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(廣州醫(yī)科大學附屬惠州醫(yī)學 惠州市第三人民醫(yī)院病理科，廣東 惠州 516002)

·基礎醫(yī)學·

p-STAT3及Twist在乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)中的表達及相關性分析

譚秋芬，胡惠軍，范曉娟，胡雪梅，鄒偉文，林小龍*

(廣州醫(yī)科大學附屬惠州醫(yī)學 惠州市第三人民醫(yī)院病理科，廣東 惠州 516002)

目的探討磷酸化信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)和Twist在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達情況及其臨床意義。方法利用免疫組織化學染色的方法檢測60例乳腺浸潤性導管癌組織及其相應癌旁正常組織中p-STAT3和Twist蛋白表達，分析兩者的相關性以及兩者的表達率與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征的關系。結果p-STAT3和Twist蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的陽性率明顯高于癌旁正常組織的陽性率。p-STAT3和Twist蛋白在乳腺癌晚期、淋巴結及脈管及組織學分級為Ⅲ-Ⅳ級的患者中陽性率明顯增高，但兩者在不同年齡及腫瘤大小不同的患者中陽性表達率不變。在乳腺浸潤性導管癌組織中，p-STAT3和Twist蛋白的表達呈正相關性。結論p-STAT3與Twist蛋白的表達在乳腺浸潤性導管癌中具有明顯的相關性，且兩者的陽性率在淋巴及脈管轉移、分化較差及晚期的患者中明顯升高。這些結果表明磷酸化的STAT3蛋白可能通過上調Twist表達促進乳腺浸潤性導管癌的侵襲和轉移。

p-STAT3； Twist； 乳腺浸潤性導管癌； 免疫組織化學

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率逐年上升并呈現(xiàn)出年輕化的趨勢。造成乳腺癌死亡的原因很多，其中最主要的原因是腫瘤細胞的侵襲及轉移[1]。研究發(fā)現(xiàn)，核轉錄因子STAT3 的磷酸化,可以介導多種信號分子,調控腫瘤細胞增殖及凋亡影響腫瘤進展[2]，但其作用機制尚不明確。而Twist作為重要的轉錄因子，其能夠誘導腫瘤細胞的上皮—間質轉化，促進腫瘤細胞的增殖和分化， 其過度表達與多種惡性腫瘤的轉移和預后不良有關[3]。然而目前在乳腺浸潤性導管癌的研究中尚未見關于p-STAT3及Twist相關性的報道。因此，本文采取免疫組化的方法對乳腺浸潤性導管癌中p-STAT3及Twist的表達進行檢測，同時分析兩者關系，以及兩者與乳腺浸潤性導管癌各臨床病理因素間的關系，從而探討兩者在乳腺癌癌變過程中的意義，進一步明確乳腺癌進展的可能機制，為乳腺癌治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1標本收集選擇本院病理科2012 年1 月～2015年12 月的手術切除乳腺浸潤性導管癌患者的標本制成的蠟塊60例及20例癌旁組織作為對照。所有的標本用10 %中性甲醛進行固定并且用石蠟包埋,HE 切片則由副高以上的病理醫(yī)生確診。所有患者病檢前均未進行任何治療，均有完整的臨床及病理資料。乳腺癌病理學分型及組織學分級參照2003年乳腺癌WHO 分類和分級標準[4]。

1.2實驗試劑鼠抗人Twist 單克隆抗體( H-81，SC15393 )及兔抗人STAT3 多克隆抗體均購于Santa Cruz 公司，SP試劑盒及DAB顯色劑均購自武漢博士德生物技術開發(fā)有限公司。

1.3免疫組織化學染色所有標本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，以4 μm 厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟和水化后，免疫組織化學參照SP試劑盒說明書操作步驟進行，DAB 顯色，蘇木素復染，封片。免疫組化結果的判斷：p-STAT3 蛋白的陽性表達定位于胞核；而Twist蛋白陽性表達則定位于細胞漿。其中每張切片細胞的陽性強度按：無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記0，1，2，3 分；著色面積則通過：無著色、著色<1/3，著色1/3～2/3，著色>2/3 分別記0，1，2，3 分。隨后根據(jù)這兩項的得分之和對結果進行判定：<3 分為陰性，≥3 分則為陽性。每張切片均選取代表性的區(qū)域在200 倍視野下進行計數(shù)，計數(shù)8個視野，取平均值進行分析[5-6]。

1.4統(tǒng)計分析用SPSS10.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計， 其中計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗及Spearman相關分析對數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1乳腺浸潤性導管癌中p-STAT3及Twist蛋白的表達p-STAT3 蛋白的陽性表達定位于細胞核，38例(63.3%)乳腺浸潤性導管癌的病例呈陽性表達，而癌旁正常組織中只有4例(20%)弱表達(P<0.01)。Twist蛋白的陽性表達定位于胞漿，浸潤性導管癌組織中44 例(73.3%)Twist表達陽性，而癌旁組織中只有5例(25%)弱表達(圖1、表1)。

圖1 p-STAT3及Twist蛋白在乳腺浸潤性導管癌及癌旁正常組織中的表達(免疫組織化學染色SP法,×200)A:癌旁組織中p-STAT3表達;B:癌組織中p-STAT3表達;C:癌旁組織中Twist表達;D:癌組織中Twist表達

組別np-STAT3陽性陰性Twist陽性陰性乳腺癌組織6038(63.3)22(36.7)44(73.3)16(26.7)癌旁組織204(20.0)16(80.0)5(25.0)15(75.0)χ214.12816.423P<0.01<0.01

2.2 p-STAT3蛋白與Twist蛋白的相關性分析表2結果提示p-STAT3 表達與Twist蛋白呈正相關(均P<0.001)。

表2 p-STAT3蛋白與Twist蛋白在乳腺浸潤性導管癌的相關性分析(例)

2.3不同臨床病理特征的乳腺浸潤性導管癌患者中p-STAT3及Twist蛋白陽性表達率的比較由表2及表3可知，p-STAT3 及Twist蛋白表達率在組織分級為Ⅲ級、發(fā)生淋巴結轉移及脈管轉移、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者中表達率均明顯升高(均P<0.05)；而在不同年齡及腫瘤大小不同的患者中表達率變化不大(P>0.05)。見表3、表4。

表3 不同臨床病理特征的乳腺浸潤性導管癌(非特殊型)患者中p-STAT3蛋白陽性表達率的比較(例，%)

3 討 論

信號傳導及轉錄活化子信號通路異?；罨c腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。STAT3 是信號傳導與轉錄激活因子家族的重要成員之一。STAT3的活化受其上游的Janus 激酶(JAK)的調控，活化的JAK 可以通過募集胞漿中的單體STAT3 分子，促進STAT3 的酪氨酸磷酸化，從而使STAT3 形成同源或異源性的二聚體，進而制其從受體上脫離，進入胞核與相應靶基因的STAT3位點結合，調節(jié)靶基因轉錄[7]。STAT3 信號活化能通過誘導腫瘤血管生成及細胞外基質降解參與腫瘤的侵襲轉移[8]。本課題組發(fā)現(xiàn)p-STAT3 在乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)中表達明顯高于癌旁組織。且進一步分析其與臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)p-STAT3的表達率在發(fā)生淋巴結及脈管轉移、臨床分期Ⅲ及Ⅳ期、組織學分級Ⅲ級的浸潤性導管癌患者中明顯升高(P<0.05)，提示STAT3的活化可能參與調控乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)的進展。

表4 不同臨床病理特征的乳腺浸潤性導管癌(非特殊型)患者中Twist蛋白陽性表達率的比較(例，%)

Twist作為腫瘤調控的重要靶標，能通過干預P53 腫瘤抑制基因通路，誘導上皮—間質轉變抑制細胞分化等調節(jié)腫瘤的侵襲和轉移[9-10]。國外的研究顯示，Twist可作用于P53 依賴性和非依賴性通路以及NF-κB 通路調控細胞凋亡，促進腫瘤的形成，并且調控E-box 啟動子的表達，誘導上皮間質轉化的發(fā)生，抑制E-cadherin的轉錄，降低腫瘤細胞的黏附性，促進上皮來源腫瘤(如前列腺癌、乳腺癌和消化道腫瘤等)的發(fā)生及轉移[11-14]。此外，Twist的上調可增強血管內皮生長因子的表達，促進血管生成，加快腫瘤侵襲及轉移[15]。而Yang 等[16]在裸鼠的乳腺癌模型中研究提示，在Twist 蛋白表達越高的乳腺癌細胞越容易發(fā)生轉移。本研究中Twist 陽性表達率在乳腺浸潤性導管癌與癌旁組織間的陽性表達存在有顯著差異，提示Twist 可能在乳腺癌的進展中發(fā)揮了重要的作用。為進一步探討Twist 表達與乳腺癌進展的關系，分析了Twist 表達與不同臨床病理特征的關系，結果發(fā)現(xiàn)，乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)的組織中Twist 的陽性表達率在發(fā)生脈管浸潤、分化程度較差及晚期的患者中表達率明顯升高，這些結果與蔡鳳林[17]和王偉[18]等課題組的研究相一致，表明Twist參與乳腺浸潤性癌的侵襲及轉移。

在Twist的基因中存在STAT3結合的位點，提示活化的STAT3可能通過調節(jié)Twist的表達影響腫瘤細胞發(fā)生EMT，促進腫瘤的侵襲及轉移[19]。因此，本課題組對兩者在乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)中的相關性進行分析。結果顯示，在乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)中，p-STAT3的表達與Twist表達成正相關，提示STAT3的活化可能通過調控Twist表達，影響乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)的侵襲及轉移。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌組織中表皮生長因子(EGF)或白介素-6(IL-6)可以激活JAK-STAT3 通路誘導卵巢癌細胞EMT促進癌細胞侵襲轉移， 而這種作用能被JAK-STAT3 通路抑制劑AG490 所逆轉[20]。而相同的結果在結腸癌的研究中也被證實[21]。然而STAT3 在乳腺浸潤性導管癌上皮間質轉化的作用，尚未見研究報道。此外，Twist作為調節(jié)EMT的轉錄因子，其是否受到活化的STAT3的調控，需要進一步深入研究。

綜上所述，p-STAT3 與Twist蛋白的表達在乳腺浸潤性導管癌中具有明顯的相關性，且兩者的陽性率在淋巴及脈管轉移、分化較差及晚期的患者中明顯升高。據(jù)此，課題組推測活化的STAT3 可能通過上調Twist蛋白介導EMT 促進乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)的侵襲轉移，STAT3/Twist/EMT可能形成信號軸在乳腺浸潤性導管癌(非特殊類型)的進展和轉移中起重要作用，而這需要在將來的研究中進一步證明。

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Theexpressionsandcorrelationofp-STAT3andtwistinnospecialtypeofinvasiveductalcarcinomaofbreast

TAN Qiufen,HU Huijun,FAN Xiaojuan,et al

(DepartmentofPathology，AffliatedHuizhouHospital,theThirdPeople’sHospitalofHuizhou，GuangzhouMedicalUniversity，Huizhou516002，Guangdong，China)

ObjectiveTo study the expressions of p-STAT3 and Twist in the no special type of invasive ductal carcinoma (IDC) of breast and to analyze its clinical significance.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expressions of p-STAT3 and Twist in 60 cases of IDC of breast and corresponding tumor-adjacent normal breast tissues.Statistical analysis was carried out to analyze the relationship between p-STAT3 and Twist expression,and the relationship of these expressions to clinicopathologic characteristics.ResultsThe positive rates of p-STAT3 and Twist protein expressions in the IDC of breast tissues were significantly higher than those in the corresponding tumor-adjacent normal breast tissue.The positive rates of p-STAT3 and Twist protein were significantly higher in lymph node metastasis,histological grade (Ⅲ) and vascular invasion.P-STAT3 and Twist protein had no change in different age and tumordiameter.The positive rate of p-STAT3 expression was positively correlated with the positive rate of Twist expression.ConclusionsThe expression of p-STAT3 and Twist protein was significantly correlated with invasive ductal carcinoma of breast,and the positive rate of p-STAT3 and Twist was significantly higher in lymphatic and vascular metastasis,poorly differentiated and advanced stage.These results indicate that p-STAT3 may play an important role in induced invasion and metastasis in no special type of IDC via regulation of the expression of Twist.

phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3; Twist; invasive ductal carcinoma of breast; immunohistochemistry

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.002

2016-11-09；

2017-02-02

國家自然基金(編號81600342)；廣東省醫(yī)學科研基金(編號A2015620).

*通訊作者，E-mail:xiaolong880101@126.com.

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蔣湘蓮)