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(1.南華大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng)421001；2.南華大學(xué)生理學(xué)教研室)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

乙酸致內(nèi)臟痛模型小鼠杏仁中央核c-fos表達(dá)和動(dòng)物焦慮樣行為的影響

李林1，曹文宇1，劉政海1，曾佳玉1，徐楊2，張仁麗1，萬(wàn)煒1，向宇燕1*

(1.南華大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng)421001；2.南華大學(xué)生理學(xué)教研室)

目的探討乙酸所致內(nèi)臟痛小鼠杏仁中央核(CeA)c-fos的表達(dá)時(shí)程變化及其與小鼠焦慮樣行為的關(guān)系。方法將雄性昆明小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、乙酸致內(nèi)臟痛1 h組、乙酸致內(nèi)臟痛2 h組以及乙酸致內(nèi)臟痛24 h組，觀察各組動(dòng)物1 h內(nèi)腹壁收縮次數(shù)，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)生理鹽水組、乙酸致內(nèi)臟痛2 h組及乙酸致內(nèi)臟痛24 h組動(dòng)物焦慮樣行為進(jìn)行檢測(cè)，行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，采用免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)此3組動(dòng)物杏仁中央核c-fos的表達(dá)變化。結(jié)果內(nèi)臟痛評(píng)分表明，與生理鹽水組比較，乙酸致內(nèi)臟痛1 h組動(dòng)物腹壁收縮次數(shù)明顯增加(P<0.001)，而乙酸致內(nèi)臟痛2 h組及乙酸致內(nèi)臟痛24 h組動(dòng)物腹壁收縮次數(shù)無(wú)明顯變化(P>0.05)；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，乙酸致內(nèi)臟痛2 h組和乙酸致內(nèi)臟痛24 h組中央格停留時(shí)間及穿越中央格子數(shù)均明顯減少(P<0.001)，而三組動(dòng)物活動(dòng)度間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。免疫組化結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，乙酸致內(nèi)臟痛2 h組及乙酸致內(nèi)臟痛24 h組動(dòng)物杏仁中央核c-fos表達(dá)增加(P<0.05)。結(jié)論乙酸致內(nèi)臟痛小鼠焦慮情緒持續(xù)的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于疼痛本身，其機(jī)制可能與杏仁中央核神經(jīng)元過(guò)度活化有關(guān)。

內(nèi)臟痛； 杏仁中央核； c-fos； 焦慮

疼痛是一種與組織損傷或潛在損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺(jué)和情感體驗(yàn)，它包括感覺(jué)和情感兩個(gè)層面：感覺(jué)層面主要指對(duì)疼痛程度的感受，情感層面則主要包括疼痛引起的焦慮樣或抑郁樣行為等，其中疼痛相關(guān)的負(fù)面情緒的影響比疼痛本身的危害更大[1-2]。內(nèi)臟痛是病理性疼痛最常見(jiàn)的一種形式，常由機(jī)械性牽拉、痙攣、缺血和炎癥等刺激所致，但其定位不明確，患者常伴有不安、恐懼、焦慮樣行為[3-4]，然而，內(nèi)臟痛引起個(gè)體焦慮行為改變的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。杏仁中央核(central nucleus of amygdala，CeA)是情感和疼痛感覺(jué)信號(hào)組成部分的一個(gè)集成中心，參與了疼痛等傷害性刺激誘導(dǎo)負(fù)性情緒的調(diào)節(jié)[5-6]。c-fos是一種存在于正常神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)的即刻早期基因，c-fos的表達(dá)與中樞對(duì)各種傷害性刺激的應(yīng)答有密切關(guān)系，c-fos表達(dá)的數(shù)量與所受到的刺激強(qiáng)度正相關(guān)，是研究腦區(qū)激活的經(jīng)典標(biāo)記物[7]。本文旨在探討乙酸所致內(nèi)臟痛小鼠杏仁中央核c-fos表達(dá)的時(shí)程變化及其與動(dòng)物焦慮行為之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物雄性昆明小鼠48只，體重22～25 g(湖南斯萊克景達(dá)提供)隨機(jī)分成生理鹽水組，乙酸致內(nèi)臟痛1 h組、2 h組、24 h組，每組12只。所有小鼠均在本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，室溫控制在(24±2) ℃，12 h晝夜節(jié)律(光照時(shí)間08∶00-20∶00)，自由飲水與進(jìn)食。

1.2動(dòng)物分組

1.2.1 內(nèi)臟痛模型的建立 乙酸致內(nèi)臟痛1 h組(one hour after acetic acid-elicited visceral pain,AA-1h )、乙酸致內(nèi)臟痛2 h組(two hour after acetic acid-elicited visceral pain,AA-2 h )以及乙酸致內(nèi)臟痛24 h組(twenty-four hour after acetic acid-elicited visceral pain,AA-24 h )通過(guò)腹腔注射1.0%乙酸10 mL/kg建立內(nèi)臟痛模型組[8]，生理鹽水組腹腔注射等量生理鹽水，AA-1h、AA-2 h及AA-24 h分別指乙酸腹腔注射后第1 h、第2 h以及第24 h。將小鼠單獨(dú)置于白色清潔飼養(yǎng)箱內(nèi)，記錄所有動(dòng)物1 h內(nèi)的腹壁收縮次數(shù)。小鼠出現(xiàn)腹部收內(nèi)凹、臀部歪扭和后肢伸張記為腹壁收縮1次。

1.2.2 焦慮行為檢測(cè) 將小鼠預(yù)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境1 h后逐一置于曠場(chǎng)中央格區(qū)讓其自由活動(dòng)5 min，并用攝像機(jī)記錄小鼠整個(gè)活動(dòng)過(guò)程。采用單盲法觀察記錄小鼠中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中央格穿越格子數(shù)、總穿越格子數(shù)。每只小鼠檢測(cè)完畢后，均清潔曠場(chǎng)并予75%酒精清除實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)氣味。實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越格子總數(shù)代表小鼠活動(dòng)度，中央格穿越格子數(shù)越多、中央格停留時(shí)間越長(zhǎng)說(shuō)明其焦慮程度越輕[3]。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，動(dòng)物立即給予10% 水合氯醛深度麻醉，先用生理鹽水灌注，再用 4 ℃ 的4% 多聚甲醛固定液固定，取腦于 4 ℃冰箱后固定過(guò)夜，依次予15%、30%蔗糖充分沉糖后，冰凍切片機(jī)行連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm。取一套切片依次經(jīng)3%過(guò)氧化氫溶液處理及0.01%mmol/L PBS漂洗三遍后，5%羊血清室溫封閉2 h，加入羊抗兔多克隆抗體c-fos(santa cruz,1∶1 000)室溫下孵育2 h，然后轉(zhuǎn)至4 ℃冰箱過(guò)夜。0.01 mmol/L PBS沖洗，10 min×3次；加入山羊抗兔Ig G(1∶200)，室溫下孵育2 h；0.01 mmol/L PBS沖洗，10 min×3次；加入過(guò)氧化酶標(biāo)記的ABC復(fù)合物(A液和B液比例為1∶200，提前30 min配制)室溫下孵育2 h；0.01 mmol/L PBS沖洗，10 min×3次；DAB顯色。切片常規(guī)脫水、透明和封片，400倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。光學(xué)顯微鏡采集圖像(MC55廣東明美科技公司)。

2 結(jié) 果

2.1注射乙酸后不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物內(nèi)臟痛評(píng)分AA-1h組動(dòng)物腹部劇烈疼痛，腹壁收縮次數(shù)顯著增加，而生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組均僅有極少數(shù)扭體行為發(fā)生(圖1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，AA-1h組腹壁收縮次數(shù)明顯多于生理鹽水組(P<0.001)，而AA-2 h組及AA-24 h組與生理鹽水組比較腹壁收縮次數(shù)間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.2注射乙酸后不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物焦慮行為評(píng)分

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了生理鹽水組、AA-2 h組和AA-24 h組動(dòng)物焦慮情緒(圖2)。與生理鹽水組相比，AA-2 h組和AA-24 h組小鼠在曠場(chǎng)中央格穿越格子數(shù)明顯減少(P<0.001)，AA-2 h組和AA-24 h組小鼠在曠場(chǎng)中央格停留的時(shí)間也明顯減少(P<0.001)，但各組動(dòng)物在曠場(chǎng)中穿越的總格子數(shù)無(wú)差異(P>0.05)。

圖1 乙酸或生理鹽水對(duì)腹痛的時(shí)程影響與生理鹽水組比較，***P<0.001

圖2 生理鹽水或乙酸對(duì)小鼠焦慮行為的影響A：生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組中央格停留時(shí)間；B：生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組中央格穿越格子數(shù)；C：生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組穿越總格子數(shù). 與生理鹽水組比較，***P<0.001;與生理鹽水組比較，**P<0.01

2.3注射乙酸后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠杏仁中央核c-fos表達(dá)變化免疫組化結(jié)果顯示(圖3)，與生理鹽水組比較，AA2 h組和AA24 h組小鼠杏仁中央核c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)。而AA24 h組與AA2 h組比較c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，杏仁中央核在內(nèi)臟痛消失后仍然處于激活狀態(tài)。

圖3 生理鹽水或乙酸對(duì)杏仁中央核c-fos 表達(dá)的影響A、B、C為別為生理鹽水組、AA-2 h組及AA-24 h組杏仁中央核c-fos免疫組化結(jié)果，D為免疫組化結(jié)果直方圖，與生理鹽水組比較，***:P<0.001；與生理鹽水組比較， *:P<0.05；與AA-2 h組及生理鹽水組比較,##:P<0.01，bar=100 μm

3 討 論

內(nèi)臟痛是臨床常見(jiàn)癥狀，隨著研究的深入，人們對(duì)內(nèi)臟痛的認(rèn)識(shí)也逐步加深。乙酸致內(nèi)臟痛是指通過(guò)腹腔注射乙酸引起腹腔內(nèi)臟器官出現(xiàn)化學(xué)性炎癥，使動(dòng)物產(chǎn)生內(nèi)臟疼痛。盡管存在由于乙酸可能造成腹壁緊張，導(dǎo)致軀體痛混雜的缺點(diǎn)，但這類(lèi)模型操作方便，避免了麻醉藥對(duì)模型的影響，疼痛行為反應(yīng)即時(shí)出現(xiàn)，變化明顯。通過(guò)Schmauss C[9]提出的評(píng)分方法能方便的量化疼痛行為指標(biāo)，是目前應(yīng)用較廣泛的內(nèi)臟痛模型之一。本課題組前期實(shí)驗(yàn)用大鼠復(fù)制了這一疼痛模型[10]；本實(shí)驗(yàn)中，在小鼠腹腔注射乙酸后1 h內(nèi)腹壁收縮次數(shù)明顯增加，同樣建立了炎性?xún)?nèi)臟痛模型。

炎癥痛的同時(shí)存在焦慮情緒，但疼痛的存在會(huì)影響焦慮行為的檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)在注射AA后2 h、24 h檢測(cè)了小鼠的疼痛行為，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物的腹壁收縮次數(shù)顯著減少，提示動(dòng)物的內(nèi)臟痛消失，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道及本課題組之前的研究相一致[3,10]。進(jìn)一步在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，注射乙酸后2 h動(dòng)物無(wú)論是在中央格停留的時(shí)間及中央格穿越的次數(shù)明顯減少，但動(dòng)物的活動(dòng)度無(wú)明顯改變，提示動(dòng)物在內(nèi)臟痛消失后仍然出現(xiàn)焦慮樣行為，與早期報(bào)道的文獻(xiàn)相一致[3]；為了觀察動(dòng)物焦慮情緒持續(xù)的時(shí)間，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物在注射乙酸后24 h的焦慮樣行為，結(jié)果表明模型小鼠在中央格停留的時(shí)間及中央格穿越的格子數(shù)仍然顯著少于生理鹽水對(duì)照組，提示內(nèi)臟痛伴隨的焦慮情緒遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于疼痛本身，出現(xiàn)疼痛與情緒相互分離的現(xiàn)象。疼痛與情緒相分離這一現(xiàn)象在軀體疼痛，如福爾馬林疼痛、切割痛中已有報(bào)道[11-12]。

c-fos是一種存在于正常神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)的即刻早期基因，c-fos的表達(dá)與中樞對(duì)各種傷害性刺激的應(yīng)答有密切關(guān)系，它的表達(dá)可反應(yīng)神經(jīng)元功能處于激活狀態(tài)，被認(rèn)為是神經(jīng)元活化的標(biāo)志物[13]，也就是說(shuō)表達(dá)c-fos蛋白的神經(jīng)元可能參與了這種刺激信息的處理過(guò)程。早期的研究指出，乙酸誘導(dǎo)的內(nèi)臟痛大鼠藍(lán)斑核、孤束核、下丘腦室旁核c-fos的表達(dá)增加，可以持續(xù)至乙酸注射后6 h[14]。與生理鹽水組相比，AA-2 h組、AA-24 h組動(dòng)物杏仁中央核c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加，提示杏仁中央核神經(jīng)元處于激活狀態(tài)。與生理鹽水組相比，AA-2 h組、AA-24 h組動(dòng)物在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出焦慮樣行為，這可能是與杏仁中央核神經(jīng)元過(guò)度激活有關(guān)。在傷害性刺激結(jié)束后，杏仁中央核的激活被認(rèn)為是誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)負(fù)性情緒的重要原因[5-6]。所謂表觀遺傳是指：基因表達(dá)發(fā)生了可遺傳的改變，但序列卻沒(méi)有發(fā)生變化。甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及非編碼調(diào)控機(jī)制共同構(gòu)成了表觀遺傳涉及的機(jī)制。表觀遺傳修飾在即早基因表達(dá)調(diào)控中具有重要的作用，研究表明c-fos基因甲基島甲基化水平的降低可能與其表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，并且參與動(dòng)物行為的調(diào)節(jié)[15]。因此，推測(cè)在乙酸誘導(dǎo)內(nèi)臟痛小鼠的焦慮樣行為產(chǎn)生的過(guò)程中，杏仁中央核的活化可能起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用，其具體的機(jī)制仍然有待于進(jìn)一步探討。

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Theexpressionofc-fosinthecentralnucleusofamygdalaanditsrelationshipwithvisceralpainrelatedanxiety-likebehaviourinmice

LI Lin,CAO Wenyu,LIU Zhenghai,et al

(DepartmentofClinicalAnatomy,SchoolofMedicine,UniversityofSouthChina,Hengyang,421001Hunan,China)

ObjectiveTo explore the expression of c-fos in the central nucleus of amygdala (CeA) and its relationship with acetic acid-elicited visceral pain (AAVP)related anxiety behavior in mice.MethodsMale Kunming mice were randomly divided into normal saline (NS)group and one hour after acetic acid-elicited visceral pain (AA-1h)group,two hours after acetic acid-elicited visceral pain (AA-2 h)group and twenty-four hours after acetic acid-elicited visceral pain (AA-24 h)group,visceral pain behaviours of all animals were measured by Writhing test while the anxiety-like behavior of NS group and AA-2 h group and AA-24 h group animals were determined by open field test (OFT).After the behavior test,the three group animals were scarified for the determination of c-fos in the CeA by immunohistochemistry.ResultsCompared to NS group， AA-1h group animals showed significantly increased number of writhes(P<0.001),while no statistics difference between NS group and AA-2 h or AA-24 h group(P>0.05，respectively) .In the OFT,AA-2 h or AA-24 h group showed significantly decreased time and number of crossing in the center compared with the NS group(P<0.001，respectively),while no difference in the locomotive activity was found among the three groups(P>0.05，respectively).The results of immunohistochemistry showed that compared to NS group,AA-2 h or AA-24 h group showed significantly increased number of c-fos positive cell in the CeA(NS vs AA-2 h,P<0.001,NS vs AA-24 h,P<0.05).ConclusionAA treatment leads to anxiety-like behavior in the mice even after the visceral pain disappeared,which might be due to the over-activated neuron in the CeA.

visceral pain； central nucleus of amygdala； c-fos；anxiety

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.007

2016-10-08；

2017-01-10

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：12A119) ，南華大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金(編號(hào)：2015XQD28)，湖南省(南華大學(xué))研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：CX2016B479 )，衡陽(yáng)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2015KJ19).

*通訊作者，E-mal:xyy6887@163.com.

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蔣湘蓮)