王華清

(日照市皮膚病防治所，山東 日照 276800)

黑素細(xì)胞自噬與老年白癜風(fēng)患者臨床類型的關(guān)系

王華清

(日照市皮膚病防治所，山東 日照 276800)

目的探討黑素細(xì)胞自噬和老年白癜風(fēng)患者臨床類型的關(guān)系。方法選取88例老年白癜風(fēng)患者，包括41例節(jié)段型白癜風(fēng)患者(節(jié)段型組)和47例泛發(fā)型白癜風(fēng)患者(泛發(fā)型組)，同時(shí)選取健康體檢的健康老年志愿者88例為對(duì)照組。比較節(jié)段型組和泛發(fā)型組患者的臨床特征，比較節(jié)段型組和泛發(fā)型組白斑區(qū)周圍正常膚色部位皮膚和對(duì)照組任意部位正常膚色皮膚的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)前后自噬體數(shù)量和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅱ、小眼球畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TRPs)相對(duì)表達(dá)情況。結(jié)果節(jié)段型組和泛發(fā)型組發(fā)病年齡、家族史、伴有暈痣和復(fù)發(fā)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；節(jié)段型組同形反應(yīng)少于泛發(fā)型組(P<0.05)。誘導(dǎo)前節(jié)段型組和對(duì)照組可見自噬點(diǎn)數(shù)目顯著多于泛發(fā)型組(P<0.05)；誘導(dǎo)后3組自噬點(diǎn)數(shù)目較誘導(dǎo)前均顯著增多，且泛發(fā)型組顯著多于節(jié)段型組和對(duì)照組，對(duì)照組顯著多于節(jié)段型組(P<0.05)。誘導(dǎo)前泛發(fā)型組MITF顯著高于節(jié)段型組和泛發(fā)型組，LC3Ⅱ、TYR、TYRP1和TYRP2均顯著低于節(jié)段型組和泛發(fā)型組；誘導(dǎo)后3組MITF、LC3Ⅱ、TYR、TYRP1較誘導(dǎo)前均顯著升高，且泛發(fā)型組MITF、TYR、TYRP1高于節(jié)段型組和泛發(fā)型組(P<0.05)。結(jié)論白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞存在自噬現(xiàn)象，對(duì)功能性分子表達(dá)產(chǎn)生影響，且泛發(fā)型白癜風(fēng)黑素細(xì)胞自噬現(xiàn)象和對(duì)功能性分子表達(dá)的影響較大。

節(jié)段型；泛發(fā)型；白癜風(fēng)；黑素細(xì)胞自噬

白癜風(fēng)根據(jù)面積和皮損部位可分為泛發(fā)型、節(jié)段型和局限型〔1〕。目前白癜風(fēng)頑固難治，病程長(zhǎng)，存在治療抵抗〔2〕。白癜風(fēng)可發(fā)于任何年齡，但臨床上目前對(duì)其病因并未明確。已有研究指出〔3〕，自身免疫、遺傳、壓力、神經(jīng)假說、自身細(xì)胞毒素等均可能誘發(fā)白癜風(fēng)，白癜風(fēng)的病理特點(diǎn)為皮損處黑素消失，毛囊黑素細(xì)胞、表皮基底層黑素細(xì)胞缺失或喪失生成功能。自噬是細(xì)胞內(nèi)的“自食”現(xiàn)象，通過溶酶體和自噬內(nèi)涵體的共同作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)需要降解的細(xì)胞器進(jìn)行降解，在細(xì)胞低于外界能量缺乏、饑餓、應(yīng)激等不良環(huán)境時(shí)發(fā)揮重要作用，但自噬不足或多度均可能導(dǎo)致機(jī)體病變。有學(xué)者〔4〕認(rèn)為黑素細(xì)胞自噬缺失與白癜風(fēng)的發(fā)病有密切相關(guān)性。本研究旨在探討黑素細(xì)胞自噬與老年白癜風(fēng)患者臨床類型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2017年1月日照市皮膚病防治所收治的88例老年白癜風(fēng)患者。節(jié)段型組41例中男22例，女19例；年齡65～87〔平均(74.27±7.43)〕歲；病程2～36個(gè)月，平均(23.11±7.49)個(gè)月。泛發(fā)型組47例中男26例，女21例，年齡66～88〔平均(73.17±8.26)〕歲，病程2～36個(gè)月，平均(22.44±8.43)個(gè)月。對(duì)照組88例志愿者中男56例，女32例，年齡65～89〔平均(75.28±9.16)〕歲。3組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床診斷為進(jìn)展期白癜風(fēng)；②年齡≥65歲；③治療前3個(gè)月內(nèi)未接受免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、紫外線、光敏劑等治療；④自愿參加本項(xiàng)研究并已經(jīng)簽署知情書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并橋本甲狀腺炎、斑禿等感染性或自身免疫性疾病者；②合并嚴(yán)重的心、肝、腎、肺功能障礙者；③中途退出研究者。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)黑素細(xì)胞 將分離的表皮片放入無菌D-Hank液中漂洗2次，37℃下以0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)和0.25%胰蛋白酶孵育10 min，在10%含血清的F12培養(yǎng)基內(nèi)加入細(xì)胞懸液并吹打5次，1 000 r/min、半徑5.5 cm離心5 min。用黑素細(xì)胞Hu16選擇性培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105個(gè)/ml接種在37℃下的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后加入(Ceneticin)，將成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞除去，每隔1 d更換1次，當(dāng)黑素細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)以0.05%胰酶-EDTA消化黑素細(xì)胞，離心后置于F12培養(yǎng)基內(nèi)待測(cè)。

1.2.2觀察黑素細(xì)胞結(jié)構(gòu) 使用透射電子顯微鏡對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黑素細(xì)胞進(jìn)行觀察，將細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml的黑素細(xì)胞接種在6孔板上，細(xì)胞貼壁后，加入30 nmol/L的雷帕霉素，培養(yǎng)48 h后置于離心管內(nèi)，固定，染色進(jìn)行觀察，拍照和記錄。

1.2.3觀察自噬強(qiáng)度 培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期黑素細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)/ml后使用Ad-LC3-GFP-mRFP腺病毒進(jìn)行2 h感染，更換培養(yǎng)液對(duì)其進(jìn)行36 h培養(yǎng)。加入30 nmol/L的雷帕霉素，培養(yǎng)48 h，使用雙熒光微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)細(xì)胞自噬腺病毒報(bào)告系統(tǒng)和熒光共聚焦顯微鏡對(duì)自噬溶酶體和自噬體數(shù)量進(jìn)行觀察和計(jì)算，探究細(xì)胞中自噬流(Autophagy Flux)強(qiáng)度。

1.2.4免疫印跡檢測(cè) 加入30 nmol/L的雷帕霉素，培養(yǎng)48 h后常規(guī)提取蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將其轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜使用含5%脫脂牛奶的Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉，加入兔抗LC3Ⅱ、兔抗小眼球畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)、兔抗酪氨酸酶相關(guān)蛋白(TYR)、兔抗TYRP1、兔抗TYRP2和鼠抗β-actin單克隆體進(jìn)行孵育，通過免疫反應(yīng)條帶讀取蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t、χ2檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1節(jié)段型組和泛發(fā)型組患者臨床特征比較 節(jié)段型組和泛發(fā)型組發(fā)病年齡、家族史、伴有暈痣和復(fù)發(fā)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；節(jié)段型組同形反應(yīng)顯著少于泛發(fā)型組(P<0.05)。見表1。

2.2誘導(dǎo)前后3組自噬點(diǎn)數(shù)目比較 誘導(dǎo)前節(jié)段型組〔(8.68±4.33)個(gè)〕和對(duì)照組〔(10.21±4.33)個(gè)〕可見自噬點(diǎn)數(shù)目，顯著多于泛發(fā)型組〔(1.07±0.57)個(gè)〕(P<0.05)；誘導(dǎo)后3組均顯著增多，且泛發(fā)型組〔(33.77±9.49)個(gè)〕多于節(jié)段型組〔(18.13±5.38)個(gè)〕和對(duì)照組〔(26.89±7.56)個(gè)〕，對(duì)照組顯著多于節(jié)段組(P<0.05)。

2.3誘導(dǎo)前后3組LC3Ⅱ、MITF、TRPs相對(duì)表達(dá)比較 誘導(dǎo)前泛發(fā)型組MITF顯著高于節(jié)段型組和泛發(fā)型組，LC3Ⅱ、TYR、TYRP1和TYRP2顯著低于節(jié)段型組和泛發(fā)型組；誘導(dǎo)后3組MITF、LC3Ⅱ、TYR、TYRP1顯著升高，且泛發(fā)型組MITF、TYR、TYRP1顯著高于節(jié)段型組和泛發(fā)型組(P<0.05)。見表2。

表1 節(jié)段型組和泛發(fā)型組臨床特征比較〔n(%)〕

表2 誘導(dǎo)前后3組MITF、LC3Ⅱ、TRPs相對(duì)表達(dá)比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與節(jié)段型組比較：2)P<0.05；與誘導(dǎo)前比較：3)P<0.05

3 討 論

目前臨床上對(duì)于白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制并未明確，但研究認(rèn)為白癜風(fēng)皮損中黑素細(xì)胞的喪失可能是導(dǎo)致白斑的主要原因，且細(xì)胞免疫反應(yīng)和自身抗體反應(yīng)破壞黑素細(xì)胞〔5，6〕。黑素生成是需要多種信號(hào)通路相互作用的過程，約150種基因與黑素生成過程有關(guān)，涉及蛋白激酶A通路、蛋白激酶C通路、MAPK等通路。自噬是細(xì)胞內(nèi)溶酶體和自噬體共同作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行降解的過程，研究指出〔7〕自噬相關(guān)基因紫外線抵抗相關(guān)基因與尋常型白癜風(fēng)發(fā)病有密切關(guān)系。

黑素小體是一種溶酶體相關(guān)細(xì)胞器，對(duì)黑素細(xì)胞的黑素合成、黑素儲(chǔ)存和黑素轉(zhuǎn)運(yùn)均有較重要作用。研究指出〔8〕，自噬對(duì)黑素小體的生成過程有關(guān)鍵作用。LC3Ⅱ是自噬特異性標(biāo)志物之一，與自噬過程中調(diào)控黑素正常生成和清除異常黑素小體等過程有密切相關(guān)性，本研究結(jié)果說明泛發(fā)型白癜風(fēng)患者體內(nèi)黑素細(xì)胞自噬較易被誘導(dǎo)。MITF是黑素代謝過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，在皮膚生成黑素的過程中，對(duì)TYR、TYRP1和TYRP2等因子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，并調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的發(fā)育、分化等〔9〕。自噬過程通過對(duì)黑素小體的降解過程和生成過程進(jìn)行調(diào)節(jié)進(jìn)而控制黑素的生成，此過程中MITF及其轉(zhuǎn)錄對(duì)網(wǎng)絡(luò)功能異常進(jìn)行調(diào)節(jié)，白癜風(fēng)黑素細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)微小RNA25過表達(dá)產(chǎn)生影響進(jìn)而減少M(fèi)ITF轉(zhuǎn)錄，因而MITF與黑素細(xì)胞自噬過程有密切相關(guān)性〔10〕。本研究結(jié)果說明，泛發(fā)型白癜風(fēng)患者體內(nèi)自噬點(diǎn)數(shù)目較少，但經(jīng)誘導(dǎo)后自噬點(diǎn)數(shù)目顯著增多，體現(xiàn)了泛發(fā)型白癜風(fēng)患者對(duì)自噬誘導(dǎo)較敏感。同時(shí)泛發(fā)型白癜風(fēng)患者同形反應(yīng)少于節(jié)段型白癜風(fēng)患者，提示在臨床治療中，對(duì)于節(jié)段型白癜風(fēng)患者來說，未發(fā)生病變的皮膚色素脫失斑出現(xiàn)的可能性較小，應(yīng)避免因外傷加重病情，避免誘發(fā)新發(fā)皮損，且不適合進(jìn)行自體表皮移植手術(shù)〔11〕。

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R758.4+1

A

1005-9202(2017)23-5912-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.076

王華清(1970-)，女，主治醫(yī)師，主要從事皮膚疾病研究。

〔2017-10-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)