，，，，

(1.永州市中心醫(yī)院兒科，湖南 永州 425000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

黃芪甲甙下調(diào)CaSR對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的缺血缺氧心肌損傷的保護(hù)作用

鄧純1，楊云華2*，左袁博教2，張雅林1，蔣德林1

(1.永州市中心醫(yī)院兒科，湖南 永州 425000；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科)

目的探討黃芪甲甙介導(dǎo)鈣敏感受體(CaSR)對缺血缺氧心肌的保護(hù)作用及機制。方法將32只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組(IS0)、黃芪甲甙低劑量組(ISO+AST IV 10 mg/kg)、黃芪甲甙高劑量組(ISO+AST IV 20 mg/kg)；HE染色光鏡下觀察不同組別心肌組織的病理學(xué)改變，檢測不同組別血清肌酸激酶及肌酸激酶同工酶含量；Western blotting法檢測CaSR蛋白的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比黃芪甲甙低、高劑量組能不同程度減輕心肌病理改變，降低血清肌酸激酶以及肌酸激酶同工酶含量，下調(diào)CaSR蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論黃芪甲甙對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠缺血缺氧心肌有保護(hù)作用；其機制可能為下調(diào)CaSR蛋白表達(dá)減輕CaSR對心肌損傷的作用。

黃芪甲甙； CaSR； 異丙腎上腺素

心肌缺血缺氧損傷是指血管痙攣、堵塞等其他各種原因引起冠狀動脈血流量減少，致使心肌血液供應(yīng)、氧氣供給以及其他營養(yǎng)物質(zhì)供給減少、有毒物質(zhì)產(chǎn)生增多及代謝產(chǎn)物清除減少從而導(dǎo)致心肌受損的病理狀態(tài)。鈣敏感受體(Caclium sensing receptor,CaSR)為隸屬于G蛋白藕聯(lián)受體超家族中C家族的一種跨膜受體。研究表明，在心肌缺血缺氧時CaSR蛋白表達(dá)較正常心肌組織表達(dá)增多[1]。CaSR能引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧自由基生成增多、NO合成減少、激活凋亡信號通路等途徑而引起心肌損傷。黃芪甲甙(Astragaloside IV,AST IV)為臨床治療心肌炎與心力衰竭中藥黃芪中一種有代表性的單體有效活性成分[2-4]，而黃芪甲甙在心血管系統(tǒng)疾病的保護(hù)作用中的研究提示其有明顯抗凋亡、抗病毒、抗炎、抗氧化等作用；黃芪甲甙對細(xì)胞內(nèi)鈣離子也有調(diào)控作用，能減輕鈣超載從而對損傷細(xì)胞起到保護(hù)作用。兩者之間是否有直接聯(lián)系，黃芪甲甙是否可以通過下調(diào)CaSR蛋白減輕鈣超載及細(xì)胞凋亡，目前國內(nèi)外尚未見報道。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 健康、清潔SD雄性大鼠35只，體重(255.8±5.2)g，由南華大學(xué)動物部提供。4只/籠，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.1.2 實驗藥品 黃芪甲甙(純度大于98%)購于上海拓旸生物科技公司。異丙腎上腺素，購自美國Sigma公司。

1.1.3 試劑 β-actin兔抗人一抗、CaSR兔抗人一抗(博奧森生物公司)、山羊抗兔二抗(廣州索萊寶公司)SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(強)、PMSF、上樣緩沖液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司)。

1.1.4 儀器設(shè)備 電子分析天平(北京賽多利斯天平公司)、低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、酶標(biāo)儀(美國ELX800)、顯影機(美國Fluorchem E)、高壓蒸汽滅菌鍋(日本TOMY公司)、-80 ℃低溫冰箱(日本SANYO)。

1.2方法

1.2.1 異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠缺血缺氧心肌損傷模型 大鼠連續(xù)2天背部多點皮下注射異丙腎上腺素，劑量為60 mg/kg,自由進(jìn)食、給水，對照組小鼠背部皮下注射相同體積的生理鹽水。

1.2.2 給藥和分組 大鼠4只/籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水，將大鼠采用隨機數(shù)字法隨機分為4組，即正常對照組、模型組、黃芪甲甙低劑量組(以1%羧甲基纖維素鈉溶解10 mg/kg)、黃芪甲甙高劑量組(以1%羧甲基纖維素鈉溶解20 mg/kg)，每組8只，黃芪甲甙低、高劑量組大鼠按體重劑量(最終定容至1.5 mL)連續(xù)腹腔注射黃芪甲甙7天，正常對照組和模型組腹腔注射相同體積羧甲基纖維素鈉。給藥第6、7天模型組、黃芪甲甙低劑量組(10 mg/kg)、黃芪甲甙高劑量組(20 mg/kg)大鼠加用60 mg/kg(定容至1 mL)異丙腎上腺素背部多點皮下注射，正常對照組組背部皮下注射同體積生理鹽水。

1.2.3 動物處死 大鼠末次給藥后12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉大鼠，待大鼠充分麻醉后，逐層解剖，暴露心臟，心臟取血留取大鼠心臟。

1.2.4 心肌組織病理學(xué)檢查 取心尖部心肌組織，約0.3 cm×0.5 cm大小，用紗布吸盡組織上的血液，放入10%甲醛固定，編號，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋，再切成4 μm厚切片，HE染色，光鏡觀察并攝片。

1.2.5 血清肌酸激酶及肌酸激酶同工酶含量檢測

將大鼠血液標(biāo)本于4 ℃離心，2 500轉(zhuǎn)/分，10 min，離心后，取上清液，送檢南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科。

1.2.6 Western blotting檢測心肌鈣敏感受體蛋白的表達(dá) (1)蛋白的提?。喝⌒∈笮募〗M織，加人蛋白裂解液，4 ℃條件下12 000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清。用BCA定量法對所提蛋白進(jìn)行定量。(2)電泳、轉(zhuǎn)膜封閉：用微量進(jìn)樣器將樣品緩慢加入加樣孔中，用10% SDS-PAGE電泳2 h，然后200毫安轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉的封閉液中封閉37 ℃ 1 h。(3)抗體孵育：用5%封閉液稀釋一抗(β-actin：1∶500，CaSR：1∶200)，加入新鮮封閉液配制的一抗溶液，搖床上放置1 h后，4 ℃孵育過夜，棄一抗溶液用TBST將PVDF膜在搖床上洗3次，10 min/次。加入二抗溶液(兔抗1∶4 000)，37 ℃搖床1～2 h。

1.3顯影用ECL顯影劑在Western blotting分析儀成像系統(tǒng)中顯像。

1.4實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理及分析采用SPSS13.0軟件做統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清肌酸激酶、肌酸激酶同工酶值經(jīng)過異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠缺血缺氧損傷及黃芪甲甙藥物保護(hù)處理后，與正常對照組比較，模型組大鼠血漿CK、CK-MB含量明顯升高(P<0.01)，表明模型組大鼠心肌已受損，大鼠缺血缺氧心肌損傷模型制備成功。與模型組比較，黃芪甲甙高劑量組(20 mg/kg)，大鼠血漿CK、CK-MB值明顯降低(P<0.01);黃芪甲甙低劑量組(10 mg/kg)，大鼠血漿CK值明顯降低 (P<0.01)，CK-MB未見明顯降低(P>0.05)。見表1及圖1、2。

2.2各組大鼠心肌病理形態(tài)學(xué)變化正常對照組心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞連續(xù)完整，大小均勻，胞核居中，胞質(zhì)著色均勻，無水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，未見明顯病理形態(tài)學(xué)改變。模型組心肌纖維腫脹、斷裂，心肌細(xì)胞排列顯著紊亂,肌纖維橫紋不清,壞死心肌融合成大片均質(zhì)狀壞死灶，細(xì)胞空泡變性明顯，細(xì)胞皺縮，胞核皺縮甚至消失，間質(zhì)水腫，組織間隙明顯增寬，可見炎性細(xì)胞浸潤。黃芪甲甙高劑量組(20 mg/kg)對心肌組織病理形態(tài)學(xué)改善明顯,心肌纖維排列整齊，未見明顯壞死灶出現(xiàn)，間質(zhì)輕度水腫，組織間隙輕度增寬，少量細(xì)胞皺縮，未見明顯細(xì)胞空泡。黃芪甲甙低劑量組(10 mg/kg)細(xì)胞少量空泡變性，可見少量炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維局灶性斷裂，病理改變介于模型組與黃芪甲甙高劑量組之間。見圖3。

表1不同組別CK、CK-MB檢測值

組別nCK(U/L)CK-MB(U/L)正常對照組8546.7±28.60531.7±49.64模型組81216.0±102.70a1028.0±108.80a黃芪甲甙低劑量組8877.7±46.62b836.7±49.12黃芪甲甙高劑量8771.3±51.17b710.4±40.5b

與正常對照組比較，a：P<0.01；與模型組比較，b：P<0.01

圖1 不同組別血清肌酸激酶含量與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖2 不同組別血清肌酸激酶同工酶含量與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.3 Western-Blotting法檢測CaSR蛋白表達(dá)經(jīng)過異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠缺血缺氧損傷及黃芪甲甙藥物保護(hù)處理后，用蛋白印跡法檢測各組CaSR蛋白表達(dá)情況，跟正常對照組比較，模型組CaSR蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01);黃芪甲甙處理組跟模型組比較，CaSR蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)，黃芪甲甙高劑量組(20 mg/kg)CaSR表達(dá)下降更明顯(P<0.01)。見表2及圖4、圖5。

與正常對照組比較，a：P<0.01；與模型組比較，b：P<0.01；與模型組比較，c：P<0.05

圖4 不同組別心肌組織Western blotting法檢測CaSR蛋白表達(dá)注：1、2：正常對照組；3、4：模型組；5、6：黃芪甲甙低劑量組；7、8：黃芪甲甙高劑量組

圖5 不同組別心肌組織Western-Blotting法檢測CaSR蛋白表達(dá)與正常對照組比較，**：P<0.01；與模型組比較，##：P<0.01；與模型組比較，☆：P<0.05

3 討 論

異丙腎上腺素(Isoproterenol ISO)是一種強β受體激動劑，主要使心率增快、心肌收縮力增強等使心臟負(fù)荷加重，可引起冠狀動脈痙攣，造成心肌微循環(huán)障礙，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，發(fā)生心肌梗死、壞死；造成心肌酶等生化指標(biāo)、心電圖以及心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。簡單易行的異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠缺血缺氧心肌損傷產(chǎn)生的變化與人類心肌缺血及梗死所發(fā)生病理生理變化、病理形態(tài)學(xué)的改變具有相似性[5-6]，因而被廣泛用于研究心血管疾病領(lǐng)域的研究[7]。

黃芪甲甙(Astragaloside)為黃芪中一種有代表性的單體有效活性成分，具有明顯的抗氧化活性、抗病毒、抗炎、抗凋亡作用[8-11]，黃芪甲甙也可抑制缺血心肌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣超載[12]。不同濃度的黃芪甲甙對于缺血缺氧心肌保護(hù)作用程度不一樣[13]。CaSR主要通過引起鈣超載及誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡在缺血缺氧心肌損傷中發(fā)揮作用。

心肌細(xì)胞膜的完整性和心肌損傷程度的改變可通過血漿中肌酸激酶、肌酸激酶同工酶等心肌酶的活性反映[14-15]。本實驗結(jié)果表明，模型組肌酸激酶及肌酸激酶同工酶活性較普通組顯著升高，與模型組比較，黃芪甲甙各組血清肌酸激酶及肌酸激酶同工酶降低，表明黃芪甲甙對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠缺血缺氧損傷心肌有保護(hù)作用，高劑量(20 mg/kg)較低劑量(10 mg/kg)效果明顯。該實驗結(jié)果顯示，正常對照組心肌組織未見明顯病理學(xué)改變，ISO所致缺血缺氧損傷大鼠心肌病理切片出現(xiàn)心肌斷裂，細(xì)胞排列紊亂，壞死心肌融合成片，細(xì)胞皺縮，組織間隙增寬，細(xì)胞空泡變性明顯，胞核皺縮甚至消失，炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫等改變，提示細(xì)胞明顯壞死及凋亡現(xiàn)象。黃芪甲甙各組對病理形態(tài)學(xué)均有改善作用，能明顯減輕細(xì)胞凋亡、壞死及炎性細(xì)胞浸潤，高劑量較低劑量改善明顯，表明黃芪甲甙能減輕細(xì)胞壞死及凋亡從而對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的缺血缺氧損傷大鼠心肌有保護(hù)作用，且與藥物劑量相關(guān)，高劑量作用大于低劑量。ISO誘導(dǎo)的心肌缺血缺氧時可使CaSR表達(dá)增加，可引起鈣超載和激活細(xì)胞凋亡通路對心肌細(xì)胞造成損傷。實驗結(jié)果表明模型組CaSR蛋白表達(dá)較普通組增高，說明以異丙腎上腺素誘導(dǎo)缺血缺氧心肌損傷模型成功，CaSR表達(dá)上調(diào)；而使用藥物黃芪甲甙實驗組，CaSR蛋白均表達(dá)下降，高劑量較低劑量下降明顯，提示黃芪甲甙可下調(diào)受損心肌CaSR表達(dá)，從而減輕CaSR對心肌損傷的作用而保護(hù)心肌，且有劑量依賴性。

綜上所述，黃芪甲甙對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠缺血缺氧心肌有保護(hù)作用；其機制可能是為下調(diào)CaSR蛋白表達(dá)從而減輕CaSR對心肌損傷的作用。

[1] Zhang WH,Fu SB,Lu FH,et al.Involvement of calcium-sensing rece-ptor in ischemia/reperfusion-induced apoptosis in rat cardiomyocytes[J]. Biochem Biophs Res Commun,2006,347(4):872-881.

[2] Qi LW,Li P,Ren MT,et al.Application of high-performance liquid chromatog-raphy-electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry for analysis and quality control of Radix Astragali and its preparations[J].J Chromatogr A,2009,1216(11):2087-2097.

[3] Yang QY,Chen KJ,Lu S,et al.Research progress on mechanism of action of R-adix Astragalus in the treatment of heart failure[J].Chin J Integr Med,2012,18(3):235-240.

[4] Fu S,Zhang J,Menniti-Ippolito F,et al.Huangqi injection (a traditional Chinese patent medicine) for chronic heart failure:a systematic review[J].PLoS One,2011,6(5):e19604.

[5] Karthikeyan K,Bai B R,Devaraj S N.Cardioprotective effect of grape se-ed proanthocyanidins on isoproterenol-induced myocardial injury in rats[J].Int J Cardiol,2007,115(3):326-333.

[6] Panda V S,N S R.Evaluation of cardioprotective activity of Ginkgo bilo-ba and Ocimum sanctum in rodents[J].Altern Med Rev,2009,14(2):161-171.

[7] Stanely M P P,Priya S.Preventive effects of rutin on lysosomal enzymes in isop-roterenol induced cardio toxic rats: biochemical,histological and in vitro evide-nces[J].Eur J Pharmacol,2010,649(1-3):229-235.

[8] Lee D Y,Noh H J,Choi J,et al.Anti-inflammatory cycloartane-type sap-onins of Astragalus membranaceus[J].Molecules,2013,18(4):3725-3732.

[9] Gui D,Guo Y,Wang F,et al.Astragaloside IV,a novel antioxidant,pre-vents glucose-induced podocyte apoptosis in vitro and in vivo[J].PLoS One,2012,7(6):e39824.

[10] Lee D Y,Noh H J,Choi J,et al.Anti-inflammatory cycloartane-type sap-onins of Astragalus membranaceus[J].Molecules,2013,18(4):3725-3732.

[11] Zhao J,Yang P,Li F,et al.Therapeutic effects of astragaloside IV on myocardial injuries: multi-target identification and network analysis[J].PLoS One,2012,7(9):e44938.

[12] Li Z P,Cao Q.Effects of astragaloside IV on myocardial calcium transpo-rt and cardiac function in ischemic rats[J].Acta Pharmacol Sin,2002,23(10):898-904.

[13] 李真真，徐志懿，關(guān)新強，等．黃芪甲苷對異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌梗死保護(hù) 作用[J]．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，48(3)：275-278.

[14] Levinson SS,Hobbs GA.Usefulness of various lactate dehydrogenase isoenzyme profiles after myocardial infarction[J].Ann Clin Lab Sci,1994,24(4):364-370.

[15] Ahmed KK,Rana AC,Dixit VK.Effect of Calotropis procera latex on isoprot-erenol induced myocardial infarction in albino rats[J].Phytomedicine,2004,11(4):327-330.

ThepeotectiveeffectofastragalosideIVmediatedcalciumsensitivereceptoronischemiaanoxicmyocardialinducedbyisoproterenol

DENG Chun,YANG Yunhua,ZUO Yuanbojiao,et al

(DepartmentofPediatrics,CentralHospitalofYongzhou,Yongzhou425000,Hunan,China)

ObjectiveTo explore the protective effects and mechanism of Astragaloside IV mediated calcium sensitive receptor (CaSR) on ischemia anoxic myocardial.Methods32 SD rats were randomly divided into normal control group,model group (IS0) glucoside,astragaloside IV low dose group (ISO + AST IV 10 mg/kg),astragaloside IV high dose group (ISO + AST IV 20 mg/kg).Observing myocardial tissue pathology change of different groups by HE staining,detecting CK and CK-MB content; detecting CaSR protein expression by Western Blotting method.ResultsCompared with model group astragaloside IV low dose group and high dose group can reduce the myocardial pathological varying degrees changes,reduce serum CK and CK-MB,lower CaSR protein expression levels (P< 0.05).ConclusionAstragaloside IV can protect ischemia anoxic myocardial injury induced by ISO; The mechanism may reduce the CaSR protein expression and effects on myocardial injury.

Astragaloside IV; CaSR;Isoproterenol

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.008

2016-04-15；

2016-11-28

*通訊作者，E-mail：yangyunhua48@163.com.

R54

A

蔣湘蓮)