劉雪峰，李文放，林兆奮

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

·論著·

CRISPLD2蛋白對內(nèi)毒素-誘導(dǎo)急性呼吸窘迫綜合征小鼠炎性因子表達(dá)的影響

劉雪峰，李文放，林兆奮

目的探討CRISPLD2蛋白對內(nèi)毒素-誘導(dǎo)急性呼吸窘迫綜合征(LPS-ARDS)小鼠體內(nèi)炎性因子表達(dá)的影響。方法采用數(shù)字表法將40只雄性昆明小鼠隨機(jī)分5組：對照組(A組)，氣道內(nèi)滴入0.1 mg內(nèi)毒素(LPS)；rCRISPLD2蛋白1組(B組)、rCRISPLD2蛋白2組(C組)，小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白，6 h后氣道內(nèi)滴入0.1mg LPS；rCRISPLD2蛋白3組(D組)、rCRISPLD2蛋白4組(E組)，予小鼠氣道內(nèi)滴入0.1mg LPS，6 h后予小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白。每組小鼠在LPS氣道滴入后第12 h收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后計數(shù)沉淀中性粒細(xì)胞，測量上清液及血標(biāo)本中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及IL-6。結(jié)果B、C組BALF中的中性粒細(xì)胞計數(shù)(0.31±0.07、0.76±0.08)ng/L、TNF-α(8.88±17.37、134.63±24.44)ng/L、IL-1β(48.63±15.61、99.75±12.30)ng/L、IL-6(80.75±21.03、140.12±29.29)ng/L均明顯低于A、D、E組(1.64±0.10、1.73±0.13、1.65±0.08)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B組以上檢測值均明顯低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CRISPLD2蛋白可下調(diào)LPS所誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)水平，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。

CRISPLD2蛋白；內(nèi)毒素；急性呼吸窘迫綜合征；炎癥因子

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由多種肺內(nèi)外因素所誘發(fā)的以頑固性低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)的一組臨床綜合征[1]，肺泡上皮細(xì)胞以及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的彌漫性損傷是其病理特征。ARDS起病急驟、進(jìn)展快，臨床死亡率高，至今仍無特效治療。目前認(rèn)為失控的炎癥反應(yīng)是其發(fā)生/發(fā)展的根本原因。

CRISPLD2蛋白是一個高度保守的半胱氨酸富集的血濃度較高的分泌型蛋白，人類和小鼠的肺臟、小腸以及各種免疫細(xì)胞都可以表達(dá)CRISPLD2蛋白[2-3]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)提升小鼠血清CRISPLD2蛋白濃度，可對內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的ARDS小鼠起到保護(hù)作用，減輕模型小鼠死亡率[4]。本研究擬通過觀察CRISPLD2蛋白對LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺部炎癥因子的影響，進(jìn)一步探討CRISPLD2蛋白對LPS-ARDS小鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性昆明小鼠40只，體質(zhì)量(20±2)g，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)前給予3 d適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

LPS購自Sigma公司。CRISPLD2蛋白的穩(wěn)定表達(dá)株(CHO-A5)購自上海南方基因公司(中國)，通過培養(yǎng)擴(kuò)增蛋白表達(dá)株，對上清液進(jìn)行離心提純獲得CRISPLD2蛋白。其余試劑購自上海晶抗生物制品有限公司。

1.3 分組及實(shí)施

1.3.1 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為以下5組(n=8)：對照組(A組)，氣道內(nèi)滴入0.1 mg LPS；rCRISPLD2蛋白1組(B組)、rCRISPLD2蛋白2組(C組)，小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白，6 h后氣道內(nèi)滴入0.1 mg LPS；rCRISPLD2蛋白3組(D組)、rCRISPLD2蛋白4組(E組)，予小鼠氣道內(nèi)滴入0.1 mg LPS，6 h后予小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白。

1.3.2 標(biāo)本留取及指標(biāo)測定 各組小鼠在氣道滴入LPS后第12小時以1%戊巴比妥鈉麻醉，斷尾留取血；收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。取0.5 ml BALF檢測中性粒細(xì)胞計數(shù)；剩余BALF以1 500 r/min(r=8 cm)離心10 min，抽取上清液；通過ELISA法檢測BALF上清液及血清中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及IL-6。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

檢測數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。2組之間的比較采用t檢驗(yàn)；多組之間采用方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRISPLD2蛋白對BALF中性粒細(xì)胞計數(shù)的影響

各組實(shí)驗(yàn)小鼠LPS氣道滴入第12小時測量留取肺泡灌洗液，與A、D、E組相比，B、C組BALF中的中性粒細(xì)胞計數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且B組中性粒細(xì)胞較C組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A、D、E組間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠BALF中所含中性粒細(xì)胞(x±s)

注：與A、D、E組比較aP<0.05；與C組比較bP<0.05。BALF：支氣管肺泡灌洗液。A組：小鼠氣道滴入0.1 mg內(nèi)毒素，B、C組：小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白，6 h后氣道內(nèi)滴入0.1 mg內(nèi)毒素，D、E組：小鼠氣道內(nèi)滴入0.1 mg內(nèi)毒素，6 h后予小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白

2.2 CRISPLD2蛋白對BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)量的影響

小鼠BALF檢測結(jié)果表明，與A、D、E組相比，B、C組的TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且與C組相比，B組3項(xiàng)檢測值更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而A、D、E組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 CRISPLD2蛋白對血清中TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)量的影響

小鼠血清檢測結(jié)果表明，與A、D、E組相比，B、C組的TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且B組檢測值均低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而A、D、E組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

ARDS是臨床上常見的一種危重癥，其本質(zhì)是全身炎癥反應(yīng)綜合征在肺部的體現(xiàn)。巨噬細(xì)胞、中

表2 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6的表達(dá)量(ng/L，x±s，每組n=8)

注：與A、D、E組比較aP<0.05；與C組比較bP<0.05。BALF：支氣管肺泡灌洗液，TNF-α：腫瘤壞死因子-α，IL-1β：白細(xì)胞介素-1β。A組：小鼠氣道滴入0.1 mg內(nèi)毒素，B、C組：小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白，6 h后氣道內(nèi)滴入0.1 mg內(nèi)毒素，D、E組：小鼠氣道內(nèi)滴入0.1 mg內(nèi)毒素，6 h后予小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白

表3 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6的表達(dá)量(ng/L，x±s，每組n=8)

注：與A、D、E組比較aP<0.05；與C組比較bP<0.05。BALF：支氣管肺泡灌洗液，TNF-α：腫瘤壞死因子-α，IL-1β：白細(xì)胞介素-1β。A組：小鼠氣道滴入0.1 mg內(nèi)毒素，B、C組：小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白，6 h后氣道內(nèi)滴入0.1 mg內(nèi)毒素，D、E組：小鼠氣道內(nèi)滴入0.1 mg內(nèi)毒素，6 h后予小鼠尾靜脈分別注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白

性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的肺組織浸潤聚集以及促炎因子的大量釋放是導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管通透性增加以及肺泡表面活性物質(zhì)減少的主要及關(guān)鍵因素[5]。LPS通過激活TLR4受體通路引起TNF-α、IL-1β及IL-6等促炎因子釋放[6-7]；TNF-α等因子可刺激其他炎癥因子的進(jìn)一步釋放，從而形成瀑布效應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失衡，又可誘發(fā)中性粒等免疫細(xì)胞在肺間質(zhì)組織的浸潤，加重炎癥反應(yīng)和組織破壞[8]。

本實(shí)驗(yàn)在LPS氣道滴入誘導(dǎo)ARDS小鼠模型基礎(chǔ)[9]上，通過調(diào)整rCRISPLD2蛋白注射劑量及時間點(diǎn)來研究此蛋白對小鼠血清及BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6等促炎因子的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在LPS造模前給予rCRISPLD2可降低BALF及血清中的TNF-α、IL-1β及IL-6的表達(dá)，減少BALF中的中性粒細(xì)胞聚集水平，并且rCRISPLD2蛋白的使用劑量與炎癥因子及中性粒細(xì)胞的檢測值呈負(fù)相關(guān)；同時發(fā)現(xiàn)LPS造模6 h后再給予小鼠rCRISPLD2蛋白未見到明顯的抗炎作用，各種檢測值與對照組相比無改善。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先提升小鼠血CRISPLD2蛋白濃度可以起到保護(hù)LPS-ARDS小鼠，降低5 d死亡率的作用[4]，與本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相一致，并提示rCRISPLD2蛋白減輕LPS誘導(dǎo)的ARDS與抑制TNF-α等炎癥因子的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，預(yù)先予rCRISPLD2蛋白處理，可降低LPS所誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)水平，改善模型小鼠預(yù)后，并且有一定的量效關(guān)系；而LPS充分誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥反應(yīng)后再給予rCRISPLD2蛋白則無此作用。說明CRISPLD2蛋白可阻斷LPS，激活TLR4受體途徑，從而起到對LPS-ARDS小鼠的保護(hù)作用。

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Effect of CRISPLD2 on the expression of inflammatory cytokine in LPS-induced ARDS mice

LiuXuefeng,LiWenfang,LinZhaofen

(DepartmentofCriticalCareMedicine,ChangzhengHospital,Shanghai200003,China)

ObjectiveTo investigate the effect of CRISPLD2 protein on the expression of inflammatory cytokine in LPS-induced acute respiratory distress syndromes (ARDSs) mice.MethodsForty male Kunming mice were randomly divided into 5 groups; the control group (group A), which was given 0.1mg LPS via the intratracheal instillation; the rCRISPLD2 group 1 (group B) and the rCRISPLD2 group 2 (group C), which were respectively treated with 1mg and 0.4mg rCRISPLD2 by tail vein, and after 6 hours rCRISPLD2 was injected intratracheally; the rCRISPLD2 group 3 (group D) and the rCRISPLD2 group 4 (group E), which were first given 0.1mg LPS intratracheally and then were injected with 1mg and 0.4mg rCRISPLD2 by tail vein. At hour 12 after intratracheal injection of LPS in the mice of all the groups, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected. After centrifugation, the number of neutrophils was counted, and the levels of TNF-α, IL-1βand IL-6 were detected in supernatant fluid and blood samples.ResultsThe number of neutrophils(0.31±0.07、0.76±0.08), TNF-α(8.88±17.37、134.63±24.44), IL-1β(48.63±15.61, 99.75±12.30)and IL-6 (80.75±21.03,140.12±29.29)in serum and BALF in groups B and C were all significantly lower than those of group A, D and E, and statistical significance could be noted, when comparisons were made between these groups (P<0.05). The detected data of group B were obviously lower than those of group C, also with statistical significance (P<0.05).ConclusionrCRISPLD2 could down-regulate the expression levels of LPS-induced inflammatory factors, and dosage dependence could be noted to a certain extent.

rCRISPLD2; Lipopolysaecharide; Acute respiratory distress syndrome; Inflammatory cytokine

R576

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.06.010

200003 上海，上海長征醫(yī)院急救科

林兆奮，電子信箱：linzfczjj@163.com

2016-07-08)

(本文編輯：張陣陣)