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        絲裂霉素對胃癌細(xì)胞SGC-7901miRNA表達(dá)譜的影響

        2017-12-25 03:30:56,,,,,,
        關(guān)鍵詞:南華大學(xué)絲裂霉素胃癌

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        (1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科;3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科)

        ·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

        絲裂霉素對胃癌細(xì)胞SGC-7901miRNA表達(dá)譜的影響

        謝娟1,唐霞2,李國慶2,劉艷萍2,李熠1,馮聚玲1,許麗芳1,王超3*

        (1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科;3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科)

        目的分析絲裂霉素(MMC)治療對胃癌細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響,為MMC的胃癌治療機(jī)制提供理論參考。方法體外培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞,根據(jù)噻唑蘭(MTT)法評估MMC的作用效果和作用濃度;利用miRNA芯片技術(shù)評估MMC干預(yù)后SGC-7901的miRNA表達(dá)譜改變,并通過qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA。結(jié)果SGC-7901細(xì)胞生長抑制率與MMC作用濃度間存在正相關(guān);MMC干預(yù)48 h后SGC-7901細(xì)胞有59個miRNA出現(xiàn)表達(dá)改變,與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比,SGC-7901胃癌細(xì)胞的miR-205*和miR-3924等11個miRNAs表達(dá)上調(diào),而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22個miRNA表達(dá)下調(diào);經(jīng)MMC干預(yù)后,部分異常表達(dá)得到恢復(fù)。結(jié)論MMC可能調(diào)控miR-498在內(nèi)的59個miRNA在胃癌細(xì)胞的表達(dá)。

        絲裂霉素; MiRNA表達(dá)譜; 胃癌; SGC-7901

        微小RNA(microRNA,miRNA) 是近年發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA,可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)[1-2]。腫瘤細(xì)胞中miRNA的異常改變,可影響下游癌基因或抑癌基因的表達(dá)水平或功能,進(jìn)而發(fā)揮促癌或抑癌作用[1]。研究證實(shí)miR-21可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲,miR-375作為腫瘤抑制因子可影響胃癌細(xì)胞的增殖,而miR-218在體內(nèi)外模型均可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3-5]。腫瘤細(xì)胞經(jīng)抗癌藥物治療后miRNA表達(dá)譜可隨之改變[6]。絲裂霉素(MMC)參與的多種化療藥物的綜合應(yīng)用是治療中晚期胃癌的重要手段之一[7]。張輝等[8]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞經(jīng)MMC作用后,miRNA表達(dá)譜發(fā)生了明顯改變。目前胃癌細(xì)胞經(jīng)過MMC作用后的miRNA表達(dá)譜尚無相關(guān)報道。本文初步探討了MMC對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的抑制功能,獲得了與胃癌相關(guān)的miRNA表達(dá)譜及經(jīng)MMC作用后改變的miRNA表達(dá)譜,這些結(jié)果可為后續(xù)胃癌的發(fā)生發(fā)展研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1細(xì)胞培養(yǎng)SGC-7901人胃癌細(xì)胞和正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞(中國科學(xué)院,上海,中國)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO,長島,NY,USA),另含2 mmol/L-谷氨酰胺(上海生工生物工程有限公司,上海,中國),10%胎牛血清(HyClone,UT,USA),50 U/mL青霉素和50 mg/鏈霉素。以密度為1×105個/mL鋪于6孔培養(yǎng)板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到50%后,換用新培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。給藥前另用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich,上海,中國)孵育12 h。

        1.2 MTT實(shí)驗(yàn)MTT測定法步驟參照制造商(Sigma-Aldrich,上海,中國)說明書。將5×104個/mL接種于96孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長后棄去培養(yǎng)液,加入用不含血清培養(yǎng)液配制的不同濃度的MMC(0.187 μmol/L,0.374 μmol/L,0.748 μmol/L,1.496 μmol/L和2.991 μmol/L),對照組細(xì)胞中為不加藥物的無血清培養(yǎng)液,每組設(shè)5個復(fù)孔,空白對照組為不含細(xì)胞的等量溶劑。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去上清,加入150 μL二甲基亞砜終止反應(yīng)。采用酶聯(lián)免疫儀(PerkinElmer,CA,USA)于570 nm波長測定每孔吸光度(A值)。生長抑制率計算公式為:生長抑制率(E)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。MMC作用48 h后的IC50濃度為抑制SGC-7901 細(xì)胞半數(shù)的濃度。

        1.3基因芯片人胃癌細(xì)胞株SGC-7901經(jīng)不同處理后加入1 mL TRIzol裂解液(Invitrogen,CA,USA)提取總RNA。待測RNA通過NanoDropTMfluorospectrometer(Thermo Scientific,Delaware,USA)在260 nm/280 nm處測得的OD值評估濃度和豐度,并通過1%變性瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性。微RNA通過miRNA分離試劑盒(Invitrogen,CA,USA)收集,并采用miRCURYTMArray Power試劑盒(Exiqon,Denmark)將miRNA標(biāo)記上HyTM熒光基團(tuán);在MAUI雜交系統(tǒng)(BioMicro,Salt Lake City,USA),標(biāo)記的miRNA與miRCURYTM芯片完成雜交。用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀(AxonInstruments,Foster City,CA,USA)采集熒光強(qiáng)度,并使用GenePix pro V6.0軟件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,上述基因芯片處理由上海康成生物工程有限公司協(xié)助完成。將各數(shù)據(jù)做標(biāo)準(zhǔn)化處理。計算相應(yīng)miRNA分子的表達(dá)倍數(shù)(FC,Fold Change),設(shè)FC≥2.0或≤0.5為差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。

        1.4 qRT-PCR 總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMreagentkit,TaKaRa,Japan)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用的qRT-PCR反應(yīng)液含0.5 μL 10 μmol/L的PCR特異性引物,0.5 μL的2×Master Mix,5 μL的10 μmol/L的PCR特異性引物,加水至總體積為8 μL;混合后加到384-PCR板,并加入2 μL cDNA;于Realtime PCR儀(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany),95 ℃下預(yù)變性10 min,隨后的40個PCR循環(huán)如下:95 ℃,10 s;60 ℃,60 s。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,從60 ℃緩慢加熱到99 ℃生成熔解曲線。目的miRNA和內(nèi)參(U6)的數(shù)據(jù)采用2- △△CT法計算。ΔΔCT=ΔCT SGC-7901(MMC干預(yù)后)-ΔCT SGC-7901,ΔCT=CT miRNA-CT U6。Ct是反應(yīng)時熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。見表1。

        表1 qRT-PCR引物表

        1.5統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計學(xué)分析處理軟件為統(tǒng)計學(xué)軟件版本SPSS13.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA),所得到的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差(ANOVA)分析以及采用LSD法行兩兩比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 MMC抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的活性MTT實(shí)驗(yàn)表明0.187、0.374、0.748、1.496、 2.991 μmol/L MMC對胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖抑制率分別為(21.3±1.5)%、(27.3±1.6)%、(45.3±1.5)%、(54.5±0.5)%和(63±0.1)%。隨著MMC作用濃度的升高,SGC-7901的增殖抑制率也隨之增高。MMC抑制SGC-7901增殖的IC50值為1.33 μmol/L(圖1)。

        圖1 MMC 干預(yù)SGC-7901細(xì)胞48 h后細(xì)胞的存活情況與對照組比較,*:P<0.05

        2.2 MMC調(diào)控SGC-7901的miRNA表達(dá)譜SGC-7901經(jīng)過MMC干預(yù)后有60種miRNA出現(xiàn)差異表達(dá),刪去表達(dá)改變倍數(shù)絕對值小于1的miRNA [即log2(FC)<1],尚包括38個顯著上調(diào)的miRNA,21個顯著下調(diào)的miRNA。與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比,SGC-7901胃癌細(xì)胞的miR-205*和miR-3924等11個miRNAs表達(dá)上調(diào),而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22個miRNA表達(dá)下調(diào),經(jīng)MMC藥物干預(yù)后,該異常表達(dá)可部分恢復(fù)(圖2A)。此外,與GES-1相比較,在SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的miR-622,miR-7和miR-877等6個miRNAs,表達(dá)上調(diào)的miR-296-5p,miR-943和miR-1284等13個miRNAs的表達(dá)水平在MMC藥物干預(yù)前后無明顯變化(圖2B)。而在SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)無改變的miR-3926,miR-3074-3p和miR-H5-3P等7個miRNAs在經(jīng)過MMC處理后,出現(xiàn)了表達(dá)的改變(圖2C)。

        2.3實(shí)時熒光定量qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果將miRNA芯片檢測結(jié)果與qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)行比較,與正常胃黏膜GES-1細(xì)胞相比,SGC-7901的miR-7、miR-185、miR-33b、miR-16的表達(dá)倍數(shù)在芯片結(jié)果中分別為0.24、0.215、0.275和2.288,在qRT-PCR結(jié)果中表達(dá)倍數(shù)分別為0.38、0.34、0.64和1.50。在MMC 干預(yù)的SGC-7901細(xì)胞中,miR-498 和miR-3924 的表達(dá)倍數(shù)在芯片結(jié)果中為13.067 和0.334,在qRT-PCR 結(jié)果中表達(dá)倍數(shù)分別為8.46 和0.38。qRT-PCR 結(jié)果與miRNA 芯片結(jié)果的趨勢一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了芯片結(jié)果(圖3)。

        3 討 論

        相關(guān)研究已證實(shí),miRNA的異常表達(dá)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。本文對比了SGC-7901胃癌細(xì)胞與GES-1正常胃黏膜細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)在SGC-7901細(xì)胞中miR-3924、miR-498和miR-1247等33個miRNA的表達(dá)存在異常;該結(jié)果包括了已報道的miR-205*,新成員如miR-498,但未包括已經(jīng)報道的miR-221和miR-222等,這可能與胃癌機(jī)制的復(fù)雜易變性有關(guān)。

        近年來,學(xué)者們對miRNA與化療藥物效應(yīng)展開了相關(guān)研究。早期的研究大多集中在增強(qiáng)藥物敏感性和對抗藥物耐藥性上。有報道在胃癌細(xì)胞系SGC-7901中發(fā)現(xiàn)miR-221 和miR-222 的表達(dá)明顯上調(diào),敲除其編碼基因后可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲,并增加對放化療治療的敏感性,其作用機(jī)制可能與調(diào)控PTEN基因有關(guān)[10]。Zhu等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-200bc/429可通過靶向調(diào)控BCL2和XIAP的表達(dá)在胃癌和肺癌細(xì)胞株對抗癌藥物的多重耐藥性中發(fā)揮重要作用。學(xué)者們又陸續(xù)通過研究發(fā)現(xiàn)抗癌藥物能改變腫瘤細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜,Shah MY等[12]研究報道MCF-7乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過5-FU處理后,出現(xiàn)了23個上調(diào)和19個下調(diào)的miRNA[12]。Zhou等[13]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8和HCT-116經(jīng)5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑藥物處理后,miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變,在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的miR-197,miR-191,miR-92a,miR-93,miR-222和miR-1826均出現(xiàn)了明顯下調(diào)。

        絲裂霉素作為治療胃癌藥物化療中的手段之一,目前尚無報道其可影響胃癌細(xì)胞miRNA的表達(dá)譜。本文使用不同濃度的MMC處理胃癌細(xì)胞SGC-7901后,發(fā)現(xiàn)MMC可有效抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖,并且可顯著影響胃癌細(xì)胞miRNA的表達(dá)。經(jīng)MMC藥物作用后,SGC-7901的miRNA表達(dá)譜出現(xiàn)59個miRNA的差異表達(dá),其中38個顯著上調(diào),21個顯著下調(diào)。此外,與正常胃黏膜上皮細(xì)胞相比,SGC-7901胃癌細(xì)胞的miR-205*和miR-3924等11個miRNAs表達(dá)上調(diào),而miR-498,miR-18b,miR-196b,miR-1247等22個miRNA表達(dá)下調(diào),在經(jīng)過MMC藥物干預(yù)后,部分異常表達(dá)得到恢復(fù)。其中miR-498是我們在本次研究中新發(fā)現(xiàn)的在胃癌中異常表達(dá)的新成員,此前在胃癌中并未見相關(guān)報道。目前,miR-498在其它腫瘤中異常表達(dá)的報道并不多,有研究發(fā)現(xiàn)miR-498在非小細(xì)胞性肺癌、結(jié)直腸腺癌中低表達(dá)[14-15]。而在乳腺癌中高表達(dá)[16]。本文結(jié)果顯示miR-498在SGC-7901胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯下調(diào),經(jīng)MMC作用后該異常表達(dá)可恢復(fù);這提示miR-498可能參與了MMC的抑癌機(jī)制。本文采用的SGC-7901源自一位胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,為中度分化胃腺癌細(xì)胞,因結(jié)果重復(fù)性好被廣泛應(yīng)用;在進(jìn)一步研究中,將繼續(xù)在臨床患者和其他腫瘤細(xì)胞系中驗(yàn)證上述結(jié)果。

        圖2 SGC-7901經(jīng)MMC作用后miRNA的差異表達(dá)譜A:兩個表達(dá)譜中改變趨勢不同的miRNAs;B:兩個表達(dá)譜中改變趨勢相同的miRNAs;C:僅在經(jīng)過MMC處理后在SGC-7901細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs. 縱坐標(biāo)為miRNA表達(dá)水平的Log2(FC)值,F(xiàn)C為miRNA的表達(dá)改變值

        圖3 qRT-PCR 驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果A:qRT-PCR 驗(yàn)證胃癌細(xì)胞系SGC-7901與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1比較的miRNA表達(dá)譜結(jié)果;B:qRT-PCR 驗(yàn)證SGC-7901經(jīng)過MMC處理后,SGC-7901細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜結(jié)果. 縱坐標(biāo)為miRNA表達(dá)水平的改變倍數(shù)

        總之,研究表明胃癌細(xì)胞中miRNA可出現(xiàn)異常表達(dá),miR-498等miRNA在胃癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平明顯改變,而經(jīng)MMC藥物干預(yù)后,該異常表達(dá)水平可出現(xiàn)部分恢復(fù),這提示MMC可能通過調(diào)控miR-498等miRNA的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。

        [1] Lu J,Getz G,Miska EA,et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers[J].Nature,2005,435(7043):834-838.

        [2] Ohtsuka M,Ling H,Doki Y,et al.MicroRNA Processing and Human Cancer[J].J Clin Med,2015,4(8):1651-1667.

        [3] Tie J,Pan Y,Zhao L,et al.MiR-218 inhibits invasion and metastasis of gastric cancer by targeting the Robo1 receptor[J].PLoS Genet,2010,6(3):e1000879.

        [4] Ding L,Xu Y,Zhang W,et al.MiR-375 frequently downregulated in gastric cancer inhibits cell proliferation by targeting JAK2[J].Cell Res,2010,20(7):784-793.

        [5] Li L,Zhou L,Li Y,et al. MicroRNA-21 stimulates gastric cancer growth and invasion by inhibiting the tumor suppressor effects of programmed cell death protein 4 and phosphatase and tensin homolog [J]. J BUON,2014,19(1):228-236.

        [6] Maushagen R,Pries R,Wollenberg B. Chemotherapy with paclitaxel leads to microRNA release[J]. HNO,2015,63(11):792-796.

        [7] Kang YK,Chang HM,Yook JH,et al.Adjuvant chemotherapy for gastric cancer:a randomised phase 3 trial of mitomycin-C plus either short-term doxifluridine or long-term doxifluridine plus cisplatin after curative D2 gastrectomy (AMC0201)[J].Br J Cancer,2013,108(6):1245-1251.

        [8] 張輝,蘇式兵,周錢梅,等. 絲裂霉素對乳腺癌細(xì)胞microRNAs表達(dá)譜的影響[J].中國腫瘤,2010,19(2):131-134.

        [9] Ueda T,Volinia S,Okumura H,et al.Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer:a microRNA expression analysis[J].Lancet Oncol,2010,11(2):136-146.

        [10] Chun-Zhi Z,Lei H,An-Ling Z,et al. MicroRNA-221 and microRNA-222 regulate gastric carcinoma cell proliferation and radioresistance by targeting PTEN [J]. BMC Cancer,2010,10:367.

        [11] Zhu W,Xu H,Zhu D,et al. miR-200bc/429 cluster modulates multidrug resistance of human cancer cell lines by targeting BCL2 and XIAP [J]. Cancer Chemother Pharmacol,2012,69(3):723-731.

        [12] Shah MY,Pan X,Fix LN,et al.5-Fluorouracil drug alters the microRNA expression profiles in MCF-7 breast cancer cells[J].J Cell Physiol,2011,226(7):1868-1878.

        [13] Zhou J,Zhou Y,Yin B,et al.5-Fluorouracil and oxaliplatin modify the expression profiles of microRNAs in human colon cancer cells in vitro[J].Oncol Rep,2010,23(1):121-128.

        [14] Wang M,Zhang Q,Wang J,et al. MicroRNA-498 is downregulated in non-small cell lung cancer and correlates with tumor progression[J]. J Cancer Res Ther,2015,11(Suppl 1):C107-111.

        [15] Gopalan V,Smith RA1,Lam AK. Downregulation of microRNA-498 in colorectal cancers and its cellular effects[J]. Exp Cell Res,2015,330(2):423-428.

        [16] Matamala N,Vargas MT,González-Cámpora R,et al. MicroRNA deregulation in triple negative breast cancer reveals a role of miR-498 in regulating BRCA1 expression[J]. Oncotarget,2016,7(15):20068-20079.

        MicroRNAprofilingofgastriccancerSGC-7901aftermitomycinCtreatment

        XIE Juan,TANG Xia,LI Guoqing,et al

        (DepartmentofDiagnostics,MedicalCollegeofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

        ObjectiveTo evaluate the mitomycin C (MMC) treatment on the miRNA expression profile in gastric cancer cells,and provide the theoretical evidences for MMC treatment on gastric cancer.MethodsThe effects and optimum concentration of MMC were evaluated in the cultured SGC-7901 cells by MMT. The miRNA microarray technique was used for the exploration of miRNA profile of SGC-7901 cells after MMC treatment and the different expression of candidate miRNA was further confirmed by qRT-PCR.ResultsThe inhibition rate of SGC-7901 cells was negatively correlated with the MMC concentration. The 60 miRNAs have changed expression in SGC-7901 cells 48 hours after MMC treatment. Among them,11 miRNAs included miR-498 and miR-1247 were up-regulated,and miR-205*and miR-3924 were down-regulated. Some abnormal expression changes recovered after MMC treatment.ConclusionMMC can regulate the expression of 60 miRNAs including miR-498 in gastric cancer cells.

        mitomycin; miRNA expression profile; gastric cancer; SGC-7901

        10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.005

        2016-10-28;

        2016-02-10

        湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(16C1401)資助,湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目(13B098)資助.

        *通訊作者,E-mail:317249741@qq.com.

        R735.2

        A

        蔣湘蓮)

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