枝的生長，荔枝吸收累積金霉素能力顯著提高。

除153 d收獲的1%處理荔枝植株地上部未檢出強(qiáng)力霉素外，兩個(gè)收獲時(shí)間其他施肥處理植株均檢出強(qiáng)力霉素。在153 d時(shí)，4%處理地上部強(qiáng)力霉素含量（1.2±0.0）μg·kg-1，顯著高于 2%處理的含量（0.9±0.1）μg·kg-1。隨豬糞用量提高，荔枝植株根系強(qiáng)力霉素含量顯著提高。2%和4%處理的根系強(qiáng)力霉素含量為1%處理的十?dāng)?shù)倍。至210 d收獲時(shí)，荔枝植株地上部和根系強(qiáng)力霉素含量反而比153 d時(shí)有所降低，但仍然表現(xiàn)出隨豬糞用量增加而顯著提高的規(guī)律。這說明荔枝吸收強(qiáng)力霉素能力隨土壤強(qiáng)力霉素含量提高而加強(qiáng)，但其含量容易被生物量稀釋而有所降低。

對(duì)兩種抗生素在植株體內(nèi)向上轉(zhuǎn)移的能力進(jìn)行比較可知（表7），金霉素和強(qiáng)力霉素的轉(zhuǎn)移系數(shù)分別為0.595～0.789和0.010，表明金霉素在植株體內(nèi)向上轉(zhuǎn)移的能力較強(qiáng)，且極顯著強(qiáng)于強(qiáng)力霉素。長期施用含金霉素和強(qiáng)力霉素的糞肥，造成荔枝樹體累積金霉素的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)更大。

2.5 荔枝收獲后根際土壤抗生素含量

盆栽荔枝收獲后，施用豬糞處理土壤仍然出現(xiàn)了兩種抗生素的殘留（表8）。在153 d時(shí)，添加1%處理土壤殘留的金霉素和強(qiáng)力霉素含量分別為（0.30±0.03）mg·kg-1和（0.59±0.01） mg·kg-1，2%和 4%處理土壤中殘留的金霉素和強(qiáng)力霉素含量顯著高于1%處理，但兩者差異不顯著；至210 d，施用豬糞處理土壤累積的兩種抗生素比153 d時(shí)有不同程度下降，這是由于荔枝植株吸收了更多的抗生素及抗生素降解造成的（圖1）。除4%處理土壤強(qiáng)力霉素外，土壤累積的抗生素仍隨豬糞用量的增加而顯著提高（p＜0.05）。

表7 不同收獲期施用不同用量豬糞金霉素和強(qiáng)力霉素在荔枝植株中的轉(zhuǎn)移系數(shù)Table 7 Transfer factors of chlortetracycline and doxycycline in litchi plants grown in soils applied with different rates of pig manure and harvested at different times

表6 不同用量豬糞處理荔枝植株在不同收獲時(shí)間的金霉素和強(qiáng)力霉素的含量（凍干重，μg·kg-1）Table 6 Concentrations of chlortetracycline and doxycycline in litchi plants grown in soils applied with different rates of pig manure and harvested at different times（lyophilized weight，μg·kg-1）

表8 不同收獲時(shí)間不同處理荔枝根際土壤金霉素和強(qiáng)力霉素的含量（mg·kg-1）Table 8 Concentrations of chlortetracycline and doxycycline in rhizosphere soils applied with different rates of pig manure and harvested at different times（mg·kg-1）

3 討論

3.1 抗生素對(duì)土壤酶活性的影響

培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然豬糞中含有一定量的抗生素，但施入豬糞仍可顯著提高土壤3種酶活性，而且這種促進(jìn)作用隨豬糞用量的增加而提高。同時(shí)，由表9可知，豬糞施用量為1%和2%的處理，3種酶活性與土壤金霉素和強(qiáng)力霉素含量顯著正相關(guān)。有研究表明，外源添加1～300 mg·kg-1的金霉素和四環(huán)素溶液到土壤，可顯著抑制土壤磷酸酶活性（p＜0.05），且抑制率隨抗生素濃度的增加而增加[30]。另外，Liu等[12]發(fā)現(xiàn)，外源添加金霉素在第1 d可顯著提高土壤中脲酶的活性，隨后顯著抑制了脲酶的活性，至12 d時(shí)抑制率最高可達(dá)64.4%。Bansal[13]也報(bào)道土壤酶的抑制率與外源添加四環(huán)素的含量呈正比。這些結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果并不相同，差別在于本試驗(yàn)中抗生素來源于豬糞，而Bansal[13]和Liu等[12]直接將抗生素溶液與土壤混合進(jìn)行研究。如表2所示，豬糞有機(jī)質(zhì)含量高，而且含有一定量的氮磷鉀等養(yǎng)分，添加豬糞后增加了微生物可利用的碳源[19]，因而提高了微生物數(shù)量，從而提高了土壤酶的活性[14，31]。因此，即使豬糞中含有抗生素，施入豬糞也并未對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生抑制作用。Chen等[14]比較了抗生素（土霉素）直接添加入土壤、抗生素與豬糞同時(shí)加入土壤及含抗生素的豬糞施入土壤對(duì)土壤酶活性的影響，結(jié)果表明，單施土霉素的土壤在100 d內(nèi)脲酶、堿性磷酸酶活性和過氧化氫酶活性均變化不大，而施用含土霉素的豬糞以及豬糞和土霉素混合施用的處理土壤中脲酶、堿性磷酸酶活性和過氧化氫酶活性均高于單施抗生素處理，而且3種方式進(jìn)入土壤的抗生素半衰期也存在較大差異。實(shí)際生產(chǎn)中，抗生素通常是隨糞便進(jìn)入土壤[32]，因此研究獸用抗生素的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)，使用含抗生素的糞肥開展研究，更加符合實(shí)際生產(chǎn)情況。

表9 不同用量豬糞處理土壤酶活性與抗生素含量的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 9 Pearson correlation coefficients between soil enzyme activities and antibiotics in soils applied with various rates of pig manure

3.2 豬糞中抗生素進(jìn)入人類食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)

土壤培養(yǎng)和荔枝盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，來自豬糞的四環(huán)素類抗生素雖然可在土壤中降解，但在土壤培養(yǎng)結(jié)束時(shí)及荔枝植株收獲后，仍然有一定量的殘留。研究表明，禽畜糞的排放及施用是土壤抗生素抗性基因面源污染的主要來源[33]。糞肥中抗生素進(jìn)入農(nóng)田后，會(huì)對(duì)土壤微生物耐藥性產(chǎn)生壓力，從而誘導(dǎo)出抗生素抗性基因，對(duì)土壤環(huán)境產(chǎn)生威脅[34]。至于土壤抗性基因是否可以通過糞肥-土壤-作物的方式傳遞到人類食物鏈，則是一個(gè)值得深入研究的大課題。

根據(jù)土壤培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，如果糞肥施用量較低（如1%和2%處理），四環(huán)素類抗生素在土壤的半衰期更長，被作物吸收的時(shí)間將會(huì)越長，如荔枝植株吸收金霉素能力隨時(shí)間延長而顯著提高。如果提高糞肥用量，雖然可以加快抗生素在土壤的降解，但在短期內(nèi)明顯提高了抗生素的供應(yīng)量，也可能導(dǎo)致作物吸收更多的抗生素，如荔枝植株根系153 d時(shí)強(qiáng)力霉素含量明顯高于210 d時(shí)。另外，不同作物對(duì)抗生素吸收能力存在較大差異，如將含有金霉素和泰樂霉素的豬糞施入土壤，洋蔥、玉米和卷心菜均可吸收來自豬糞的金霉素，但難以吸收泰樂霉素[10]。因此，作物對(duì)糞肥中抗生素的吸收和累積情況不僅與糞肥中抗生素的含量有關(guān)，還與作物和抗生素的種類有關(guān)。

本研究土壤培養(yǎng)試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)時(shí)間短，尚不能完全真實(shí)反應(yīng)糞肥施入果園土壤后抗生素在土壤的累積及被果樹實(shí)際吸收的能力。但是，本研究結(jié)果表明，糞肥施入土壤一年后，隨糞肥進(jìn)入土壤的抗生素仍然在土壤累積，荔枝植株可以吸收和向上運(yùn)輸金霉素和強(qiáng)力霉素，且金霉素相對(duì)于強(qiáng)力霉素向上轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)。四環(huán)素類抗生素作為人畜共用的抗生素，長期攝入可能導(dǎo)致人體耐藥性的產(chǎn)生[35]。因此，今后需要進(jìn)行田間長期定位試驗(yàn)，研究糞肥中抗生素在荔枝果實(shí)可能累積的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

（1）培養(yǎng)一年后豬糞中金霉素和強(qiáng)力霉素在土壤中的降解率分別在（88.3%±0.6%）～（95.6%±0.9%）和（76.6%±5.6%）～（88.9%±1.8%）之間，兩種抗生素在土壤中的殘留量均為高用量處理＞低用量處理，因而長期大量施用豬糞可能存在抗生素在土壤中累積的風(fēng)險(xiǎn)。

（2）雖然豬糞中含有一定量的抗生素，但施入豬糞可提高土壤過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶的活性，且當(dāng)豬糞施用量為1%和2%時(shí)，土壤3種酶活性與金霉素和強(qiáng)力霉素含量顯著正相關(guān)（p＜0.05）。

（3）荔枝植株可吸收來自豬糞的金霉素和強(qiáng)力霉素，且金霉素相對(duì)于強(qiáng)力霉素向上轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)。

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Degradation and phytoavailability of antibiotics in soils amended with pig manure and changes of soil enzyme activity

SHI Hui,BAI Cui-hua,ZHOU Chang-min,LUO Dong-lin,YAO Li-xian*
（College of Natural Resources and Environment,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

A soil incubation and a pot culture experiment using litchi plants（Litchi chinensis Sonn.）were conducted using soils amended with various rates（0,1%,2%,and 4%,W/W）of pig manure from an intensive animal farm,to investigate degradation of antibiotics（chlortetracycline and doxycycline）and changes of soil enzyme activity within 360 d,and examine uptake of antibiotics from pig manure by litchi plants at different harvest times（153 d and 210 d）.The concentrations of both antibiotics in soils were significantly increased by application of pig manure（p＜0.05）.The half-lives of chlortetracycline and doxycycline were 26.84 d and 58.89 d,respectively.Application of pig manure enhanced the activities of soil catalase,urease,and acid phosphatase.Moreover,the activities of the three enzymes were positively correlated to the concentrations of soil chlortetracycline and doxycycline when pig manure was applied at a rate of 1%or 2%（p＜0.05）.Litchi plants absorbed both antibiotics.With prolonged growth time,chlortetracycline concentration in plant significantly increased,but was not related to the level of pig manure used.The doxycycline concentration in the plants significantly increased as the manure level increased,but was diluted by the litchi biomass.Chlortetracycline was easily translocated upward,with the transfer factor of 0.595～0.789;how-ever,translocation of doxycycline was limited,with a transfer factor less than 0.01.After the harvest of litchi plants,the concentration of both antibiotics in rhizosphere soil was significantly increased by an increased rate of manure application.Because litchi is a perennial woody fruit tree,successive and extensive use of animal manure would result in accumulation of antibiotics from the manure in the soil,potentially leading to absorption of antibiotics,particularly chlortetracycline,by the edible litchi fruit.

animal manure;antibiotics;soil;litchi;phytoavailability

X713

A

1672-2043（2017）10-2039-09

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2017-03-14 錄用日期：2017-05-16

石 慧（1993—），女，吉林長春人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橥寥鲤B(yǎng)分管理。E-mail：1625264770@qq.com

*通信作者：姚麗賢 E-mail：lyaolx@scau.edu.cn

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS 33-08）；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A020208095）

Project supported：The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System（CARS 33-08）；Science and Technology Planning Project of Guangdong Province（2014A020208095）